CN113189241A - 一种用hplc-elsd检测发酵液中庆大霉素含量及组分的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种用HPLC‑ELSD检测发酵液中庆大霉素含量及组分的方法，包括以下步骤：制备庆大霉素对照品溶液、发酵液样品处理、绘制标准曲线、应用HPLC‑ELSD检测、用标准曲线法计算样品中庆大霉素含量及组分。本发明的有益效果为：本方法样品处理步骤简单，无需采用衍生化反应或树脂吸附，检测更加方便及时；检测专属性高、分离效果好，能有效识别样品中庆大霉素各组分的色谱峰；检测结果准确度高，各组分加标回收率平均值为99.3％‑101.6％；重复性和耐用性好，相对标准偏差均小于2％；该方法能同时测得药典中关注的庆大霉素总含量和各组分比例。
Description
技术领域
本发明属于成分检测领域，涉及检测庆大霉素含量及组分的方法，具体的涉及一种用HPLC-ELSD检测发酵液中庆大霉素含量及组分的方法。
背景技术
庆大霉素[Gentamicin，正泰霉素(gentamycin)]系从放线菌科单孢子属发酵培养液中提得的多组分混合物，包括C1、C2、C1a、C2a四个主要组分和C2b、西索米星、庆大霉素B等多个次要组分，是常用的氨基糖苷类抗生素，主要用于治疗细菌感染。庆大霉素是目前临床用于抗各种革兰阴性菌感染的主要抗生素之一，而且是为数不多的热稳定性的抗生素，因而在国内外得到广泛应用。发酵生产庆大霉素的企业也很多。
由于庆大霉素组分较多，有关物质多而复杂，且不同成分的生物效价和生物毒性不同，如C1a及C2疗效高，但C2的毒性较大，且易产生耐药性，而C1毒副作用较小、不易产生耐药性，但疗效不如C2及C1a，所以各国药典对庆大霉素中各组分和有关物质的含量、比例都有严格的规定。
研究试验表明，提取过程树脂吸附对于料液中各组分的比例影响不大，如果发酵液料液中组分比例不合格，则提取过程中需要丢弃较多的料液以保证成品组分合格，所以若在发酵生产过程中就将料液中各组分的比例调控至合格或接近合格，则事半功倍，降低成本。因此含量及组分检测对于庆大霉素的发酵生产过程控制具有重要意义。
然而目前药典和文献报道的庆大霉素的检测方法多是用于原料药、成品(注射液、片剂、胶囊、眼药水)或半成品等样品的检测，包括微生物检定法、液相色谱-蒸发光散射检测法(HPLC-ELSD)、液相色谱-脉冲安培电化学检测法(HPLC-PAD)、离子色谱-脉冲安培电化学检测法(IC-PAD)、液相色谱-质谱联用法(HPLC-MS)、核磁共振法(NMR)、酶联免疫法(ELISA)、旋光法等，还有一些报道是用于庆大霉素残留限量检测的免疫试剂盒或试纸条法，而用于庆大霉素发酵样品检测的只有分光光度法(《紫外分光光度法快速测定庆大霉素发酵液中庆大霉素浓度及其机理》)和薄层色谱法。
分光光度法因为庆大霉素本身没有紫外吸收，检测过程需要衍生或加酸加热水解后间接测定，操作繁琐，费时费力，干扰因素多，准确度和专属性较差，且最后只能得到庆大霉素所有相关组分及同类杂质的总和，指征不明确；薄层色谱法能在一定程度上对主要组分进行分离，但操作繁琐，重现性和定量准确性差，仍不能准确指征各组分含量。
其他检测方法中，微生物检定法和酶联免疫法操作繁冗复杂，影响因素多，检测周期长，且不能检测各组分含量；旋光法操作简单，但只适用于基质简单的注射液或提纯液，同时也不能体现各组分含量；核磁共振法和液质联用法专属性、准确度都较高，但仪器成本太高，企业尚未普及；HPLC-PAD是欧洲药典和英美药典规定的用于庆大霉素原料药及制剂组分含量测定的方法，若用于基质复杂的发酵样品检测，PAD检测器易受污染，同时过程样品的跟踪检测数量较大，势必会产生昂贵的成本费用；《中国药典》和兽药典中规定庆大霉素的效价检测方法为微生物检定法，组分、总含量和有关物质的检测方法为HPLC-ELSD法。ELSD是一种通用型检测器，响应不依赖于样品的光学特性，不受官能团的影响，任何挥发性低于流动相的样品均能被检测，包括没有紫外吸收的物质，因而HPLC-ELSD不仅能检测庆大霉素的总含量，还可检测庆大霉素各组分的含量和其他相关物质，其定量准确性、分离重现性和普遍适用性更适合用于发酵生产的过程跟踪检测。
