CN112143759B - 一种提高红曲菌菌丝体中橙色素得率的方法及应用 - Google Patents

一种提高红曲菌菌丝体中橙色素得率的方法及应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种提高红曲菌菌丝体中橙色素得率的方法及应用，包括：步骤1、色素原液的制备：将红曲菌经液态发酵后，过滤收集菌丝体并清洗，用pH＝2‑3，浓度为60‑100％的乙醇溶液高速匀浆，过滤得到色素原液；步骤2、橙色素纯化：向色素原液中加入pH＝2‑3的酸性水溶液，混匀后于‑20℃‑10℃下静置0.5‑24小时，然后离心，弃上清得到橙色素晶体。本发明通过向色素原液中加入pH＝2‑3的酸性水溶液，调节体系中乙醇的浓度，使橙色素结晶分离出来，可在提高橙色素纯度的前提下，最大程度提高橙色素的得率，其中纯度最高可达92％，得率最高可达90％。并且该方法操作简单易实施，成本低廉且得率高，减少了菌丝体橙色素制备过程中的损失和浪费，适合工业化大规模制备橙色素。

Description

一种提高红曲菌菌丝体中橙色素得率的方法及应用
技术领域
本发明属于红曲色素的分离纯化技术领域，具体涉及一种提高红曲菌菌丝体中橙色素得率的方法及应用。
背景技术
红曲色素是一种天然色素，有三种色调：橙色、黄色和红色，其中橙色色调的红曲色素被称为红曲橙色素。红曲橙色素色泽鲜艳，安全性好，是一种天然着色剂，可用于食品工业。此外，红曲橙色素还具有药用价值，具有抑菌效果，可抑制革兰氏阳性菌和大肠杆菌；且其分子结构中含有活波的羰基键，容易与氨基反应，可以用于治疗胺血症；口服红曲橙色素还能降血脂，可显著降低血清胆固醇和甘油三酯水平，抑制脂肪肝积累和脂肪变性，同时能够促进粪便胆固醇、甘油三酯和胆汁酸的排泄量，从而改善体内脂代谢紊乱。
因液态发酵具有周期短、产量高、杂质少，质量稳定等优点，液态发酵逐渐成为了工业上生产红曲色素的一种重要手段。液态发酵产生的红曲色素主要集中在菌丝体中(约70-80％)，因此从菌丝体中提取红曲色素成为了液态发酵制备红曲色素产品的主要手段。目前国内外市场上尚未见到红曲橙色素产品，主要原因在于红曲橙色素与黄色素的分子结构相似，从红曲色素混合物中分离纯化橙色素的难度大，成本高，得率低，规模化制备的方法少。
目前报道的红曲橙色素分离纯化方法主要涉及两类：色谱分离法和结晶分离法。色谱分离法一般用于实验室制备红曲橙色素，主要包括薄层层析法、柱层析法、高效液相色谱法、高速逆流色谱法。色谱法的缺陷在于载样量小，耗时长，劳动强度大，部分还存在对设备依赖度高的问题，因此不适合规模化制备。结晶分离法是利用混合物中各组分在某种溶剂中溶解度的差异，改变条件使目标组分在溶液中达到过饱和而析出，实现混合物彼此分离，达到纯化目的的物理方法。有文献(Lu et al.Production of Monascus pigments asextracellular crystals by cell suspension culture.Biotechnological Productsand Process Engineering.2018)报道了液体发酵液中菌丝分泌到胞外的橙色素在发酵液中形成了胞外晶体的现象，但是发酵液中的橙色素胞外晶体的量远低于菌丝体中橙色素的含量，菌丝体中大量橙色素分离纯化的问题仍未得到解决。专利CN110437644A公开了一种红曲橙色素的分离纯化方法，即用pH＝2的70％的乙醇溶液提取菌丝中的红曲色素得到色素粗提液，然后采用湿法装填CAD-40大孔吸附树脂柱，将色素粗提液上样，再用无水乙醇洗脱以获得高纯度的红曲橙色素，即提高最终产物中橙色素组分占总色素组分的比例，然而该方法着眼于提高橙色素纯度，仍然存在得率较低的问题，且纯化过程复杂耗时，无法满足工业化规模生产的要求。
