CN110862427B - 一种庆大霉素C1a的纯化方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种庆大霉素C1a的纯化方法。该方法包括如下步骤：(1)将庆大霉素发酵液依次经大孔吸附树脂层析、大孔弱酸性阳离子树脂层析，得层析液；或者，将庆大霉素发酵液依次经大孔弱酸性阳离子树脂层析、大孔吸附树脂层析，得层析液；(2)将步骤(1)中所述层析液的pH调至10.0‑12.0，经反相吸附树脂层析，得层析液C，将所述层析液C的pH调节至4.0‑8.0，即可；所述反相吸附树脂层析的流动相为pH 1.0‑2.0的酸水溶液，所述反相吸附树脂为聚苯乙烯二乙烯基苯系树脂。本发明的纯化方法操作简单、生产成本低，在保证收率大于41％的前提下，分离得到的庆大霉素C1a纯度大于96％。
Description
技术领域
本发明涉及一种庆大霉素C1a的纯化方法。
背景技术
1963年美国Schering公司的weiestein第一次从棘孢小单孢菌中分离得到庆大霉素(Gentamicin)。庆大霉素是为数不多的热稳定性氨基糖苷类碱性抗生素。性质稳定，溶于水，不溶于乙醇，丙酮等有机溶剂。广义上的庆大霉素是多组分的混合物，以C族复合物为主。主要从绛红小单孢菌、棘孢小单孢菌中发酵分离获得。其主要成分有C1，C1a，C2，C2a。因其优良的抗菌能力而被广泛使用。其中庆大霉素C1a作为依替米星的合成原料药物。
庆大霉素C1a的传统获取是从小诺霉素发酵液副产物中获得，下游纯化一般通过脱色、过滤、浓缩、离子树脂吸附、洗脱、解析、浓缩喷雾干燥等过程。传统方法耗费的时间长，生产工艺复杂。离子树脂吸附后要经过多次洗脱和冲洗才能获得产物，原材料消耗大，生产成本高。
庆大霉素C1a的新型获取通过改变菌种或发酵培养基和补料方式改变小单孢菌产生的庆大霉素各组分的比例(如专利201710791469.5)，特别是降低难去除副产物的比例，此法能显著提高下游纯化庆大霉素C1a的收率。
纯化方面，除传统的离子交换树脂法外，专利201510998347.4通过连续色谱分离法用大孔吸附树脂分离纯化庆大霉素C1a，此方法虽然比传统的方法更易操作，但其纯化获得的样品纯度只大于90％，难以获得纯度大于98％的庆大霉素C1a。
因此，在保证收率的前提下，如何分离纯化得到纯度较高的庆大霉素C1a是本领域亟待解决的问题。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于克服现有技术中庆大霉素C1a分离纯化方法复杂，在保证收率的前提下，难以提高其纯度的缺陷，而提供了一种庆大霉素C1a的纯化方法。本发明的纯化方法操作简单、生产成本低，在保证收率大于41％的前提下，分离得到的庆大霉素C1a纯度大于96％。
本发明提供了一种庆大霉素C1a的纯化方法，其包括下述步骤：
(1)将pH调整为10.0-12.0的庆大霉素发酵液经大孔吸附树脂层析，得层析液A1；将pH调整为6.0-8.0的层析液A1经大孔弱酸性阳离子树脂层析，得层析液A2；所述大孔吸附树脂层析的流动相为pH 1.0-2.0的酸水溶液，所述大孔弱酸性阳离子树脂层析的流动相为pH 11.0-12.0的氨水溶液；
或者，将pH调整为6.0-8.0的庆大霉素发酵液经大孔弱酸性阳离子树脂层析，得层析液B1；将pH调整为10.0-12.0的层析液B1经大孔吸附树脂层析，得层析液B2；所述大孔弱酸性阳离子树脂层析的流动相为pH 11.0-12.0的氨水溶液，所述大孔吸附树脂层析的流动相为pH 1.0-2.0的酸水溶液；
(2)将步骤(1)中所述层析液A2或所述层析液B2的pH调至10.0-12.0，经反相吸附树脂层析，得层析液C，将所述层析液C的pH调至4.0-8.0，即可；所述反相吸附树脂层析的流动相为pH 1.0-2.0的酸水溶液，所述反相吸附树脂为聚苯乙烯二乙烯基苯系树脂。
本发明中，庆大霉素C1a的收率是指经分离纯化后得到的庆大霉素C1a的质量占庆大霉素发酵液中庆大霉素C1a总质量的百分比。
步骤(1)中，所述庆大霉素发酵液可为本领域常规的庆大霉素发酵液，一般为绛红小单胞菌(Micromonospora purprua)KD1989经发酵后所得的发酵液；优选地，所述庆大霉素发酵液中，庆大霉素C1a占比高于30％，百分比是指庆大霉素C1a的质量在庆大霉素发酵液主要有效成分质量之和中的占比；更优选地，所述庆大霉素发酵液中，庆大霉素C1占23-35％(例如31％)、庆大霉素C1a占30-55％(例如35％)、庆大霉素C2和庆大霉素C2a质量之和占30-50％(例如34％)，百分比是指各组分的质量在庆大霉素发酵液主要有效成分质量之和中的占比，例如按照专利201710791469.5实施例1公开的方法制备所得的庆大霉素发酵液。
本领域技术人员知晓，所述庆大霉素发酵液中的主要有效成分是指庆大霉素C1、庆大霉素C1a、庆大霉素C2和庆大霉素C2a。
本领域技术人员知晓，步骤(1)中，所述庆大霉素发酵液一般需经预处理再进行层析。所述预处理可为本领域常规的预处理，例如将所述庆大霉素发酵液的pH调节至2后过滤。所述pH调节剂可为浓硫酸。所述过滤优选为添加过滤剂后经板框过滤或经陶瓷膜过滤。所述过滤剂可为本领域常规的过滤剂，例如硅藻土和/或珍珠岩。在预处理之后，例如，步骤(1)中，可以将pH为2左右的庆大霉素发酵液调整为pH至10.0-12.0或者6.0-8.0，然后上样、并层析；这里的pH调节物质可以为常规的调碱性的pH调节剂，如，氨水或氢氧化钾。
本领域技术人员均知，在层析前应经上样步骤。上样量一般不应超过大孔吸附树脂、大孔弱酸性阳离子树脂或反相吸附树脂的最大载样量。
当上样于大孔吸附树脂时，每100ml树脂，上样量一般为3-5g。
当上样于大孔弱酸性阳离子树脂时，每100ml树脂，上样量一般为8-10g。
