CN113929615B - 一种野尻霉素的纯化方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种1‑脱氧野尻霉素的提纯方法，该方法以产生1‑脱氧野尻霉素的解淀粉芽孢杆菌发酵液为原料，通过固液分离、脱色剂脱色、阴离子树脂层析、阳离子树脂层析和结晶，获得高纯度的1‑脱氧野尻霉素，收率高于50％。该方法具有操作简单、制备工时短和溶媒用量小等特点。
Description
技术领域
本发明涉及微生物发酵纯化技术领域，具体为一种1-脱氧野尻霉素的纯化方法。
背景技术
1-脱氧野尻霉素(1-deoxynojirimycin，1-DNJ)是一种天然存在的多羟基哌啶生物碱,化学名称为3,4,5-三羟基-2-羟甲基四氢吡啶，天然存在于桑树的枝、叶和根部以及蚕的幼虫和蚕蛹等。1-DNJ对α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶具有强烈的抑制作用，能够延缓餐后小肠对糖的吸收，达到抑制糖尿病人餐后血糖升高的目的。基于其强有力的糖苷酶抑制活性，野尻霉素可用于治疗糖尿病及糖尿病并发症、肥胖症和相关的机能紊乱等,此外，1-DNJ也可用于食品领域，以桑叶为原料的食品，作为功能性降糖的产品在日本等东亚国家已经允许上市销售，显示出1-DNJ在保健食品领域的广阔前景。
最常见的1-DNJ来源为从桑叶中进行提纯。中国专利CN102276515A公开了以桑叶、桑枝、桑白皮为原料提取纯化野尻霉素的方法，该方法主要将原料的浸提液通过阳离子交换层析、凝胶层析，三氧化二铝柱层析，并结合中间体催化转化技术，其1-DNJ纯度可以控制在10％、50％、90％、99％四个级别；中国专利CN102491938A从天然产物桑叶中提取分离高纯度1-脱氧野尻霉素，桑叶提取液浓缩后过阳离子树脂，洗脱液浓缩后经有机溶剂萃取、重结晶、凝胶过滤层析后制备获得1-脱氧野尻霉素精制品。
虽然从桑叶中进行1-DNJ提纯的文献报道和专利技术较多，但桑叶中1-DNJ的含量低至0.1％，1-DNJ的分离纯化也较为复杂，再加上提取过程中的损失，大规模制备成本高昂。微生物发酵具有生长迅速、营养要求简单、易于培养等特点，从微生物来源制备具有生物活性的天然化合物具有较大优势。如解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens,BA)属于革兰氏阳性芽孢杆菌，自然选育与基因工程改造的解淀粉芽孢杆菌能够大量产生1-DNJ。1-DNJ发酵液中含有大量的蛋白质、多糖及色素类杂质；微生物代谢生成野尻霉素，同时也会生成野尻霉素类似物；同时野尻霉素没有紫外吸收，常规的检测手段无法使用，使得从微生物发酵液中进行1-DNJ的纯化面临较大困难。
发明内容
本发明的目的是提供一种以产生1-脱氧野尻霉素的解淀粉芽孢杆菌发酵液为原料进行1-脱氧野尻霉素纯化的方法，从而弥补现有技术的不足。
本发明提供的纯化1-脱氧野尻霉素的方法，包括以下步骤：
(1)将1-脱氧野尻霉素发酵液固液分离，酸化后加入助滤剂，过滤收集滤液；
(2)滤液加入脱色剂进行脱色，过滤收集滤液；
(3)将步骤(2)所得滤液进行阴离子树脂层析，收集洗脱液；
(4)将步骤(3)所得洗脱液进行阳离子树脂层析，使用氨水洗脱，收集pH9～12的洗脱液；
(5)将步骤(4)所得洗脱液酸化至中性，减压蒸干，甲醇溶解，低温搅拌结晶，过滤后固相真空干燥即可得1-脱氧野尻霉素。
优选的，步骤(1)中酸化液相使用盐酸，调节pH至3.0～4.0。
优选的，步骤(1)中所述的助滤剂选自硅胶、中性氧化铝、纤维素和硅藻土，优选硅藻土。
优选的，步骤(2)中所述的脱色剂为活性炭，与滤液的质量体积比为1％～2％，过滤使用0.22μm的水系膜。