发明内容
本发明针对现有技术存在的缺陷，提供了一种提高红曲菌菌丝体中橙色素得率的方法，不仅操作简单快速，成本低廉，在显著提高橙色素纯度的同时，也显著改善了得率，适合工业化生产制备橙色素。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案是：
一种提高红曲菌菌丝体中橙色素得率的方法，所述方法包括：
步骤1、色素原液的制备：将红曲菌经液态发酵后，过滤收集菌丝体并清洗，用pH＝2-3的60-100％的乙醇溶液高速匀浆，过滤得到色素原液；
步骤2、橙色素纯化：向色素原液中加入pH＝2-3的酸性水溶液，混匀后于-20-10℃下静置0.5-24小时，然后离心，弃上清得到橙色素晶体。
该方案的具体原理是：首先将发酵得到的菌丝体进行清洗，除去菌丝体表面的水溶性色素，然后加入乙醇并匀浆，通过匀浆破坏菌丝体的细胞壁，使菌丝体内的橙色素溶于乙醇中，过滤除去菌丝体残渣得到橙色素粗提液，即橙色素原液。根据橙色素原液中主要杂质组分极性比橙色素组分大的特点，推测在相同的乙醇水溶液中，橙色素组分的溶解度比主要杂质组分小，故可以利用结晶的原理，通过向色素原液中加入酸性水溶液，逐步降低体系中的乙醇含量，使橙色素先达到过饱和而从混合物结晶分离出来，从而得到以橙色素为主要成分的色素晶体。通过改变色素原液和酸性水溶液的体积比，调节体系中乙醇的浓度，可在维持高纯度橙色素的前提下，最大程度提高橙色素的得率，其中限定操作过程中各溶液的pH为2-3的目的是抑制橙色素与杂质中-NH2发生反应而转变为红色素。
进一步的，所述步骤2中加入酸性水溶液后，使乙醇的浓度降至38.9-56.0％。
进一步的，所述酸性水溶液为甲酸、乙酸、盐酸、硫酸、硝酸、磷酸、高氯酸的一种或多种。
进一步的，所述步骤1中按1％的接种量将浓度为104-106个/mL的红曲菌孢子液接种于马铃薯葡萄糖液体培养基中，于28℃恒温震荡条件培养30-50h；然后向发酵液中加入等体积的0.2mol/L，pH＝3-6的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液，于28℃继续培养5d，然后经滤布抽真空过滤发酵液，收集菌丝体。
进一步的，所述步骤1中用发酵液体积1-5倍的pH＝2-3的酸性水溶液清洗菌丝体。
进一步的，所述步骤1中乙醇溶液的用量为发酵液体积的1-2倍；高速匀浆的转速为10000rpm，匀浆时间为1min。
进一步的，将步骤2得到的橙色素晶体溶于pH＝2-3的60-100％的乙醇中，并重复步骤2，再次进行纯化。
本发明还提供了一种上述提高红曲菌菌丝体中橙色素得率的方法在制备橙色素中的应用。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明通过向色素原液中加入pH＝2-3的酸性水溶液，可以使橙色素结晶析出，并通过改变色素原液和酸性水溶液的体积比，调节体系中乙醇的浓度，可在提高橙色素纯度的前提下，最大程度提高橙色素的得率，其中纯度最高可达92％，得率最高可达90％，并且该方法操作简单易实施，成本低廉且得率高，减少了菌丝体橙色素制备过程中的损失和浪费，适合工业化大规模制备橙色素。
附图说明
图1为本发明实施例1制备得到的色素原液的高效液相色谱图；
图2为本发明实施例1纯化后的橙色素的高效液相色谱图；
图3为本发明实施例2纯化后的橙色素的高效液相色谱图；