当上样于反相吸附树脂时，每100ml树脂，上样量一般为6-8g。
其中，所述上样的流速可为本领域常规的流速，优选为0.5-2BV/h，例如0.5BV/h、1BV/h或2BV/h。
步骤(1)中，优选地，将pH调整为11.0-12.0的庆大霉素发酵液经大孔吸附树脂层析，例如pH调整为11的庆大霉素发酵液或pH调整为12的庆大霉素发酵液。
步骤(1)中，优选地，将pH调整为11.0-12.0的层析液B1经大孔吸附树脂层析，例如pH调整为11的层析液B1或pH调整为12的层析液B1。
步骤(1)中，所述大孔吸附树脂的种类可为本领域常规的可吸附庆大霉素C1a的大孔吸附树脂，一般为中等极性或弱极性大孔吸附树脂，优选为DM11树脂、LX1500树脂、HZ-816树脂、HZ-803树脂、HZ-814树脂和HZ-804树脂中的一种或多种，更优选为DM11树脂、LX1500树脂、HZ-816树脂、HZ-803树脂或HZ-804树脂。
本领域技术人员均知，步骤(1)中，所述大孔吸附树脂层析的方式一般为柱层析，其中，柱体积可为2.7-3L，例如2.7L或3L；高径比可为3：1。
本发明中，所述酸水溶液可为本领域常规的含有可溶于水的酸的水溶液，所述可溶于水的酸优选为硫酸、乙酸、磷酸和盐酸中的一种或多种。
步骤(1)中，在所述pH调整为10.0-12.0的庆大霉素发酵液或所述pH调整为10.0-12.0的层析液B1经大孔吸附树脂层析前，还可按本领域常规操作进行除杂。
其中，所述除杂的洗脱液可为水和/或pH 2-5的酸水溶液。
当所述除杂的洗脱液为水时，所述水的洗脱体积优选为3-5BV，例如3BV、4BV或5BV。
当所述除杂的洗脱液为水时，所述水的洗脱流速优选为0.2-1BV/h，例如0.5BV/h或1BV/h。
当所述除杂的洗脱液为pH 2.0-5.0的酸水溶液时，所述pH 2.0-5.0的酸水溶液的洗脱流速优选为0.5-1BV/h，例如0.5BV/h或1BV/h。
当所述除杂的洗脱液为pH 2.0-5.0的酸水溶液时，所述pH 2.0-5.0的酸水溶液的pH优选为2.5、3.0或4.0。
当所述除杂的洗脱液为pH 2.0-5.0的酸水溶液时，所述pH 2.0-5.0的酸水溶液的酸优选为硫酸和/或乙酸。
当所述除杂的洗脱液为pH 2.0-5.0的酸水溶液时，所述pH 2.0-5.0的酸水溶液优选为pH 2.5的硫酸溶液、pH 3.0的硫酸溶液、pH 4.0的硫酸溶液、pH 2.5的乙酸溶液或pH3.0的乙酸溶液。当洗脱液中，580nm条件下透光率低于90％时，终止pH 2.0-5.0的酸水溶液洗脱。
步骤(1)中，所述pH 1.0-2.0酸水溶液的pH优选为1.0、1.5或2.0。
步骤(1)中，所述pH 1.0-2.0酸水溶液的酸优选为硫酸和/或乙酸。
步骤(1)中，所述pH 1.0-2.0酸水溶液优选为pH 1.0的硫酸水溶液、pH 1.5的硫酸水溶液、pH 2.0的硫酸水溶液、pH 1.0的乙酸水溶液或pH 1.5的乙酸水溶液。
步骤(1)中，所述pH 1.0-2.0的酸水溶液的流速优选为0.5-1BV/h，例如0.5BV/h或1BV/h。
步骤(1)中，优选地，将所述pH调整为7.0-8.0的庆大霉素发酵液经大孔弱酸性阳离子树脂层析，例如pH调整为7.0的庆大霉素发酵液或pH调整为8.0的庆大霉素发酵液。
步骤(1)中，优选地，将所述pH调整为7.0-8.0的层析液A1经大孔弱酸性阳离子树脂层析，例如pH调整为7.0的层析液A1或pH调整为8.0的层析液A1。
步骤(1)中，所述大孔弱酸性阳离子树脂的种类可为本领域常规的可吸附庆大霉素C1a的大孔弱酸性阳离子树脂，优选为丙烯酸系大孔弱酸树脂，例如HZ-0156树脂、HZD-2树脂、D-152树脂、HD-2树脂和ZGD-115树脂中的一种或多种，再例如HZ-0156树脂、HZD-2树脂、D-152树脂、HD-2树脂或ZGD-115树脂。
本领域技术人员均知，步骤(1)中，所述大孔弱酸性阳离子树脂层析的方式一般为柱层析，其中，柱体积可为1L；高径比可为(5:1)-(8:1)，例如5:1或8:1。
步骤(1)中，在所述pH调整为6.0-8.0庆大霉素发酵液或所述pH调整为6.0-8.0的层析液A1经大孔弱酸性阳离子树脂层析前，还可按本领域常规操作进行除杂。
其中，所述除杂的洗脱液可为水和/或pH 8-10的氨水溶液。
当所述除杂的洗脱液为水时，所述水的洗脱体积优选为10-15BV，例如10BV、12BV或15BV。
当所述除杂的洗脱液为水时，所述水的洗脱流速优选为0.2-1BV/h，例如0.5BV/h或1BV/h。
当所述除杂的洗脱液为pH 8-10的氨水溶液时，所述pH 8.0-10.0的氨水溶液的洗脱流速优选为0.5-1BV/h，例如0.5BV/h或1BV/h。
当所述除杂的洗脱液为pH 8-10的氨水溶液时，所述pH 8.0-10.0的氨水溶液优选为pH 8.0的氨水溶液、pH 8.5的氨水溶液或pH 9.0的氨水溶液。当洗脱液中，庆大霉素C1a的纯度高于92％时，终止pH 8-10的氨水溶液洗脱。
步骤(1)中，所述pH 11.0-12.0的氨水溶液优选为pH 11.0的氨水溶液或pH 12.0的氨水溶液。
步骤(1)中，所述pH 11.0-12.0的氨水溶液的流速优选为0.5-1BV/h，例如0.5BV/h或1BV/h。
步骤(2)中，所述层析液A2或所述层析液B2的pH优选为10或12。
步骤(2)中，所述反相吸附树脂的种类可为本领域常规的可吸附庆大霉素C1a的反相吸附树脂，优选为NM100树脂、NM200树脂、ups40-300树脂、ups60-300树脂、PR30-300树脂和PR60-300树脂中的一种或多种，更优选为NM100树脂、NM200树脂、ups40-300树脂、ups60-300树脂、PR30-300树脂或PR60-300树脂。