优选的，步骤(3)中所述阴离子树脂为LX-67，滤液与阴离子树脂体积比为1:9～1:4，使用纯水洗脱。
优选的，步骤(4)中所述阳离子树脂为LX-712，氨水的洗脱浓度为0.2～0.5mol/L，洗脱速度为1～2BV/h。
优选的，步骤(4)中所述洗脱液与阳离子树脂体积比为1:8～1:1。
优选的，步骤(5)中所述洗脱液酸化使用盐酸，调节pH至6.5～7.5，低温搅拌结晶为2～8℃下搅拌结晶12～18h。
优选的，步骤(5)中所述甲醇溶解得到的结晶前液浓度为20g/L～32g/L。
优选的，步骤(1)中1-脱氧野尻霉素发酵液为产生1-脱氧野尻霉素的解淀粉芽孢杆菌发酵液。
优选的，产生1-脱氧野尻霉素的解淀粉芽孢杆菌为解淀粉芽孢杆菌HDCC00252。
本发明提供的纯化1-脱氧野尻霉素的方法，其优点主要体现在：(1)在纯化1-脱氧野尻霉素过程中，使用有机溶剂较少，制备过程的安全性与环保性得到很大提高；(2)纯化工艺简单可控，耗能低，周期短，有利于工业化扩大生产；(3)纯化得到的1-脱氧野尻霉素纯度超过99％，收率高于50％。
附图说明
图1 HDCC00252菌株发酵液的HPLC图谱；
图2纯化后1-脱氧野尻霉素HPLC图谱。
具体实施方式
本发明利用本公司获得的1-DNJ高产菌种：解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)HDCC00252，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏编号为CGMCC NO.22781，保藏日期为2021年06月25日。LX-67购自西安蓝晓科技新材料股份有限公司，LX-712购自西安蓝晓科技新材料股份有限公司。下述实施例中所用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中采用的材料、试剂等如无特殊说明，皆为普通市售品，皆可于市场购得。
下面将通过实施例对本发明作进一步的描述，这些描述并不是对本发明内容作进一步的限定。本领域的技术人员应理解，对本发明内容所作的等同替换，或相应的改进，仍属于本发明的保护范围之内。
实施例1
(1)菌种复苏活化：取HDCC00252原始菌种，在室温下解冻，吸取0.1ml菌悬液接种到LB固体平板，涂布均匀，置于37℃培养箱内培养24h，得到活化复苏的菌苔。
(2)液体种子制备：取活化复苏的菌苔，用接种环刮取一环，接种到盛有100ml液体种子培养基的500ml三角瓶中，包扎好置于37℃、220rpm的摇床上振荡培养16h，控制种子液OD值≥5.0。
液体种子培养基组成为：葡萄糖1.5％，酵母浸出粉0.5％，蛋白胨1％，氯化钠1％。消毒前调pH至7.0，消毒条件为121～123℃、30min。
(3)发酵培养：取培养合格的液体种子，以10％(V/W)的比例接种到装有27L液体发酵培养基的50L罐中，培养温度37℃，溶氧控制大于30％，空气流量1.0VVM，初始搅拌转速200rpm，培养5天。发酵罐培养基消毒前调pH至8.0，消毒条件为121～123℃、30min。发酵终点发酵液中的1-DNJ含量为7.2g/L。
液体发酵培养基配方组成为：葡萄糖0.4％，蔗糖2％，乳糖2％，酵母浸出粉3％，硫酸铵0.1％，硝酸钠0.05％，硫酸亚铁铵0.25％，磷酸氢二钾0.28％。消毒前调pH至8.0，消毒条件为121～123℃、30min。
实施例2