由于ELSD的通用性，发酵液基质杂质也会出峰，所以需要对发酵液基质进行适当分离，避免对目标峰产生干扰。更重要的是，庆大霉素是胞内产物，游离在发酵液中的庆大霉素很少，只有让细胞内的庆大霉素释放出来才能被检测到，所以发酵液的处理和效价释放很关键。
目前文献中关于发酵液的处理分离多是针对提取生产工艺的研究，而且多是应用离子交换树脂进行吸附和解析后再进行收集和浓缩。这种处理方式纯化效果好，但是用在样品检测过程中处理时间过长，不适合发酵过程跟踪检测和多批量处理。
发明内容
为解决上述问题，本发明的目的是提供一种简单高效的发酵液处理及检测方法，能快速准确地检测出庆大霉素发酵液中庆大霉素的含量及组分。
本发明采用的技术方案为：一种用HPLC-ELSD检测发酵液中庆大霉素含量及组分的方法，包括以下步骤：
a、制备庆大霉素对照品溶液和发酵液样品溶液；
b、绘制标准曲线：用HPLC-ELSD分别测定3-5个用流动相溶液稀释至不同浓度的对照品溶液，以庆大霉素4个主要组分的峰面积的对数值与各组分相应浓度值的对数进行一元线性回归，得到各组分的标准曲线和线性回归方程；
c、样品测定与结果计算：将庆大霉素发酵液样品溶液注入HPLC-ELSD测定，记录色谱图和峰面积，并用b步骤所得一元线性回归方程分别计算样品溶液中庆大霉素各组分的含量；4个主要组分的含量之和即为庆大霉素总含量，各组分含量与总含量之比即为各组分的相对比例；
所述步骤b中HPLC-ELSD进行测定的色谱条件如下：
色谱柱：C18(4.6*250mm5.0μm或4.6*150mm5.0μm)；
柱温：28-40℃；
进样量：10-50μL；
流速：0.3-1.0mL/min；
漂移管温度：105-120℃；
增益系数：1；
气体流速：2.0-3.0L/min；
运行时间：30-60min；
流动相：三氟乙酸水溶液与甲醇按一定比例混合。
进一步地，所述庆大霉素发酵液样品溶液的制备方法为：取庆大霉素发酵液，用固体草酸或5-10mol/L的盐酸或硫酸酸化至pH值为1.0-2.0，或者用20％-40％的NaOH或KOH溶液调节样品pH值为11.0-12.0，静置或超声10-60min后，于3000-8000r/min离心5-30min，取上清液用微孔滤膜过滤，作为庆大霉素发酵液样品溶液。
进一步地，所述庆大霉素对照品溶液以流动相溶液溶解并稀释至质量浓度为1.0-5.0mg/mL，再用流动相逐级稀释得到3-5个不同浓度的对照品溶液。
进一步地，所述流动相中三氟乙酸水溶液的浓度为0.1-0.2mol/L，所述甲醇的比例为2％-10％。
进一步地，所述庆大霉素样品溶液为庆大霉素发酵液样品溶液。
本发明获得的有益效果为：本方法样品处理步骤简单，无需采用衍生化反应或树脂吸附，检测更加方便及时；检测专属性高、分离效果好，能有效识别样品中庆大霉素各组分的色谱峰；检测结果准确度高，各组分加标回收率平均值为99.3％-101.6％；重复性和耐用性好，相对标准偏差均小于2％；该方法能同时测得药典中关注的庆大霉素总含量和各组分比例，提供的数据信息更全面，更具有参考价值，能准确指征发酵水平和变化趋势，为生产工艺调整和组分调控提供依据。
本发明采用的发酵液处理及检测方法简便快速，准确高效，易推广，可作为庆大霉素生产企业的发酵过程监控手段，有效指征发酵过程中庆大霉素含量及组分的变化，更好地指导生产工艺调控，甚至在菌种选育阶段即可根据检测结果选择组分比例与成品质量标准更匹配的菌株，提高生产效率，为后续生产提供合格料液，为产品质量保驾护航。
附图说明
图1为实施例1的对照品溶液2色谱图；
图2为实施例2的样品溶液色谱图；