本领域技术人员均知，步骤(2)中，所述反相吸附树脂层析的方式一般为柱层析，其中，柱体积可为1L；高径比可为(6:1)-(8:1)，例如6:1或8:1。
步骤(2)中，在所述层析液A2或所述层析液B2经反相吸附树脂层析前，还可按本领域常规操作进行除杂。
其中，所述除杂的洗脱液可为水和/或pH 1.0-3.0的酸水溶液。
当所述除杂的洗脱液为水时，所述水的洗脱体积优选为2-4BV，例如3BV。
当所述除杂的洗脱液为水时，所述水的洗脱流速优选为0.2-1BV/h，例如0.5BV/h或1BV/h。
当所述除杂的洗脱液为pH 1.0-3.0的酸水溶液时，所述pH 1.0-3.0的酸水溶液的洗脱流速优选为0.5-1BV/h，例如0.5BV/h或1BV/h。
当所述除杂的洗脱液为pH 1.0-3.0的酸水溶液时，所述pH 1.0-3.0的酸水溶液的pH优选2.0、2.5或3.0。
当所述除杂的洗脱液为pH 1.0-3.0的酸水溶液时，所述pH 1.0-3.0的酸水溶液的酸优选硫酸、盐酸、乙酸和磷酸中的一种或多种，例如硫酸、盐酸、乙酸或磷酸。
当所述除杂的洗脱液为pH 1.0-3.0的酸水溶液时，所述pH 1.0-3.0的酸水溶液优选为pH 2.0的硫酸水溶液、pH 3.0的硫酸水溶液、pH 2.5的盐酸水溶液、pH 3.0的盐酸水溶液、pH 3.0的乙酸水溶液或pH 2.0的磷酸水溶液。当洗脱液中，580nm条件下透光率低于90％时，终止pH 1.0-3.0的酸水溶液洗脱。
步骤(2)中，所述pH 1.0-2.0的酸水溶液中，所述pH优选为1.0、1.5或2.0。
步骤(2)中，所述pH 1.0-2.0的酸水溶液中，所述酸优选硫酸、盐酸、乙酸和磷酸中的一种或多种，例如硫酸、盐酸、乙酸或磷酸。
步骤(2)中，所述pH 1.0-2.0的酸水溶液优选为pH 1.0的硫酸水溶液、pH 2.0的硫酸水溶液、pH 1.0的盐酸水溶液、pH 1.5的盐酸水溶液、pH 2.0的盐酸水溶液、pH 1.0的乙酸水溶液或pH 1.0的磷酸水溶液。
步骤(2)中，所述pH 1.0-2.0的酸水溶液的流速优选为0.5-1BV/h，例如0.5BV/h或1BV/h。
步骤(2)中，所述层析液C还可按本领域常规操作进行纯化处理。所述纯化处理可为本领域常规的纯化处理，优选地，将所述层析液C经浓缩、调节pH至4.0-8.0搅拌边滴加短链醇，得固体，即可。
其中，所述浓缩可为本领域常规的浓缩，优选地，将所述层析液C浓缩至庆大霉素C1a 100-200g/L，即可。
其中，所述调节pH的试剂可为本领域常规的pH调节剂，例如氢氧化钠和/或氨水。
其中，所述pH优选为6-8，例如6或8。
其中，所述短链醇可为本领域常规的C1-8的醇类，例如甲醇、乙醇、丙醇、异丙醇和正丁醇中的一种或多种，再例如甲醇、乙醇、丙醇、异丙醇或正丁醇。
在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。
本发明所用试剂和原料均市售可得。
本发明的积极进步效果在于：
(1)本发明采用弱酸性阳离子树脂和大孔吸附树脂相结合的方法从庆大霉素发酵液中分离提取获得庆大霉素C1a，其纯度大于92％，收率大于55％；进一步地，再用聚苯乙烯二乙烯基苯系树脂精制庆大霉素C1a，在弱酸性阳离子树脂和非极性大孔吸附树脂分离的基础上，庆大霉素C1a纯度大于96％，收率大于70％。相比于发酵液中的庆大霉素C1a的含量，本发明中的纯化方法最终收率大于41％，分离得到的庆大霉素C1a纯度大于96％。
(2)本发明中用短链醇进一步纯化庆大霉素C1a，可直接制备得到庆大霉素C1a固体，在聚苯乙烯二乙烯基苯骨架的聚合物填料精制的基础上，其纯度大于98％，收率大于80％。
(3)庆大霉素C1a作为依替米星的关键起始物料，庆大霉素C1a纯度大于96％能显著提高下游依替米星的质量及合成和纯化工序的收率。此方法操作简单易操作，利于工艺放大和工业化生产，有很大的经济效益前景。
具体实施方式
下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。
下述实施例及对比例中，庆大霉素发酵液按照专利201710791469.5实施例1公开的方法进行100L罐补料发酵制备得到含有35％左右含量庆大霉素C1a的发酵液。具体制备方法如下：
所用菌种为绛红小单胞菌(Micromonospora purprua)KD1989；
一级种子培养基(成分浓度均以g/100ml计)：葡萄糖0.14、玉米淀粉1.15、玉米粉1.92、大豆蛋白胨0.46、豆粕8488为1.54、硫酸铵0.015、硝酸钾0.054、碳酸钙0.62、泡敌0.03和有机硅油0.02，pH自然。35.5℃培养48h。
二级种子培养基(成分浓度均以g/100ml计)：玉米淀粉2.5、玉米粉1.0、大豆蛋白胨0.5、豆粕8488为1.9、醋酸钠0.1、硫酸铵0.071、硝酸钾0.007、碳酸钙0.7、氯化钴0.002、泡敌0.05和有机硅油0.03，pH 7.6。35.5℃培养48h。
整个发酵工艺路线为：一级种子培养→二级种子培养→发酵培养。
一级种子培养：在25L种子罐中按照一级种子培养基成分进行配比。先将一级种子培养基消毒灭菌，使用无菌空气保持压力在0.05MPa上下，然后将培养好的摇瓶种液接入一级种子罐培养，培养过程：装液量15L/25L；接种量70ml/15L；培养温度35.5℃；每隔1min通入单位体积发酵液的空气体积(VVM)为1L；搅拌转速：0～15h为250rpm、15～24h为300rpm、24h～30h为350rpm、30h～36h为400rpm、36h～48h为425rpm；罐压：0.03～0.05MPa；培养周期：48h。
