CN107778358B

CN107778358B - 一种抗真菌环脂肽棘白菌素b的制备方法

Info

Publication number: CN107778358B
Application number: CN201610740409.6A
Authority: CN
Inventors: 张贵民; 赵德立; 薛国希
Original assignee: Lunan Pharmaceutical Group Corp
Current assignee: Lunan Pharmaceutical Group Corp
Priority date: 2016-08-27
Filing date: 2016-08-27
Publication date: 2020-09-18
Anticipated expiration: 2036-08-27
Also published as: CN107778358A

Abstract

本发明提供一种抗真菌环脂肽棘白菌素B的制备方法，包括下列步骤：1)固液分离ECB发酵液；2)大孔吸附树脂ADS‑17或X‑5富集；3)大孔吸附树脂经热无水甲醇洗脱，合并洗脱液；4)洗脱液浓缩，加氯化钠溶液，搅拌降温析晶，ECB粗品滤饼干燥；5)ECB粗品滤饼用甲醇过滤后，滤液上反相树脂柱XT30；6)反相树脂柱XT30洗脱液浓缩，加氯化钠溶液，搅拌降温析晶，ECB滤饼干燥；7)收集ECB干品。该方法能简单有效的解决副产物洗脱困难，浪费溶剂的问题。能有效完成含水ECB的固液分离，显著减少产品降解。该方法简单易行，适于工业化生产，并能将棘白菌素B最终纯度提高到99％以上。

Description

一种抗真菌环脂肽棘白菌素B的制备方法

技术领域

本发明属于药物化学领域，具体涉及一种抗真菌环脂肽棘白菌素B的制备方法。

背景技术

棘白菌素类是新一代全身性抗真菌药，作用机理为抑制1，3-β-D葡聚糖合成酶活性，从而抑制真菌细胞壁的合成。其独特的作用靶点和确切的疗效，使其与多烯类，三唑类等药物成为抗真菌药物家族重要成员。

目前已经上市的此类药物有：卡泊芬净、米卡芬净和阿尼芬净。阿尼芬净具有无首过效应的特点，主要用于治疗念珠菌和曲霉菌引起的严重感染。

阿尼芬净是由发酵产物棘白菌素B(Echinocandin B，ECB)为原料，经化学或酶反应脱去亚油酸侧链，形成亲水性六元环肽母核，再经合成反应加上戊氧基三苯基甲酸侧链而得。

根据美国专利US4024235和US4024246，棘白菌素B可由Aspergillus nidulans，Aspergillus rugulosus发酵得到，本身在体外具有抗真菌活性。目前所用Echinocandin B发酵，存在产量不高，色素较重，结构类似物较多的问题。Echinocandin B具有两亲性质，不溶于水和非极性溶剂，易溶于低级醇类，化学性质不稳定，易降解。Echinocandin B的纯度直接影响转化后母核的纯度进而影响阿尼芬净的纯度。

Echinocandin B的制备方法具有工艺复杂，难于大规模生产的缺点。美国专利4288549中Lilly公司对分离纯化工艺进行过系统研究，但仅限于实验室工艺的研究，该工艺使用氯仿做萃取剂不利于环保，使用硅胶柱纯化，硅胶一次性使用，固废排放压力大。中国专利CN200910133117.6中菌体经过甲醇浸泡，大孔吸附树脂HP20吸附洗脱，氧化铝柱除色素，洗脱液蒸干得粗品，反相树脂层析制备，加水析晶，得ECB。该工艺反复蒸干复溶，操作复杂，产品容易降解。CN201110244359.X发酵菌体经一定浓度甲醇或乙醇浸泡，滤液经大孔吸附树脂吸附解吸。活性炭脱色，经过乙酸乙酯萃取，丙酮等溶剂结晶得ECB粗品。该工艺使用乙酸乙酯作萃取剂，容易形成乳化层，影响萃取效率。且乙酸乙酯易混杂大量浸提液中的甲醇或乙醇，不利于溶剂回收。CN201210066411.1使用膜过滤及原位浸提方法，浸提滤液经过纳滤浓缩，大孔树脂吸附，洗脱液经过脱色后再纳滤浓缩，减压浓缩，加水析出粗品固体。固体经过直接固液分离得湿粉，真空干燥的粗品。该工艺在微滤膜中原位浸提过滤，滤液再经过纳滤浓缩。高有机溶剂对纳滤膜的溶胀作用较大，长时间使用，不利于产品截留和设备寿命。含棘白菌素B浓缩液加水析出固体，固液分离时，粘度较大，不利工业化放大。