将产野尻霉素菌种发酵得到的发酵液8L，向发酵液中加入0.5N HCL调节pH到3.0，向酸化后的发酵液中加入硅藻土0.3kg，搅拌充分后打入板框中过滤，收集滤液6.5L。向滤液中加入活性炭65g，搅拌30min后开始过滤，滤膜使用0.22μm的水系膜，过滤循环三遍后，用1L的水顶洗膜，收集脱色后滤液7.5L。使用LX-67阴离子交换树脂对料液进行进一步脱色去杂，按上柱液体积与树脂体积之比1:5上样，反复上柱3-5次，最后使用2倍柱体积纯化水顶洗树脂，收集合并流出液和顶洗液。使用LX-712阳离子交换树脂对阴离子树脂处理后的料液进行去除有关物质杂质，按上柱液体积与树脂体积之比1:2上样，上柱结束后使用纯化水洗至流出液无颜色，最后使用0.2N氨水洗脱树脂，洗脱速度为2BV/h，收集pH在9-12的组分。使用0.5N盐酸调节阳离子树脂洗脱液pH至7.1，减压浓缩至干，使用甲醇200mL溶解，结晶前液浓度为25.5g/L，在2-8℃下搅拌结晶14h后过滤，过滤得到的固体粉末在50℃±3℃真空干燥10小时得到成品。野尻霉素含量99.1％，总收率53.1％。
实施例3
将产野尻霉素菌种发酵得到的发酵液15L，向发酵液中加入0.5N HCL调节pH到3.5，向酸化后的发酵液中加入硅藻土0.5kg，搅拌充分后打入板框中过滤，收集滤液12L。向滤液中加入活性炭180g，搅拌30min后开始过滤，滤膜使用0.22μm的水系膜，过滤循环三遍后，用1.8L的水顶洗膜，收集脱色后滤液13.8L。使用LX-67阴离子交换树脂对料液进行进一步脱色去杂，按上柱液体积与树脂体积之比1:4上样，反复上柱3-5次，最后使用3倍柱体积纯化水顶洗树脂，收集合并流出液和顶洗液。使用LX-712阳离子交换树脂对阴离子树脂处理后的料液进行去除有关物质杂质，按上柱液体积与树脂体积之比1:1上样，上柱结束后使用纯化水洗至流出液无颜色，最后使用0.4N氨水洗脱树脂，洗脱速度为1.5BV/h，收集pH在9-12的组分。使用0.5N盐酸调节阳离子树脂洗脱液pH至6.9，减压浓缩至干，使用甲醇450mL溶解，结晶前液浓度为20.7g/L，在2-8℃下搅拌结晶12h后过滤，过滤得到的固体粉末在50℃±3℃真空干燥11小时得到成品。野尻霉素含量99.3％，总收率51.4％。
实施例4
将产野尻霉素菌种发酵得到的发酵液20L，向发酵液中加入0.5N HCL调节pH到4.0，向酸化后的发酵液中加入硅藻土0.6kg，搅拌充分后打入板框中过滤，收集滤液16L。向滤液中加入活性炭320g，搅拌30min后开始过滤，滤膜使用0.22μm的水系膜，过滤循环三遍后，用2.4L的水顶洗膜，收集脱色后滤液18.4L。使用LX-67阴离子交换树脂对料液进行进一步脱色去杂，按上柱液体积与树脂体积之比1:7上样，反复上柱3-5次，最后使用4倍柱体积纯化水顶洗树脂，收集合并流出液和顶洗液。使用LX-712阳离子交换树脂对阴离子树脂处理后的料液进行去除有关物质杂质，按上柱液体积与树脂体积之比1:3上样，上柱结束后使用纯化水洗至流出液无颜色，最后使用0.5N氨水洗脱树脂，洗脱速度为2BV/h，收集pH在9-12的组分。使用0.5N盐酸调节阳离子树脂洗脱液pH至6.8，减压浓缩至干，使用甲醇570mL溶解，结晶前液浓度为22.3g/L，在2-8℃下搅拌结晶15h后过滤，过滤得到的固体粉末在50℃±3℃真空干燥13小时得到成品。野尻霉素含量99.5％，总收率52.8％。
实施例5