图4为本发明实施例3纯化后的橙色素的高效液相色谱图；
图5为本发明实施例4纯化后的橙色素的高效液相色谱图。
具体实施方式
下面将结合本发明中的实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动条件下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
本实施例提供了一种提高红曲菌菌丝体中橙色素得率的方法，包括：
步骤1、色素原液的制备：
(1)孢子的制备：将红色红曲菌M-7(来源于CCAM 070120，中国典型培养物保藏中心)接种到50mL孢子培养基，28℃、200rpm震荡培养5d，取出，再于28℃继续静止培养5d。其中，孢子培养基具体为：NaNO3 3.0g/L，K2HPO4 1.0g/L，KCl 0.5g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L，FeSO4·7H2O 0.5g/L，蔗糖30.0g/L，酵母膏5.0g/L。
将培养好的红曲菌菌膜挑出转移至已灭菌的带有玻璃珠的锥形瓶中，用接种针将菌膜中的菌丝分散，加入20mL无菌水，震摇10-20min后用双层擦镜纸过滤，滤液即为孢子悬浮液，调整其浓度为105个/mL。
(2)红曲色素的发酵：按1％的接种量将孢子悬浮液(105个/mL)接种于50mL马铃薯蔗糖液体培养基(PDB)中，于28℃，200rpm恒温震荡条件培养40h，加入50mL灭过菌的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液(0.2mol/L，pH＝3)，于28℃，200rpm恒温震荡条件继续培养5d。
(3)发酵完毕后，发酵液经滤布抽真空过滤，收集菌丝体。用2倍发酵液体积的pH＝2的甲酸溶液冲洗菌丝，洗去其表面残留的水溶性色素和培养基。将菌丝表面水分用吸水纸压干，转移至发酵液体积2倍的70％的乙醇溶液中，其中乙醇溶液已事先用甲酸调至pH＝2，可避免橙色素转变为红色素。然后10000rpm高速匀浆1min，接着滤去匀浆后的菌丝残渣，得到色素原液。
步骤2、橙色素的纯化：
向上述色素原液中加入0.25倍体积的甲酸溶液(pH＝2)，即色素原液：酸性水溶液的体积比为1：0.25，使溶液中的乙醇终浓度为56.0％。2800rpm涡旋5min，待充分混合后置于-20℃静置2h，取出后10000rpm离心20min，弃去上清即得到橙色素晶体。
实施例2
本实施例与实施例1的不同之处在于：步骤2中，色素原液：甲酸溶液的体积比为1：0.3，使溶液中的乙醇终浓度为53.8％。
实施例3
本实施例与实施例1的不同之处在于：步骤2中，色素原液：甲酸溶液的体积比为1：0.4，使溶液中的乙醇终浓度为50.0％。
实施例4
本实施例与实施例1的不同之处在于：步骤2中，色素原液：甲酸溶液的体积比为1：0.5，使溶液中的乙醇终浓度为46.7％。
实施例5
本实施例与实施例1的不同之处在于：步骤2中，色素原液：甲酸溶液的体积比为1：0.6，使溶液中的乙醇终浓度为43.8％。
实施例6
本实施例与实施例1的不同之处在于：步骤2中，色素原液：甲酸溶液的体积比为1：0.7，使溶液中的乙醇终浓度为41.2％。
实施例7
本实施例与实施例1的不同之处在于：步骤2中，色素原液：甲酸溶液的体积比为1：0.8，使溶液中的乙醇终浓度为38.9％。
实施例8
本实施例与实施例1的不同之处在于：步骤2中，色素原液：甲酸溶液的体积比为1：0.9，使溶液中的乙醇终浓度为36.8％。
实施例9