图3a为实施例3的C1组分标准曲线图；
图3b为实施例3的C1a组分标准曲线图；
图3c为实施例3的C2组分标准曲线图；
图3d为实施例3的C2a组分标准曲线图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。
实施例1：
色谱条件
色谱柱：C18，4.6*250mm，5.0μm；
柱温：35℃；
进样量：25μL；
流速：0.5mL/min；
漂移管温度：110℃；
增益系数：1；
气体流速：2.6L/min；
运行时间：50min；
流动相：0.2mol/L三氟乙酸：甲醇＝96：4
a、制备庆大霉素对照品溶液：精密称取庆大霉素对照品50mg，用流动相溶解并稀释至质量浓度为5.0mg/mL，摇匀，作为对照品溶液1；将对照品溶液1用流动相溶液分别稀释2.5倍、5倍和10倍，得到对照品溶液2、3、4；
b、制备庆大霉素样品溶液：取庆大霉素种瓶发酵液样品适量，用10mol/L的盐酸酸化至pH值为1.5，静置60min后，于8000r/min离心5min，取上清液用微孔滤膜过滤，作为庆大霉素样品溶液；
c、绘制标准曲线：打开液相色谱仪，待仪器参数达到要求后，平衡基线20min，将4个对照品溶液依次进样，记录色谱图和峰面积。以庆大霉素4个主要组分的峰面积的对数值与各组分相应浓度值的对数进行一元线性回归，得到各组分的标准曲线和线性回归方程；4个主要组分(C1、C1a、C2、C2a)分别在80-795、76-760、85-845和52-515μg/mL浓度范围内线性关系良好。
d、样品测定与结果计算：将样品溶液注入HPLC-ELSD进行测定，记录色谱图和峰面积，并用c步骤所得一元线性回归方程分别计算样品溶液中庆大霉素各组分的含量。4个主要组分的含量之和即为庆大霉素总含量，为832μg/mL，各组分含量与总含量之比即为各组分的相对比例，分别为C1：25.9％；C1a：30.9％；C2+C2a：43.2％。
附图1为实施例1对照品溶液2的色谱图，总质量浓度为2.0mg/mL。由图可见，4个主要组分的保留时间分别为，C1a：18.535min；C2：25.469min；C2a：32.501min；C1：39.419min。
在此条件下做方法的准确度验证，4个主要组分的平均加标回收率及相对标准偏差分别为，C1：101.6％，RSD1.62％；C1a：99.3％，RSD1.07％；
C2：101.0％，RSD1.40％；C2a：99.4％，RSD1.62％。证明该方法的准确度和精密度都较高。
实施例2：
色谱条件
色谱柱：C18，4.6*250mm，5.0μm；
柱温：30℃；
进样量：20μL；
流速：0.6mL/min；
漂移管温度：105℃；
增益系数：1；
气体流速：2.8L/min；
运行时间：40min；
流动相：0.2mol/L三氟乙酸：甲醇＝95：5
a、制备庆大霉素对照品溶液：精密称取庆大霉素对照品40mg，用流动相溶解并稀释至质量浓度为4.0mg/mL，摇匀，作为对照品溶液1；将对照品溶液1用流动相溶液分别稀释2倍和4倍，得到对照品溶液2和对照品溶液3；
b、制备庆大霉素样品溶液：取庆大霉素发酵液样品适量，用固体草酸酸化至pH值为1.0，超声30min后，于5000r/min离心20min，取上清液用微孔滤膜过滤，作为庆大霉素样品溶液；
c、绘制标准曲线：打开液相色谱仪，待仪器参数达到要求后，平衡基线20min，将3个对照品溶液依次进样，记录色谱图和峰面积。以庆大霉素4个主要组分的峰面积的对数值与各组分相应浓度值的对数进行一元线性回归，得到各组分的标准曲线和线性回归方程；
d、样品测定与结果计算：将样品溶液注入HPLC-ELSD进行测定，记录色谱图和峰面积，并用c步骤所得一元线性回归方程分别计算样品溶液中庆大霉素各组分的含量。4个主要组分的含量之和即为庆大霉素总含量，为1206μg/mL，各组分含量与总含量之比即为各组分的相对比例，分别为C1：43.4％；C1a：15.7％；C2+C2a：40.9％。