发明内容

本申请提供了一种抗真菌环脂肽棘白菌素B的制备方法，能简单有效的解决副产物洗脱困难，浪费溶剂的问题。该方法包括下列步骤：

1)固液分离棘白菌素B发酵液，棘白菌素B即ECB；

2)大孔吸附树脂ADS-17或X-5富集；

3)大孔吸附树脂经热无水甲醇洗脱，合并洗脱液；

4)洗脱液浓缩，加氯化钠溶液，搅拌降温析晶，ECB粗品滤饼干燥。

5)ECB粗品滤饼用甲醇过滤后，滤液上D318离子交换树脂柱；

6)D318离子交换树脂柱洗脱液浓缩，加氯化钠溶液，搅拌降温析晶，ECB滤饼干燥；

7)收集ECB干品。

所述棘白菌素B发酵液由高产菌株CGMCC No.8987发酵制备。该菌种分类命名：构巢曲霉(Aspergillus nidulans)已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.8987，保藏日期2014年4月1日，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。

优选地，所述步骤1)，具体包括如下步骤：取菌丝体，加入助滤剂珍珠岩，板框过滤收集棘白菌素B菌饼；菌饼用原发酵液体积40-80％的丙酮浸泡，充分搅拌，加入以质量体积比g/100ml计为5％-15％的脱色除杂剂活性炭，搅拌均匀，直接板框过滤，收集滤液。

优选地，所述步骤2)，具体包括如下步骤：滤液加水调节丙酮浓度至20-40％，上大孔吸附树脂ADS-17或X-5富集。

优选地，所述步骤3)，具体包括如下步骤：无水甲醇加热至50℃，直接洗脱大孔吸附树脂，合并甲醇洗脱液。

优选地，所述步骤3)，所述无水甲醇洗脱大孔吸附树脂3～5个柱体积。

优选地，所述步骤4)，具体包括如下步骤：甲醇洗脱液浓缩至1倍柱体积左右，加等体积的以质量体积比g/100ml计浓度为5％-15％的氯化钠溶液，充分搅拌降温至2-10℃析晶，过滤得湿滤饼。

优选地，所述步骤4)，湿滤饼于30-40℃干燥，得ECB粗品滤饼。

优选地，所述步骤5)，ECB粗品滤饼用少量40-60％甲醇溶解，过滤掉不溶物，滤液上D318离子交换树脂柱。

优选地，所述步骤5)，D318离子交换树脂柱用体积比为65-90％甲醇磷酸缓冲液梯度洗脱，所述甲醇磷酸缓冲液中以体积比计甲醇：1％磷酸缓冲液＝65％-90％(其中65％即甲醇：1％磷酸缓冲液＝65：35)，HPLC检测洗脱液ECB纯度，收集并合并纯度95％以上的部分。

优选地，所述步骤6)，D318离子交换树脂柱洗脱液真空浓缩至乳白色浑浊，加等体积饱5％氯化钠溶液，充分搅拌，降温至0-10℃，沉淀物析出完全，直接过滤得湿滤饼。

优选地，所述步骤6)，湿滤饼于30-40℃干燥12h得干品。

进一步优选地，该方法包括下列步骤：

1)固液分离ECB发酵液，取菌丝体，加入助滤剂珍珠岩，板框过滤收集棘白菌素B菌饼；菌饼用原发酵液体积的40-80％丙酮浸泡，充分搅拌，脱色除杂剂活性炭0.5-2％(g/100ml)，搅拌均匀，直接板框过滤，收集滤液。

2)滤液加水调节丙酮浓度至20-40％，上大孔吸附树脂ADS-17或X-5富集。

3)无水甲醇加热至50℃，直接洗脱大孔吸附树脂3～5个柱体积，合并甲醇洗脱液。

4)甲醇洗脱液浓缩至1倍柱体积左右，加等体积的以质量体积比g/100ml计浓度为5％-15％的氯化钠溶液，充分搅拌降温至2-10℃，絮状沉淀析出完全，直接过滤得湿滤饼。滤饼于30-40℃干燥，得ECB粗品滤饼。