本实施例与实施例1的不同之处在于：步骤2中，色素原液：甲酸溶液的体积比为1：1，，使溶液中的乙醇终浓度为35.0％。
实施例10
本实施例与实施例1的不同之处在于：步骤2中，色素原液：甲酸溶液的体积比为1：2，使使溶液中的乙醇终浓度为23.3％。
实施例11
本实施例与实施例1的不同之处在于：步骤2中，色素原液：甲酸溶液的体积比为1：3，使溶液中的乙醇终浓度为17.0％。
对比例1
本对比例与实施例1的不同之处在于：采用如专利CN110437644A中实施例3的方法对红曲橙色素进行分离纯化，具体为：
步骤1、色素原液的制备：同实施例1。
步骤2、色素分离：(1)大孔树脂的预处理：95％(v/v)乙醇浸泡24h，使大孔树脂充分溶胀，过滤后用去离子水冲洗到不出现白色浑浊液和没有乙醇味为止，过滤后再加入5％HCl(v/v)溶液浸泡24h，用去离子水冲洗至中性，过滤后用5％NaOH(v/v)溶液浸泡24h，同样用去离子水冲洗至中性，过滤得到处理好的大孔树脂。
(2)色素的吸附：取预处理后的大孔吸附树脂CAD-40，采用湿法装填玻璃层析柱中(25cm×1cm ID)，柱床高度23cm，柱床体积18mL。用pH为2、70％(v/v)的乙醇溶液将色素粗提液的色价稀释至5.12U/ml(以470nm吸光值计)，以4BV/h的速率上样64mL，上样终止时流出液的色价为0.535U/ml(以470nm吸光值计)。
(3)色素的洗脱：上样结束后，用5BV无水乙醇以1BV/h速率洗脱。
步骤3、红曲橙色素的收集：洗脱液流出47ml(2.6BV)后开始收集，共收集2.6BV-5BV之间的红曲橙色素洗脱液。
评价方案
纯度分析：将实施例1-11得到的橙色素晶体溶解在相同体积的酸性乙醇(pH＝2，70％乙醇)中，制备成橙色素溶液，将该橙色素溶液、以及对比例1得到的橙色素洗脱液和色素原液分别高效液相色谱分析，其中实施例1-4的高效液相色谱图如附图1-5所示。
其中附图1为色素原液的高效液相色谱图，根据附图1可知其中共有8个色素组分，分别记为1-8，其中组分1、2、5、6最大吸收波长在380nm左右，为4种黄色素组分，属于杂质成分；组分3、4、7、8最大吸收波长在470nm左右，为4种橙色素组分，属于目标成分。对上述8个色素组分峰面积进行积分，其中橙色素的纯度(即原液中，橙色素/(橙色素+黄色素)的比例)为67.62％。
根据附图1可知，杂质组分2占总杂质的68.88％，为主要杂质组分，其保留时间小于所有橙色组分，表明其极性较橙色素偏大，即在相同浓度的乙醇水溶液中，其溶解度大于橙色素，故可以利用结晶的原理使橙色素先达到过饱和而从混合物中结晶分离出来。
附图2-5为采用本发明实施例1-4的纯化方法得到的橙色素晶体溶解后制备的橙色素溶液的高效液相色谱图，根据附图2-5可发现相比于色素原液，杂质黄色素的种类和含量显著减少，4个杂质组分中只有组分2和6明显存在，而所有橙色素的4个组分均明显存在。对各个色素组分峰面积进行积分，计算其中橙色素的纯度。橙色素纯度提高率(％)＝(纯化后橙色素纯度-色素原液中橙色素纯度)×100％/色素原液中橙色素纯度。结果如表1所示。
得率分析：将实施例1-11得到的橙色素晶体溶解于相同体积的酸性乙醇(pH＝2，70％乙醇)中，制备成橙色素溶液，将该橙色素溶液、以及对比例1得到的橙色素洗脱液和色素原液稀释适当倍数后分别进行紫外-可见分光光度分析，检测橙色素的吸光值(470nm)。橙色素色价＝橙色素吸光值×稀释倍数×橙色素溶液体积。根据各实施例和对比例测得的橙色素色价，计算橙色素的得率(％)：纯化后橙色素的色价/色素原液中橙色素色价×100％。结果如表1所示。