附图2为实施例2的样品溶液色谱图，4个主要组分的保留时间分别为，C1a：14.636min；C2：20.302min；C2a：25.481min；C1：32.232min。由图可见，发酵液基质杂质与庆大霉素各组分均能有效分离，不干扰含量和组分的测定。
实施例3：
色谱条件
色谱柱：C18，4.6*150mm，5.0μm；
柱温：28℃；
进样量：10μL；
流速：0.3mL/min；
漂移管温度：120℃；
增益系数：1；
气体流速：3.0L/min；
运行时间：30min；
流动相：0.1mol/L三氟乙酸：甲醇＝94：6
a、制备庆大霉素对照品溶液：精密称取庆大霉素对照品50mg，用流动相溶解并稀释至质量浓度为5.0mg/mL，摇匀，作为对照品溶液1；将对照品溶液1用流动相溶液分别稀释1.5倍、3.75倍和6倍，得到对照品溶液2、3、4；
b、制备庆大霉素样品溶液：取庆大霉素发酵液样品适量，用5mol/L的硫酸酸化至pH值为2.0，超声10min后，于3000r/min离心30min，取上清液用微孔滤膜过滤，作为庆大霉素样品溶液；
c、绘制标准曲线：打开液相色谱仪，待仪器参数达到要求后，平衡基线30min，将4个对照品溶液依次进样，记录色谱图和峰面积。以庆大霉素4个主要组分的峰面积的对数值与各组分相应浓度值的对数进行一元线性回归，得到各组分的标准曲线和线性回归方程；
d、样品测定与结果计算：将样品溶液注入HPLC-ELSD进行测定，记录色谱图和峰面积，并用c步骤所得一元线性回归方程分别计算样品溶液中庆大霉素各组分的含量。4个主要组分的含量之和即为庆大霉素总含量，为2653μg/mL，各组分含量与总含量之比即为各组分的相对比例，分别为C1：28.9％；C1a：25.7％；C2+C2a：45.4％。
附图3a、3b、3c、3d分别为实施例3中4个主要组分的标准曲线图，由图可见，4个主要组分C1、C1a、C2、C2a在对照品溶液稀释的浓度范围内线性关系良好，R2分别为0.9996、0.9975、0.9997、0.9995，均大于0.99。
实施例4：
色谱条件
色谱柱：C18，4.6*250mm，5.0μm；
柱温：40℃；
进样量：50μL；
流速：1.0mL/min；
漂移管温度：110℃；
增益系数：1；
气体流速：2.0L/min；
运行时间：60min；
流动相：0.2mol/L三氟乙酸：甲醇＝98：2
a、制备庆大霉素对照品溶液：精密称取庆大霉素对照品25mg，用流动相溶解并稀释至质量浓度为1.0mg/mL，摇匀，作为对照品溶液1；将对照品溶液1用流动相溶液分别稀释2倍和4倍，得到对照品溶液2和3；
b、制备庆大霉素样品溶液：取庆大霉素发酵液样品适量，用20％的NaOH溶液碱化至pH值为11.0，超声40min后，于4000r/min离心15min，取上清液用微孔滤膜过滤，作为庆大霉素样品溶液；
c、绘制标准曲线：打开液相色谱仪，待仪器参数达到要求后，平衡基线20min，将3个对照品溶液依次进样，记录色谱图和峰面积。以庆大霉素4个主要组分的峰面积的对数值与各组分相应浓度值的对数进行一元线性回归，得到各组分的标准曲线和线性回归方程；
d、样品测定与结果计算：将样品溶液注入HPLC-ELSD进行测定，记录色谱图和峰面积，并用c步骤所得一元线性回归方程分别计算样品溶液中庆大霉素各组分的含量。4个主要组分的含量之和即为庆大霉素总含量，为382μg/mL，各组分含量与总含量之比即为各组分的相对比例，分别为C1：45.8％；C1a：17.3％；C2+C2a：36.9％。
实施例5：
色谱条件
色谱柱：C18，4.6*250mm，5.0μm；
柱温：35℃；
进样量：30μL；
流速：0.8mL/min；
漂移管温度：115℃；
增益系数：1；
气体流速：2.5L/min；