将产野尻霉素菌种发酵得到的发酵液26L，向发酵液中加入0.5N HCL调节pH到3.0-4.0，向酸化后的发酵液中加入硅藻土0.8kg，搅拌充分后打入板框中过滤，收集滤液20L。向滤液中加入活性炭200g，搅拌30min后开始过滤，滤膜使用0.22μm的水系膜，过滤循环三遍后，用3L的水顶洗膜，收集脱色后滤液23L。使用LX-67阴离子交换树脂对料液进行进一步脱色去杂，按上柱液体积与树脂体积之比1:8上样，反复上柱3-5次，最后使用5倍柱体积纯化水顶洗树脂，收集合并流出液和顶洗液。使用LX-712阳离子交换树脂对阴离子树脂处理后的料液进行去除有关物质杂质，按上柱液体积与树脂体积之比1:6上样，上柱结束后使用纯化水洗至流出液无颜色，最后使用0.3N氨水洗脱树脂，洗脱速度为1BV/h，收集pH在9-12的组分。使用0.5N盐酸调节阳离子树脂洗脱液pH至6.8，减压浓缩至干，使用甲醇550mL溶解，结晶前液浓度为28.3g/L，在2-8℃下搅拌结晶18h后过滤，过滤得到的固体粉末在50℃±3℃真空干燥15小时得到成品。野尻霉素含量99.6％，总收率49.9％。
实施例6
将产野尻霉素菌种发酵得到的发酵液30L，向发酵液中加入0.5N HCL调节pH到3.5，向酸化后的发酵液中加入硅藻土1kg，搅拌充分后打入板框中过滤，收集滤液23.5L。向滤液中加入活性炭235g，搅拌30min后开始过滤，滤膜使用0.22μm的水系膜，过滤循环三遍后，用3.5L的水顶洗膜，收集脱色后滤液27L。使用LX-67阴离子交换树脂对料液进行进一步脱色去杂，按上柱液体积与树脂体积之比1:9上样，反复上柱3-5次，最后使用5倍柱体积纯化水顶洗树脂，收集合并流出液和顶洗液。使用LX-712阳离子交换树脂对阴离子树脂处理后的料液进行去除有关物质杂质，按上柱液体积与树脂体积之比1:8上样，上柱结束后使用纯化水洗至流出液无颜色，最后使用0.5N氨水洗脱树脂，洗脱速度为1.5BV/h，收集pH在9-12的组分。使用0.5N盐酸调节阳离子树脂洗脱液pH至7.2，减压浓缩至干，使用甲醇725mL溶解，结晶前液浓度为28.2g/L，在2-8℃下搅拌结晶13h后过滤，过滤得到的固体粉末在50℃±3℃真空干燥13小时得到成品。野尻霉素含量99.8％，总收率56.8％。
Claims (7)
1.一种纯化1-脱氧野尻霉素的方法，其特征在于包括以下步骤：
(1) 将1-脱氧野尻霉素发酵液固液分离，酸化后加入助滤剂，过滤收集滤液；
(2) 滤液加入脱色剂进行脱色，过滤收集滤液；
(3) 将步骤(2)所得滤液进行阴离子树脂层析，阴离子树脂为LX-67，滤液与阴离子树脂体积比为1:9~1:4，使用纯水洗脱，收集洗脱液；
(4) 将步骤(3)所得洗脱液进行阳离子树脂层析，阳离子树脂为LX-712，使用氨水洗脱，氨水的洗脱浓度为0.2～0.5mol/L，洗脱速度为1～2BV/h，收集pH9~12的洗脱液；
(5) 将步骤(4)所得洗脱液酸化至中性，减压蒸干，甲醇溶解得到结晶前液，低温搅拌结晶，过滤后固相真空干燥即可得1-脱氧野尻霉素；
其中，步骤(1)中1-脱氧野尻霉素发酵液为产生1-脱氧野尻霉素的解淀粉芽孢杆菌发酵液，产生1-脱氧野尻霉素的解淀粉芽孢杆菌为解淀粉芽孢杆菌HDCC00252。
2.如权利要求1中所述的纯化方法，其特征在于：步骤(1)中酸化液相使用盐酸，调节pH至3.0～4.0。
3.如权利要求1中所述的纯化方法，其特征在于：步骤(1)中所述的助滤剂选自硅胶、中性氧化铝、纤维素和硅藻土。
4.如权利要求1中所述的纯化方法，其特征在于：步骤(2)中所述的脱色剂为活性炭，与滤液的质量体积比为1%~2%，过滤使用0.22μm的水系膜。
5.如权利要求1所述的纯化方法，其特征在于：步骤(4)中所述洗脱液与阳离子树脂体积比为1:8~1:1。
6.如权利要求1所述的纯化方法，其特征在于：步骤(5)中所述洗脱液酸化使用盐酸，调节pH至6.5～7.5，低温搅拌结晶为2~8℃下搅拌结晶12~18h。
7.如权利要求6所述的纯化方法，其特征在于：步骤(5)中所述甲醇溶解得到的结晶前液浓度为20g/L~32g/L。
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