二级种子培养：在50L种子罐中按照二级种子培养基成分进行配比。先将二级种子培养基消毒灭菌、冷却，使用无菌空气保持压力在0.05MPa上下，然后将一级种子培养得到的一级种子液5L移入二级种子罐进行培养，装液量28L/50L。培养温度35.5℃；每隔1min通入单位体积发酵液的空气通入单位体积发酵液的空气(VVM)为1L；搅拌转速0～9h为300rpm、9～12h为350rpm、12～36h为400rpm、36～48h为450rpm；罐压：0.03～0.05MPa；培养周期：48h。
100L发酵罐培养：在100L种子罐按照下文所述发酵基础培养基配比投料。先将培养基灭菌、冷却，使用无菌空气保持压力在0.05MPa上下，然后将二级种子液25L移入发酵罐中进行培养。装液41L/100L；培养温度35.5℃；每1min通入单位体积发酵液的空气(VVM)为1L；搅拌转速：0～4h为250rpm、4～8h为350rpm、8～96h为500rpm；罐压：0.03～0.05MPa；培养周期：96h。
发酵基础培养基(成分浓度均以g/100mL计)：玉米淀粉2.5、玉米粉2.0、冷榨豆粉2.15、大豆蛋白胨0.85、醋酸钠0.2、硫酸铵0.08、硝酸钾0.017、碳酸钙0.7、氯化钙0.1、氯化钴0.002、泡敌0.03和有机硅油0.02，pH 7.6。
在补料控制阶段实行四次补料，具体如下：在加入发酵基础培养基进行发酵培养后,在20-24h补3000-3500mL补料培养基，在35-40h补3000-3500mL补料培养基，在46-50h补2300-2700ml补料培养基，在55-65h补2300-2700ml补料培养基，同时在发酵过程中补水控制罐内发酵液体积维持与初始发酵体积一致。
所述补料培养基(成分浓度均以g/100mL计)：玉米淀粉7.0、玉米粉2.1、大豆蛋白胨2.2、冷榨豆粉8.8、醋酸钠0.2、硫酸铵0.16、硝酸钾0.034、碳酸钙0.7、氯化钙0.1、氯化钴0.004、淀粉酶0.004、泡敌0.03和有机硅油0.02，pH 7.6。
发酵培养结束后，即得发酵液，对发酵液的相关指标进行测定和分析，结果如下：发酵液的主要有效成分中，C1组分约占31％左右，C1a约占35％，C2+C2a约占34％。
下述实施例中，一般采用柱前衍生化-HPLC法测定庆大霉素C1a实验阶段不同样品的含量和有关物质。柱前衍生化的方法参考英国药典BP2009。HPLC条件参考英国药典BP2009，通过外标法测定含量。
下述实施例中，ups40-300树脂和ups60-300树脂购自苏州纳微科技股份有限公司；PR30-300树脂和PR60-300树脂购自赛分科技有限公司。
实施例1
(1)发酵液的获取：取发酵液55L，用浓硫酸调至pH 2左右，通过加过滤剂板框过滤获得上清液42L，约含庆大霉素C1a 132g。
(2)大孔吸附树脂柱层析酸洗脱粗分离：将(1)的上清液调pH至11后上柱DM11树脂常压柱(柱体积2.7L，高径比3：1)。上样流速1BV/h，然后去离子水冲洗约3BV，流速1BV/h。接着用pH 3.0的稀硫酸溶液洗杂，洗杂流速0.5BV/h；再用pH 1.0的稀硫酸水溶液洗脱，洗脱流速0.5BV/h，每间隔1h收集洗脱液，用HLPC液相进行含量及有关物质测定，收集有关物质纯度在80％以上的洗脱液，其中收集液中庆大霉素C1a含量约105g。
(3)大孔弱酸阳离子树脂柱层析氨水洗脱纯化并脱色：将(2)工序获得的洗脱液调pH至7，上样大孔弱酸阳离子树脂柱HZ-0156(柱体积1L，高径比5：1)；然后去离子水冲洗约10BV，大量除色素，流速0.5BV/h。接着用pH 8.0的氨水溶液洗杂，洗杂流速0.5BV/h；再用pH11.0的氨水溶液洗脱，洗脱流速0.5BV/h，每间隔1h收集洗脱液，用HLPC液相进行含量及有关物质测定，收集有关物质纯度在92％以上的洗脱液,其中收集液中庆大霉素C1a含量约78.8g。
(2)和(3)过程的总收率在59.6％。
(4)中等极性的聚苯乙烯二乙烯基苯骨架的聚合物柱层析精制：将(3)的洗脱液调pH至10后上柱NM100(柱体积1L，高径比8：1)。上样流速1BV/h，然后去离子水冲洗约3BV，流速1BV/h。接着用pH 2.0的稀硫酸水溶液洗杂，洗杂流速0.5BV/h；再用pH 1.0的稀硫酸水溶液洗脱，洗脱流速0.5BV/h，每间隔1h收集洗脱液，用HLPC液相进行含量及有关物质测定，收集有关物质纯度在96％以上的洗脱液，其中收集液中庆大霉素C1a含量约63g。将上述洗脱液浓缩至300ml备用。
(5)取(4)获得纯度96％的庆大霉素C1a浓缩液300ml，用氢氧化钠调节pH至6.0。恒定速度缓慢加入1.2L甲醇，在2-8℃条件下搅拌12h。抽滤获得固体，40℃减压真空干燥研磨后称重55g，通过HPLC检测庆大霉素C1a纯度为98.6％。
实施例2
(1)发酵液的获取：取发酵液50L，用浓硫酸调至pH 2左右，通过陶瓷膜过滤获得上清液43.6L，约含庆大霉素C1a 128g。
柱层析酸洗脱粗分离：将(1)的上清液调pH至10后上柱LX1500树脂常(2)大孔压柱(柱体积3L，高径比3：1)。上样流速2BV/h，然后去离子水冲洗约5BV吸附树脂，流速0.5BV/h。接着用pH 4.0的稀硫酸溶液洗杂，洗杂流速1BV/h；再用pH 2.0的稀硫酸水溶液洗脱，洗脱流速1BV/h，每间隔1h收集洗脱液，用HLPC液相进行含量及有关物质测定，收集有关物质纯度在80％以上的洗脱液，其中收集液中庆大霉素C1a含量约98g。
(3)大孔弱酸阳离子树脂柱层析氨水洗脱纯化并脱色：将(2)工序获得的洗脱液调pH至8，上样大孔弱酸阳离子树脂柱HZD-2(柱体积1L，高径比5：1)；然后去离子水冲洗约12BV，大量除色素，流速1BV/h。接着用pH 9.0的氨水溶液洗杂，洗杂流速1BV/h；再用pH12.0的氨水溶液洗脱，洗脱流速1BV/h，每间隔1h收集洗脱液，用HLPC液相进行含量及有关物质测定，收集有关物质纯度在92％以上的洗脱液,其中收集液中庆大霉素C1a含量约73.2g。