5)ECB粗品滤饼用少量40-60％甲醇溶解，过滤掉不溶物，滤液上D318离子交换树脂柱。用65-90％梯度甲醇磷酸缓冲液，HPLC检测洗脱液ECB纯度，收集并合并纯度大于95％部分。

6)洗脱液真空浓缩至乳白色浑浊，加等体积饱5％氯化钠溶液，充分搅拌，降温至0-10℃，沉淀物析出完全，直接过滤得湿滤饼，30-40℃干燥12h得干品。

7)收集ECB干品用于ECB转化生产。

本发明具有以下优点：

1.使用活性炭作为脱色剂和除杂剂，在浸提步骤使用，一次性除掉脂溶性色素和副产物柄曲霉素，避免了后续步骤大量析出物堵塞污染大孔吸附树脂柱的问题，有效简化工艺步骤。

2.含EchinocandinB洗脱液经盐析水沉法，所得滤饼粘度小，容易过滤收集，避免了蒸干操作引起的降解问题，适合工业化生产。

3.本发明纯化工艺最终提高EchinocandinB的纯度至99％以上，极大减轻转化后母核的纯化压力。

具体实施方式

现通过以下实施例来进一步描述本发明的有益效果，实施例仅用于例证的目的，不限制本发明的范围，同时本领域普通技术人员根据本发明所做的显而易见的改变和修饰也包含在本发明范围之内。

实施例1

取棘白菌素B发酵液(发酵单位743mg/L，柄曲霉素153mg/L)100L，加珍珠岩100g，板框过滤收集棘白菌素B菌饼；菌饼用100L50％丙酮充分浸泡，搅拌提取1小时，加入活性炭500g，再搅拌0.5小时。将浸提液板框过滤，收集浸提滤液，检测ECB浓度为725mg/L，柄曲霉素0mg/L。加水150L，调节滤液丙酮浓度为20％，上ADS17树脂柱(柱床体积10L，高径比4:1)，吸附完毕，自然流干。加热无水甲醇30L至50℃，洗脱ADS17树脂。洗脱液减压浓缩至15L，加入15L5％NaCl水溶液，搅拌降温至2℃，大量絮状物析出，真空抽滤得棘白菌素B粗品湿饼，30℃干燥24h，称重135g，棘白菌素B总收率86.6％，HPLC纯度55.6％。

实施例2

取棘白菌素B发酵液(发酵单位705mg/L，柄曲霉素125mg/L)100L，加珍珠岩100g，板框过滤收集棘白菌素B菌饼；菌饼用100L80％丙酮充分浸泡，搅拌提取1小时，加入活性炭2000g，再搅拌0.5小时。将浸提液板框过滤，收集浸提滤液，检测ECB浓度为694mg/L，柄曲霉素0mg/L。加水100L，调节滤液丙酮浓度为40％，上X-5树脂柱(柱床体积10L，高径比4:1)，吸附完毕，自然流干。加热无水甲醇50L至50℃，洗脱X-5树脂。洗脱液减压浓缩至15L，加入15L15％NaCl水溶液，搅拌降温至10℃，大量絮状物析出，真空抽滤得棘白菌素B粗品湿饼，40℃干燥12h，称重128g，棘白菌素B总收率91.0％，HPLC纯度57.1％。

实施例3

取棘白菌素B发酵液(发酵单位762mg/L，柄曲霉素103mg/L)100L，加珍珠岩100g，板框过滤收集棘白菌素B菌饼；菌饼用100L40％丙酮充分浸泡，搅拌提取1小时，加入活性炭500g，再搅拌0.5小时。将浸提液板框过滤，收集浸提滤液，检测ECB浓度为648mg/L，柄曲霉素0mg/L。加水100L，调节滤液丙酮浓度为20％，上ADS17树脂柱(柱床体积10L，高径比4:1)，吸附完毕，自然流干。加热无水甲醇30L至50℃，洗脱ADS17树脂。洗脱液减压浓缩至15L，加入15L5％NaCl水溶液，搅拌降温至2℃，大量絮状物析出，真空抽滤得棘白菌素B粗品湿饼，40℃干燥24h，称重115g，棘白菌素B总收率82.3％，HPLC纯度56.2％。