表1实施例和对比例中得率、纯度和纯度提高率
Figure BDA0002685843190000081
Figure BDA0002685843190000091
根据表1的结果，相比于对比例1，本发明所采用的纯化方法显著提高了最终产物中橙色素的得率，并且相比于色素原液，产物中橙色素的纯度也有明显提高。同时，通过调节色素原液：酸性水溶液的体积比，控制溶液中乙醇终浓度，可在满足所需橙色素纯度的前提下，最大程度的提高橙色素得率。进一步地，当调节乙醇的终浓度至38.9-56.0％时，可使制得的橙色素的纯度相比于色素原液提高至少10％，达到74％-92％，并且得率相比于常规方法显著提高，得率最高可达84％。更进一步地，当调节乙醇终浓度至46.7-50.0％时，可保证橙色素的得率和纯度均较高，其中纯度相比于色素原液增加至少15％，达到78％-79％，同时得率最高可达65％。并且在生产过程中还可采用多级沉淀和重结晶，即加入酸性水溶液使乙醇终浓度从56.0％开始阶梯式分步降低，逐步结晶析出橙色素，从而获得纯度从高到低的几批橙色素晶体，当最终乙醇浓度降到35％以下时，能回收色素原液中90％左右的橙色素，所获得的橙色素晶体的纯度根据先后批次分布于92％-70％之间，其中的低纯度橙色素晶体用60％-100％乙醇复溶，利用本发明的方法再次结晶进行纯化，进一步提高橙色素的纯度。本发明的技术方案简单易实施，成本低廉，显著减少造成菌丝体橙色素制备过程中的损失和浪费，适合工业化大规模制备橙色素。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (6)

1.一种提高红曲菌菌丝体中橙色素得率的方法，其特征在于，所述方法包括：
步骤1、色素原液的制备：将红曲菌经液态发酵后，过滤收集菌丝体并清洗，用pH=2-3，浓度为60-100%的乙醇溶液高速匀浆，过滤得到色素原液；
步骤2、橙色素纯化：向色素原液中加入pH=2-3的酸性水溶液，混匀后于-20℃-10℃下静置0.5-24小时，然后离心，弃上清得到橙色素晶体；所述步骤2中加入酸性水溶液后，使乙醇的浓度降至38.9-56.0%。
2.根据权利要求1所述的一种提高红曲菌菌丝体中橙色素得率的方法，其特征在于，所述酸性水溶液为甲酸、乙酸、盐酸、硫酸、硝酸、磷酸、高氯酸的一种或多种。
3.根据权利要求1所述的一种提高红曲菌菌丝体中橙色素得率的方法，其特征在于，所述步骤1中按1％的接种量将浓度为104-106个/mL的红曲菌孢子液接种于马铃薯葡萄糖液体培养基中，于28℃恒温震荡条件培养30-50h；然后向发酵液中加入等体积的0.2mol/L，pH=3-6的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液，于28℃继续培养5d，然后经滤布抽真空过滤发酵液，收集菌丝体。
4.根据权利要求1所述的一种提高红曲菌菌丝体中橙色素得率的方法，其特征在于，所述步骤1中用发酵液体积1-5倍的pH=2-3的酸性水溶液清洗菌丝体。
5.根据权利要求1所述的一种提高红曲菌菌丝体中橙色素得率的方法，其特征在于，所述步骤1中乙醇溶液的用量为发酵液体积的1-2倍；高速匀浆的转速为10000rpm，匀浆时间为1min。
6.根据权利要求1所述的一种提高红曲菌菌丝体中橙色素得率的方法，其特征在于，将步骤2得到的橙色素晶体溶于pH=2-3的60 -100%的乙醇溶液中，并重复步骤2，再次进行纯化。
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