(2)和(3)过程的总收率在57.1％。
(4)中等极性的聚苯乙烯二乙烯基苯骨架的聚合物柱层析精制：将(3)的洗脱液调pH至10后上柱NM200(柱体积1L，高径比6：1)。上样流速0.5BV/h，然后去离子水冲洗约3BV，流速0.5BV/h。接着用pH 3.0的稀盐酸水溶液洗杂，洗杂流速1BV/h；再用pH 2.0的稀盐酸水溶液洗脱，洗脱流速1BV/h，每间隔1h收集洗脱液，用HLPC液相进行含量及有关物质测定，收集有关物质纯度在96％以上的洗脱液，其中收集液中庆大霉素C1a含量约54g。将上述洗脱液浓缩至300ml备用。
(5)取(4)获得纯度96％的庆大霉素C1a浓缩液300ml，用氢氧化钠调节pH至6.0。恒定速度缓慢加入1.5L乙醇，在室温℃条件下搅拌12h。抽滤获得固体，40℃减压真空干燥研磨后称重48g，通过HPLC检测庆大霉素C1a纯度为98.2％。
实施例3
(1)发酵液的获取：取发酵液53L，用浓硫酸调至pH 2左右，通过陶瓷膜过滤获得澄清液45.2L，约含庆大霉素C1a 135g。
(2)大孔弱酸阳离子树脂柱层析氨水洗脱纯化并脱色：将(1)工序获得的洗脱液调pH至8，上样大孔弱酸阳离子树脂柱HZD-2(柱体积1L，高径比5：1)；然后去离子水冲洗约15BV，大量除色素，流速1BV/h。接着用pH 9.0的氨水溶液洗杂，洗杂流速1BV/h；再用pH12.0的氨水溶液洗脱，洗脱流速1BV/h，每间隔1h收集洗脱液，用HLPC液相进行含量及有关物质测定，收集有关物质纯度在80％以上的洗脱液,其中收集液中庆大霉素C1a含量约94g。
(3)大孔吸附树脂柱层析酸洗脱粗分离：将(2)的上清液调pH至10后上柱LX1500树脂常压柱(柱体积3L，高径比3：1)。上样流速2BV/h，然后去离子水冲洗约5BV，流速0.5BV/h。接着用pH 4.0的稀硫酸溶液洗杂，洗杂流速1BV/h；再用pH 2.0的稀硫酸水溶液洗脱，洗脱流速1BV/h，每间隔1h收集洗脱液，用HLPC液相进行含量及有关物质测定，收集有关物质纯度在92％以上的洗脱液，其中收集液中庆大霉素C1a含量约75g。
(2)和(3)过程的总收率在55.5％。
(4)中等极性的聚苯乙烯二乙烯基苯骨架的聚合物柱层析精制：将(3)的洗脱液调pH至10后上ups40-300树脂(柱体积1L，高径比6：1)。上样流速0.5BV/h，然后去离子水冲洗约3BV，流速0.5BV/h。接着用pH 3.0的稀硫酸水溶液洗杂，洗杂流速1BV/h；再用pH 2.0的稀硫酸水溶液洗脱，洗脱流速1BV/h，每间隔1h收集洗脱液，用HLPC液相进行含量及有关物质测定，收集有关物质纯度在96％以上的洗脱液，其中收集液中庆大霉素C1a含量约56g。将上述洗脱液浓缩至400ml备用。
(5)取(4)获得纯度96％的庆大霉素C1a浓缩液400ml，用氢氧化钠调节pH至6.0。恒定速度缓慢加入1.5L异丙醇，在室温条件下搅拌12h。抽滤获得固体，40℃减压真空干燥研磨后称重45g，通过HPLC检测庆大霉素C1a纯度为98.3％。
实施例4
(1)发酵液的获取：用专利201710791469.5实施例1公开的方法进行100L罐补料发酵获得含有35％左右含量庆大霉素C1a的发酵液；另庆大霉素C1组分约占31％左右，C2+C2a约占34％。将上述发酵液50L用浓硫酸调至pH 2左右通过板框过滤获得滤液40L，约含庆大霉素C1a 125g。
(2)大孔吸附树脂柱层析酸洗脱粗分离：将(1)的滤液调pH至12后上HZ-803树脂常压柱(柱体积3L，高径比3：1)。上样流速0.5BV/h，然后去离子水冲洗约4BV，流速0.5BV/h。接着用pH 2.5的稀硫酸溶液洗杂，洗杂流速1BV/h；再用pH 1.5的稀硫酸水溶液洗脱，洗脱流速1BV/h，每间隔1h收集洗脱液，用HLPC液相进行含量及有关物质测定，收集有关物质纯度在80％以上的洗脱液，其中收集液中庆大霉素C1a含量约100g。
(3)大孔弱酸阳离子树脂柱层析氨水洗脱纯化并脱色：将(2)工序获得的洗脱液调pH至8，上样大孔弱酸阳离子树脂柱D-152(柱体积1L，高径比8：1)；然后去离子水冲洗约12BV，大量除色素，流速1BV/h。接着用pH 8.0的氨水溶液洗杂，洗杂流速1BV/h；再用pH12.0的氨水溶液洗脱，洗脱流速1BV/h，每间隔1h收集洗脱液，用HLPC液相进行含量及有关物质测定，收集有关物质纯度在92％以上的洗脱液，其中收集液中庆大霉素C1a含量约72g。
(2)和(3)过程的总收率在57.6％。
(4)中等极性的聚苯乙烯二乙烯基苯骨架的聚合物柱层析精制：将(3)的洗脱液调pH至10后上柱NM100(柱体积1L，高径比6：1)。上样流速0.5BV/h，然后去离子水冲洗约3BV，流速0.5BV/h。接着用pH 2.5的稀盐酸水溶液洗杂，洗杂流速1BV/h；再用pH 1.0的稀盐酸水溶液洗脱，洗脱流速1BV/h，每间隔1h收集洗脱液，用HLPC液相进行含量及有关物质测定，收集有关物质纯度在96％以上的洗脱液，其中收集液中庆大霉素C1a含量约57g。将上述洗脱液浓缩至300ml备用。
(5)取(4)获得纯度96％的庆大霉素C1a浓缩液300ml，用氢氧化钠调节pH至8.0。恒定速度缓慢加入1.2L甲醇，搅拌均匀后在-20℃条件下静置12h。抽滤获得固体，40℃减压真空干燥研磨后称重45g，通过HPLC检测庆大霉素C1a纯度为98.5％。
实施例5
(1)发酵液的获取：用专利201710791469.5实施例1公开的方法进行100L罐补料发酵获得含有35％左右含量庆大霉素C1a的发酵液；另庆大霉素C1组分约占31％左右，C2+C2a约占34％。将上述发酵液58L用浓硫酸调至pH 2左右通过板框过滤获得滤液50L，约含庆大霉素C1a 135g。