实施例4

取棘白菌素B发酵液(发酵单位773mg/L，柄曲霉素168mg/L)100L，加珍珠岩100g，板框过滤收集棘白菌素B菌饼；菌饼用100L60％丙酮充分浸泡，搅拌提取1小时，加入活性炭1500g，再搅拌0.5小时。将浸提液板框过滤，收集浸提滤液，检测ECB浓度为748mg/L，柄曲霉素0mg/L。加水70L，调节滤液丙酮浓度为35％，上X-5树脂柱(柱床体积10L，高径比4:1)，吸附完毕，自然流干。加热无水甲醇50L至50℃，洗脱X-5树脂。洗脱液减压浓缩至15L，加入15L10％NaCl水溶液，搅拌降温至10℃，大量絮状物析出，真空抽滤得棘白菌素B粗品湿饼，35℃干燥24h，称重125g，棘白菌素B总收率88.5％，HPLC纯度57.5％。

实施例5

称取实施例1棘白菌素B粗品10g溶于200ml50％甲醇，上样于D318离子交换树脂柱(柱床体积500ml，高径比10:1)，蠕动泵加压，梯度甲醇磷酸缓冲液(65％至90％)洗脱，检测洗脱液中ECB纯度，收集纯度大于95％部分合并液300ml，浓缩至100ml，加入100ml5％NaCl溶液，2℃下自然静置析出。抽滤得湿滤饼，30℃干燥，得ECB精制品5.1g，ECB收率90.2％，纯度99.6％。

实施例6

称取实施例2棘白菌素B粗品10g溶于200ml50％甲醇，上样于D318离子交换树脂柱(柱床体积500ml，高径比10:1)，蠕动泵加压，梯度甲醇磷酸缓冲液(65％至90％)洗脱，检测洗脱液中ECB纯度，收集纯度大于95％部分合并液300ml，浓缩至100ml，加入100ml15％NaCl溶液，10℃下自然静置析出。抽滤得湿滤饼，40℃干燥，得ECB精制品5.3g，ECB收率89.4％，纯度99.1％。

实施例7

称取实施例3棘白菌素B粗品10g溶于200ml50％甲醇，上样于D318离子交换树脂柱(柱床体积500ml，高径比10:1)，蠕动泵加压，梯度甲醇磷酸缓冲液(65％至90％)洗脱，检测洗脱液中ECB纯度，收集纯度大于95％部分合并液300ml，浓缩至100ml，加入100ml10％NaCl溶液，10℃下自然静置析出。抽滤得湿滤饼，35℃干燥，得ECB精制品5.1g， ECB收率89.8％，纯度99.6％。

实施例8

称取实施例4棘白菌素B粗品10g溶于200ml50％甲醇，上样于D318离子交换树脂柱(柱床体积500ml，高径比10:1)，蠕动泵加压，梯度甲醇磷酸缓冲液(65％至90％)洗脱，检测洗脱液中ECB纯度，收集纯度大于95％部分合并液300ml，浓缩至100ml，加入100ml5％NaCl溶液，2℃下自然静置析出。抽滤得湿滤饼，30℃干燥，得ECB精制品5.5g，ECB收率89.1％，纯度99.0％。

实施例9

称取实施例4棘白菌素B粗品10g溶于200ml50％甲醇，上样于反相填料层析柱CG161c，蠕动泵加压，梯度甲醇磷酸缓冲液(65％至90％)洗脱，检测洗脱液中ECB纯度，收集纯度大于95％部分合并液300ml，浓缩至100ml，加入100ml5％NaCl溶液，2℃下自然静置析出。抽滤得湿滤饼，30℃干燥，得ECB精制品5.5g，ECB收率78.5％，纯度96.6％。

实施例10

称取实施例4棘白菌素B粗品10g溶于200ml50％甲醇，上样于C18反相硅胶柱，反相硅胶以50％甲醇浸泡3h后上柱，蠕动泵加压，梯度甲醇(65％至90％)洗脱，检测洗脱液中ECB纯度，收集纯度大于95％部分合并液300ml，浓缩至100ml，加入100ml5％NaCl溶液，2℃下自然静置析出。抽滤得湿滤饼，30℃干燥，得ECB精制品5.5g，ECB收率78.0％，纯度96.8％。