运行时间：35min；
流动相：0.13mol/L三氟乙酸：甲醇＝90：10
a、制备庆大霉素对照品溶液：精密称取庆大霉素对照品25mg，用流动相溶解并稀释至质量浓度为5.0mg/mL，摇匀，作为对照品溶液1；将对照品溶液1用流动相溶液分别稀释2倍、4倍、8倍和10倍，得到对照品溶液2、3、4、5；
b、制备庆大霉素样品溶液：取庆大霉素发酵液样品适量，用40％的KOH溶液碱化至pH值为12.0，静置50min后，于6000r/min离心10min，取上清液用微孔滤膜过滤，作为庆大霉素样品溶液；
c、绘制标准曲线：打开液相色谱仪，待仪器参数达到要求后，平衡基线40min，将5个对照品溶液依次进样，记录色谱图和峰面积。以庆大霉素4个主要组分的峰面积的对数值与各组分相应浓度值的对数进行一元线性回归，得到各组分的标准曲线和线性回归方程；
d、样品测定与结果计算：将样品溶液注入HPLC-ELSD进行测定，记录色谱图和峰面积，并用c步骤所得一元线性回归方程分别计算样品溶液中庆大霉素各组分的含量。4个主要组分的含量之和即为庆大霉素总含量，为2579μg/mL，各组分含量与总含量之比即为各组分的相对比例，分别为C1：29.3％；C1a：26.3％；C2+C2a：44.4％。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
Claims (5)
1.一种用HPLC-ELSD检测发酵液中庆大霉素含量及组分的方法，其特征在于：包括以下步骤：
a、制备庆大霉素对照品溶液和发酵液样品溶液；
b、绘制标准曲线：用HPLC-ELSD分别测定3-5个用流动相溶液稀释至不同浓度的对照品溶液，以庆大霉素4个主要组分的峰面积的对数值与各组分相应浓度值的对数进行一元线性回归，得到各组分的标准曲线和线性回归方程；
c、样品测定与结果计算：将庆大霉素发酵液样品溶液注入HPLC-ELSD测定，记录色谱图和峰面积，并用b步骤所得一元线性回归方程分别计算样品溶液中庆大霉素各组分的含量；4个主要组分的含量之和即为庆大霉素总含量，各组分含量与总含量之比即为各组分的相对比例；
所述步骤b中HPLC-ELSD进行测定的色谱条件如下：
色谱柱：C18(4.6*250mm 5.0μm或4.6*150mm 5.0μm)；
柱温：28-40℃；
进样量：10-50μL；
流速：0.3-1.0mL/min；
漂移管温度：105-120℃；
增益系数：1；
气体流速：2.0-3.0L/min；
运行时间：30-60min；
流动相：三氟乙酸水溶液与甲醇按一定比例混合。
2.根据权利要求1所述的一种用HPLC-ELSD检测发酵液中庆大霉素含量及组分的方法，其特征在于：所述庆大霉素发酵液样品溶液的制备方法为：取庆大霉素发酵液，用固体草酸或5-10mol/L的盐酸或硫酸酸化至pH值为1.0-2.0，或者用20％-40％的NaOH或KOH溶液调节样品pH值为11.0-12.0，静置或超声10-60min后，于3000-8000r/min离心5-30min，取上清液用微孔滤膜过滤，作为庆大霉素发酵液样品溶液。
3.根据权利要求1所述的一种用HPLC-ELSD检测发酵液中庆大霉素含量及组分的方法，其特征在于：所述庆大霉素对照品溶液以流动相溶液溶解并稀释至质量浓度为1.0-5.0mg/mL，再用流动相逐级稀释得到3-5个不同浓度的对照品溶液。
4.根据权利要求1所述的一种用HPLC-ELSD检测发酵液中庆大霉素含量及组分的方法，其特征在于：所述流动相中三氟乙酸水溶液的浓度为0.1-0.2mol/L，所述甲醇的比例为2％-10％。
5.根据权利要求1所述的一种用HPLC-ELSD检测发酵液中庆大霉素含量及组分的方法，其特征在于：所述庆大霉素样品溶液为庆大霉素发酵液样品溶液。
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