(2)大孔吸附树脂柱层析酸洗脱粗分离：将(1)的滤液调pH至12后上柱HZ-816树脂常压柱(柱体积3L，高径比3：1)。上样流速0.5BV/h，然后去离子水冲洗约4BV，流速0.5BV/h。接着用pH 2.5的稀硫酸溶液洗杂，洗杂流速1BV/h；再用pH 1.5的稀硫酸水溶液洗脱，洗脱流速1BV/h，每间隔1h收集洗脱液，用HLPC液相进行含量及有关物质测定，收集有关物质纯度在80％以上的洗脱液，其中收集液中庆大霉素C1a含量约108g。
(3)大孔弱酸阳离子树脂柱层析氨水洗脱纯化并脱色：将(2)工序获得的洗脱液调pH至8，上样大孔弱酸阳离子树脂柱HD-2(柱体积1L，高径比8：1)；然后去离子水冲洗约12BV，大量除色素，流速1BV/h。接着用pH 8.5的氨水溶液洗杂，洗杂流速1BV/h；再用pH12.0的氨水溶液洗脱，洗脱流速1BV/h，每间隔1h收集洗脱液，用HLPC液相进行含量及有关物质测定，收集有关物质纯度在92％以上的洗脱液，其中收集液中庆大霉素C1a含量约81g。
(2)和(3)过程的总收率在60.0％。
(4)中等极性的聚苯乙烯二乙烯基苯骨架的聚合物柱层析精制：将(3)的洗脱液调pH至12后上ups60-300树脂(柱体积1L，高径比6：1)。上样流速0.5BV/h，然后去离子水冲洗约3BV，流速0.5BV/h。接着用pH 2.5的稀盐酸水溶液洗杂，洗杂流速1BV/h；再用pH 1.5的稀盐酸水溶液洗脱，洗脱流速1BV/h，每间隔1h收集洗脱液，用HLPC液相进行含量及有关物质测定，收集有关物质纯度在96％以上的洗脱液，其中收集液中庆大霉素C1a含量约65g。将上述洗脱液浓缩至300ml备用。
(5)取(4)获得纯度96％的庆大霉素C1a浓缩液300ml，用氢氧化钠调节pH至8.0。恒定速度缓慢加入1.2L乙醇，在2-8℃条件下搅拌12h。抽滤获得固体，40℃减压真空干燥研磨后称重53g，通过HPLC检测庆大霉素C1a纯度为98.3％。
实施例6
(1)发酵液的获取：用专利201710791469.5实施例1公开的方法进行100L罐补料发酵获得含有35％左右含量庆大霉素C1a的发酵液；另庆大霉素C1组分约占31％左右，C2+C2a约占34％。将上述发酵液58L用浓硫酸调至pH 2左右通过板框过滤获得滤液50L，约含庆大霉素C1a 135g。
(2)大孔吸附树脂柱层析酸洗脱粗分离：将(1)的滤液调pH至12后上HZ-804树脂常压柱(柱体积3L，高径比3：1)。上样流速0.5BV/h，然后去离子水冲洗约4BV，流速0.5BV/h。接着用pH 2.5的稀乙酸溶液洗杂，洗杂流速1BV/h；再用pH 1.5的稀乙酸水溶液洗脱，洗脱流速1BV/h，每间隔1h收集洗脱液，用HLPC液相进行含量及有关物质测定，收集有关物质纯度在80％以上的洗脱液，其中收集液中庆大霉素C1a含量约106g。
(3)大孔弱酸阳离子树脂柱层析氨水洗脱纯化并脱色：将(2)工序获得的洗脱液调pH至8，上样大孔弱酸阳离子树脂柱ZGD-115(柱体积1L，高径比8：1)；然后去离子水冲洗约12BV，大量除色素，流速1BV/h。接着用pH 9.0的氨水溶液洗杂，洗杂流速1BV/h；再用pH12.0的氨水溶液洗脱，洗脱流速1BV/h，每间隔1h收集洗脱液，用HLPC液相进行含量及有关物质测定，收集有关物质纯度在92％以上的洗脱液，其中收集液中庆大霉素C1a含量约80g。
(2)和(3)过程的总收率在59.2％。
(4)中等极性的聚苯乙烯二乙烯基苯骨架的聚合物柱层析精制：将(3)的洗脱液调pH至12后上PR30-300树脂(柱体积1L，高径比6：1)。上样流速0.5BV/h，然后去离子水冲洗约3BV，流速0.5BV/h。接着用pH 3.0的稀乙酸水溶液洗杂，洗杂流速1BV/h；再用pH 1.0的稀乙酸水溶液洗脱，洗脱流速1BV/h，每间隔1h收集洗脱液，用HLPC液相进行含量及有关物质测定，收集有关物质纯度在96％以上的洗脱液，其中收集液中庆大霉素C1a含量约66g。将上述洗脱液浓缩至300ml备用。
(5)取(4)获得纯度96％的庆大霉素C1a浓缩液300ml，用氢氧化钠调节pH至8.0。恒定速度缓慢加入1.2L异丙醇，在室温条件下搅拌12h。抽滤获得固体，40℃减压真空干燥研磨后称重52g，通过HPLC检测庆大霉素C1a纯度为98.0％。
实施例7
(1)发酵液的获取：用专利201710791469.5实施例1公开的方法进行100L罐补料发酵获得含有35％左右含量庆大霉素C1a的发酵液；另庆大霉素C1组分约占31％左右，C2+C2a约占34％。将上述发酵液58L用浓硫酸调至pH 2左右通过板框过滤获得滤液50L，约含庆大霉素C1a 135g。
(2)大孔吸附树脂柱层析酸洗脱粗分离：将(1)的滤液调pH至12后上柱层析DM11号树脂常压柱(柱体积3L，高径比3：1)。上样流速0.5BV/h，然后去离子水冲洗约4BV，流速0.5BV/h。接着用pH 3.0的稀乙酸溶液洗杂，洗杂流速1BV/h；再用pH 1.0的稀乙酸水溶液洗脱，洗脱流速1BV/h，每间隔1h收集洗脱液，用HLPC液相进行含量及有关物质测定，收集有关物质纯度在80％以上的洗脱液，其中收集液中庆大霉素C1a含量约105g。
(3)大孔弱酸阳离子树脂柱层析氨水洗脱纯化并脱色：将(2)工序获得的洗脱液调pH至8，上样大孔弱酸阳离子树脂柱HZ-0516(柱体积1L，高径比8：1)；然后去离子水冲洗约12BV，大量除色素，流速1BV/h。接着用pH 8.5的氨水溶液洗杂，洗杂流速1BV/h；再用pH11.0的氨水溶液洗脱，洗脱流速1BV/h，每间隔1h收集洗脱液，用HLPC液相进行含量及有关物质测定，收集有关物质纯度在92％以上的洗脱液，其中收集液中庆大霉素C1a含量约79g。
(2)和(3)过程的总收率在58.5％。