Claims

1.一种抗真菌环脂肽棘白菌素B的制备方法，其特征在于，该方法包括下列步骤：

1)固液分离棘白菌素B发酵液，棘白菌素B即ECB，具体包括如下步骤：取菌丝体，加入助滤剂珍珠岩，板框过滤收集棘白菌素B菌饼；菌饼用原发酵液体积40-80％的丙酮浸泡，充分搅拌，脱色除杂剂活性炭以质量体积比g/100ml计为0.5-2，搅拌均匀，直接板框过滤，收集滤液；

2)大孔吸附树脂ADS-17或X-5富集，具体包括如下步骤：滤液加水调节丙酮浓度至20-40％，上大孔吸附树脂ADS-17或X-5富集；

3)大孔吸附树脂经热无水甲醇洗脱，合并洗脱液，具体包括如下步骤：无水甲醇加热至45-50℃，直接洗脱大孔吸附树脂，合并甲醇洗脱液；所述无水甲醇洗脱大孔吸附树脂3～5个柱体积；

4)洗脱液浓缩，加氯化钠溶液，搅拌降温析晶，ECB粗品滤饼干燥，具体包括如下步骤：甲醇洗脱液浓缩至1倍柱体积左右，加等体积的以质量体积比g/100ml计浓度为5％-15％的氯化钠溶液，充分搅拌降温至2-10℃析晶，过滤得湿滤饼；湿滤饼于30-40℃干燥，得ECB粗品滤饼；

5)ECB粗品滤饼用甲醇过滤后，滤液上D318离子交换树脂柱，具体包括如下步骤：ECB粗品滤饼用少量40-60％甲醇溶解，过滤掉不溶物，滤液上D318离子交换树脂柱，D318离子交换树脂柱用65-90％甲醇磷酸缓冲液梯度洗脱，HPLC检测洗脱液ECB纯度，收集并合并纯度95％以上的部分；

6)D318离子交换树脂柱洗脱液浓缩，加氯化钠溶液，搅拌降温析晶，ECB滤饼干燥，具体包括如下步骤：D318离子交换树脂柱洗脱液真空浓缩至乳白色浑浊，加等体积5％氯化钠溶液，充分搅拌，降温至0-10℃，沉淀物析出完全，直接过滤得湿滤饼；湿滤饼于30-40℃干燥12h得干品；

7)收集ECB干品。

2.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述棘白菌素B发酵液由高产菌株CGMCC No.8987发酵制备。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，该方法包括下列步骤：

1)固液分离ECB发酵液，取菌丝体，加入助滤剂珍珠岩，板框过滤收集棘白菌素B菌饼；菌饼用原发酵液体积的40-80％丙酮浸泡，充分搅拌，加入以质量体积比g/100ml计为0.5-2的脱色除杂剂活性炭，搅拌均匀，直接板框过滤，收集滤液；

2)滤液加水调节丙酮浓度至20-40％，上大孔吸附树脂ADS-17或X-5富集；

3)无水甲醇加热至50℃，直接洗脱大孔吸附树脂3～5个柱体积，合并甲醇洗脱液；

4)甲醇洗脱液浓缩至1倍柱体积左右，加等体积的以质量体积比g/100ml计浓度为5％-15％的氯化钠溶液，充分搅拌降温至2-10℃，絮状沉淀析出完全，直接过滤得湿滤饼，滤饼于30-40℃干燥，得ECB粗品滤饼；

5)ECB粗品滤饼用少量40-60％甲醇溶解，过滤掉不溶物，滤液上D318离子交换树脂柱；用65-90％甲醇磷酸缓冲液梯度洗脱，HPLC检测洗脱液ECB纯度，收集并合并纯度大于95％部分；

6)洗脱液真空浓缩至乳白色浑浊，加等体积5％氯化钠溶液，充分搅拌，降温至0-10℃，沉淀物析出完全，直接过滤得湿滤饼，30-40℃干燥12h得干品；

7)收集ECB干品用于ECB转化生产。