(4)中等极性的聚苯乙烯二乙烯基苯骨架的聚合物柱层析精制：将(3)的洗脱液调pH至12后上PR60-300树脂(柱体积1L，高径比6：1)。上样流速0.5BV/h，然后去离子水冲洗约3BV，流速0.5BV/h。接着用pH 2.0的稀磷酸水溶液洗杂，洗杂流速1BV/h；再用pH 1.0的稀磷酸水溶液洗脱，洗脱流速1BV/h，每间隔1h收集洗脱液，用HLPC液相进行含量及有关物质测定，收集有关物质纯度在96％以上的洗脱液，其中收集液中庆大霉素C1a含量约64g。将上述洗脱液浓缩至300ml备用。
(5)取(4)获得纯度96％的庆大霉素C1a浓缩液300ml，用氢氧化钠调节pH至8.0。恒定速度缓慢加入1.2L异丙醇，在-20℃条件下搅拌12h。抽滤获得固体，40℃减压真空干燥研磨后称重52g，通过HPLC检测庆大霉素C1a纯度为98.1％。
对比例1
(1)将依替米星粗品10.0g溶解于200ml纯水中(HPLC检测纯度64％左右，粗品浓度50mg/ml；根据2005版药典方法进行)，依替米星粗品的制备方法参见中国专利(CN103193837A)说明书[0024]-[0026]段。
(2)分离纯化步骤同实施例1。
经上述分离方法分离得到的依替米星收率低于40％，纯度低于95％。
Claims (16)
1.一种庆大霉素C1a的纯化方法，其特征在于，其包括下述步骤：
（1）将pH调整为10.0-12.0的庆大霉素发酵液经大孔吸附树脂层析，经所述大孔吸附树脂层析前，经水和pH 2-5的酸水溶液洗脱除杂，得层析液A1；将pH调整为6.0-8.0的层析液A1经大孔弱酸性阳离子树脂层析，经所述大孔弱酸性阳离子树脂层析前，经水和pH 8-10的氨水溶液洗脱除杂，得层析液A2；所述大孔吸附树脂层析的流动相为pH 1.0-2.0的酸水溶液，所述大孔弱酸性阳离子树脂层析的流动相为pH 11.0-12.0的氨水溶液；
或者，将pH调整为6.0-8.0的庆大霉素发酵液经大孔弱酸性阳离子树脂层析，经所述大孔弱酸性阳离子树脂层析前，经水和pH 8-10的氨水溶液洗脱除杂，得层析液B1；将pH调整为10.0-12.0的层析液B1经大孔吸附树脂层析，经所述大孔吸附树脂层析前，经水和pH 2-5的酸水溶液洗脱除杂，得层析液B2；所述大孔弱酸性阳离子树脂层析的流动相为pH 11.0-12.0的氨水溶液，所述大孔吸附树脂层析的流动相为pH 1.0-2.0的酸水溶液；
（2）将步骤（1）中所述层析液A2或所述层析液B2的pH调至10.0-12.0，经反相吸附树脂层析，经所述反相吸附树脂层析前，经水和pH 1.0-3.0的酸水溶液洗脱除杂，得层析液C，将所述层析液C的pH调至4.0-8.0，即可；所述反相吸附树脂层析的流动相为pH 1.0-2.0的酸水溶液，所述反相吸附树脂为聚苯乙烯二乙烯基苯系树脂；
步骤（1）中，所述庆大霉素发酵液为绛红小单胞菌（Micromonospora purprua）KD1989经发酵后所得的发酵液；所述庆大霉素发酵液中，庆大霉素C1占23-35%、庆大霉素C1a占30-55%、庆大霉素C2和庆大霉素C2a质量之和占30-50%，百分比是指各组分的质量在庆大霉素发酵液主要有效成分质量之和中的占比；
步骤（1）中，将所述庆大霉素发酵液经预处理再进行层析，所述预处理为将所述庆大霉素发酵液的pH调节至2后过滤；
步骤（1）中，所述大孔吸附树脂的种类为DM11树脂、LX1500树脂、HZ-816树脂、HZ-803树脂、HZ-814树脂和HZ-804树脂中的一种或多种；
步骤（1）中，所述大孔弱酸性阳离子树脂的种类为HZ-0156树脂、HZD-2树脂、D-152树脂、HD-2树脂和ZGD-115树脂中的一种或多种；
步骤（2）中，所述反相吸附树脂的种类为NM100树脂、NM200树脂、ups40-300树脂、ups60-300树脂、PR30-300树脂和PR60-300树脂中的一种或多种；
步骤（2）中，将所述层析液C经纯化处理，所述纯化处理包括下述步骤，将所述层析液C经浓缩、调节pH至4.0-8.0搅拌边滴加短链醇，得固体，即可。
2.如权利要求1所述的庆大霉素C1a的纯化方法，其特征在于，
步骤（1）中，所述大孔吸附树脂的种类为DM11树脂、LX1500树脂、HZ-816树脂、HZ-803树脂或HZ-804树脂；
和/或，步骤（1）中，所述大孔吸附树脂层析的方式为柱层析；
和/或，步骤（1）中，所述经水和pH 2-5的酸水溶液洗脱除杂的过程中，所述水的洗脱体积为3-5BV；
和/或，步骤（1）中，所述经水和pH 2-5的酸水溶液洗脱除杂的过程中，所述水的洗脱流速为0.2-1BV/h；
和/或，步骤（1）中，所述经水和pH 2-5的酸水溶液洗脱除杂的过程中，所述pH 2.0-5.0的酸水溶液的洗脱流速为0.5-1BV/h；
和/或，步骤（1）中，所述经水和pH 2-5的酸水溶液洗脱除杂的过程中，所述pH 2.0-5.0的酸水溶液的pH为2.5、3.0或4.0；
和/或，步骤（1）中，所述经水和pH 2-5的酸水溶液洗脱除杂的过程中，所述pH 2.0-5.0的酸水溶液的酸为硫酸和/或乙酸。
3.如权利要求2所述的庆大霉素C1a的纯化方法，其特征在于，
和/或，步骤（1）中，所述柱层析中，柱体积为2.7-3L；
和/或，步骤（1）中，所述柱层析中，高径比为3：1；
和/或，步骤（1）中，所述pH 2.0-5.0的酸水溶液为pH 2.5的硫酸溶液、pH 3.0的硫酸溶液、pH 4.0的硫酸溶液、pH 2.5的乙酸溶液或pH 3.0的乙酸溶液。
4.如权利要求1所述的庆大霉素C1a的纯化方法，其特征在于，步骤（1）中，将pH调整为11.0-12.0的庆大霉素发酵液经大孔吸附树脂层析；
和/或，步骤（1）中，将pH调整为11.0-12.0的层析液B1经大孔吸附树脂层析；
和/或，步骤（1）中，所述pH 1.0-2.0酸水溶液的pH为1.0、1.5或2.0；
和/或，步骤（1）中，所述pH 1.0-2.0酸水溶液的酸为硫酸和/或乙酸；
和/或，步骤（1）中，所述pH 1-2的酸水溶液的流速为0.5-1BV/h；
和/或，步骤（1）中，将pH调整为7.0-8.0的庆大霉素发酵液经大孔弱酸性阳离子树脂层析；
和/或，步骤（1）中，将pH调整为7.0-8.0的层析液A1经大孔弱酸性阳离子树脂层析；
和/或，步骤（1）中，所述pH 11.0-12.0的氨水溶液为pH 11.0的氨水溶液或pH 12.0的氨水溶液；
和/或，步骤（1）中，所述pH 11.0-12.0的氨水溶液的流速为0.5-1BV/h。
5.如权利要求4所述的庆大霉素C1a的纯化方法，其特征在于，步骤（1）中，所述将pH调整为11.0-12.0的庆大霉素发酵液为pH调整为11的庆大霉素发酵液或pH调整为12的庆大霉素发酵液；
和/或，步骤（1）中，所述将pH调整为11.0-12.0的层析液B1为将pH调整为11的层析液B1或pH调整为12的层析液B1；
和/或，步骤（1）中，所述pH 1.0-2.0酸水溶液为pH 1.0的硫酸水溶液、pH 1.5的硫酸水溶液、pH 2.0的硫酸水溶液、pH 1.0的乙酸水溶液或pH 1.5的乙酸水溶液。
6.如权利要求1所述的庆大霉素C1a的纯化方法，其特征在于，步骤（1）中，所述大孔弱酸性阳离子树脂层析的方式为柱层析；
和/或，步骤（1）中，所述经水和pH 8-10的氨水溶液洗脱除杂的过程中，所述水的洗脱体积为10-15BV；
和/或，步骤（1）中，所述经水和pH 8-10的氨水溶液洗脱除杂的过程中，所述水的洗脱流速为0.2-1BV/h；
和/或，步骤（1）中，所述经水和pH 8-10的氨水溶液洗脱除杂的过程中，所述pH 8.0-10.0的氨水溶液的洗脱流速为0.5-1BV/h；
和/或，步骤（1）中，所述经水和pH 8-10的氨水溶液洗脱除杂的过程中，所述pH 8.0-10.0的氨水溶液为pH 8.0的氨水溶液、pH 8.5的氨水溶液或pH 9.0的氨水溶液。
7.如权利要求6所述的庆大霉素C1a的纯化方法，其特征在于，步骤（1）中，所述柱层析中，柱体积为1L；
和/或，步骤（1）中，所述柱层析中，高径比为（5:1）-（8:1）。
8.如权利要求1所述的庆大霉素C1a的纯化方法，其特征在于，步骤（2）中，所述层析液A2或所述层析液B2的pH为10或12；
和/或，步骤（2）中，所述pH 1.0-2.0的酸水溶液中，所述pH为1.0、1.5或2.0；
和/或，步骤（2）中，所述pH 1.0-2.0的酸水溶液中，所述的酸为硫酸、盐酸、乙酸和磷酸中的一种或多种；
和/或，步骤（2）中，所述pH 1.0-2.0的酸水溶液的流速为0.5-1BV/h。
9.如权利要求8所述的庆大霉素C1a的纯化方法，其特征在于，步骤（2）中，所述pH 1.0-2.0的酸水溶液为pH 1.0的硫酸水溶液、pH 2.0的硫酸水溶液、pH 1.0的盐酸水溶液、pH1.5的盐酸水溶液、pH 2.0的盐酸水溶液、pH 1.0的乙酸水溶液或pH 1.0的磷酸水溶液。
10.如权利要求1所述的庆大霉素C1a的纯化方法，其特征在于，步骤（2）中，所述反相吸附树脂层析的方式为柱层析；
和/或，步骤（2）中，所述经水和pH 1.0-3.0的酸水溶液洗脱除杂的过程中，所述水的洗脱体积为2-4BV；
和/或，步骤（2）中，所述经水和pH 1.0-3.0的酸水溶液洗脱除杂的过程中，所述水的洗脱流速为0.2-1BV/h；
和/或，步骤（2）中，所述经水和pH 1.0-3.0的酸水溶液洗脱除杂的过程中，所述pH1.0-3.0的酸水溶液的洗脱流速为0.5-1BV/h；
和/或，步骤（2）中，所述经水和pH 1.0-3.0的酸水溶液洗脱除杂的过程中，所述pH1.0-3.0的酸水溶液的pH为2.0、2.5或3.0；
和/或，步骤（2）中，所述经水和pH 1.0-3.0的酸水溶液洗脱除杂的过程中，所述pH1.0-3.0的酸水溶液的酸为硫酸、盐酸、乙酸和磷酸中的一种或多种。
11.如权利要求10所述的庆大霉素C1a的纯化方法，其特征在于，步骤（2）中，所述柱层析中，柱体积为1L；
和/或，步骤（2）中，所述柱层析中，高径比为（6:1）-（8:1）；
和/或，步骤（2）中，所述pH 1.0-3.0的酸水溶液为pH 2.0的硫酸水溶液、pH 3.0的硫酸水溶液、pH 2.5的盐酸水溶液、pH 3.0的盐酸水溶液、pH 3.0的乙酸水溶液或pH 2.0的磷酸水溶液。
12.如权利要求1所述的庆大霉素C1a的纯化方法，其特征在于，所述浓缩为将所述层析液C浓缩至庆大霉素C1a 100-200g/L，即可；
和/或，pH调节剂为氢氧化钠和/或氨水；
和/或，所述pH为6-8；
和/或，所述短链醇为甲醇、乙醇、丙醇、异丙醇和正丁醇中的一种或多种。
13.如权利要求12所述的庆大霉素C1a的纯化方法，其特征在于，所述pH为6或8。
14.如权利要求1中所述的庆大霉素C1a的纯化方法，其特征在于，当上样于大孔吸附树脂时，每100ml树脂，上样量为3-5g；
和/或，当上样于大孔弱酸性阳离子树脂时，每100ml树脂，上样量为8-10g；
和/或，当上样于反相吸附树脂时，每100ml树脂，上样量为6-8g；
和/或，上样流速为0.5-2BV/h。
15.如权利要求1中所述的庆大霉素C1a的纯化方法，其特征在于，步骤（1）中，将所述庆大霉素发酵液的pH调节至2后过滤的过程中，pH调节剂为浓硫酸；
和/或，所述过滤为添加过滤剂后经板框过滤或经陶瓷膜过滤。
16.如权利要求15中所述的庆大霉素C1a的纯化方法，其特征在于，步骤（1）中，所述过滤剂为硅藻土和/或珍珠岩。
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