CN102190691A - 制备高纯度表柔红霉素的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种制备表柔红霉素的方法，所述方法包括以下步骤：a)预处理后的表柔红霉素发酵液上大孔弱酸树脂，用添加盐酸的丙酮或甲醇水溶液进行洗脱；b)将表柔红霉素洗脱液蒸干后溶于水中，然后用氯仿进行萃取；c)表柔红霉素萃取液上非极性吸附树脂，再用丙酮水溶液进行洗脱，制得表柔红霉素。本发明方法步骤简单、适合大规模工业生产、具有很好的商业价值，并且本发明方法所得的表柔红霉素的最终纯度将提高到97％以上。
Description
技术领域
本发明涉及抗肿瘤药物表阿霉素的前体表柔红霉素的制备方法，具体而言，涉及采用微生物发酵法制备高纯度表柔红霉素的方法。
背景技术
柔红霉素以及以其为原料合成的阿霉素(doxorubin)、表阿霉素(epirubicin)是目前临床上十分重要的抗肿瘤蒽环类抗生素。表阿霉素的心脏毒性和骨髓毒性比阿霉素更低，而抗肿瘤的效果相当或更高。表柔红霉素(4’-epi-daunorubicin)是工业生产表阿霉素的重要前体，其与柔红霉素的差别仅在于分子中脱氧糖C4位羟基构型不同。由化学合成法从柔红霉素到表柔红霉素需要经过多步条件要求苛刻的反应过程，并会造成环境污染。如果采用微生物发酵方法直接生产表柔红霉素将会大大节约成本，提高效率。目前现有技术可以采用微生物发酵方法直接生产表柔红霉素，但发酵产物的产量较低。
文献 Production of the antitumor drug epirubicin and its precursor by agenetically engineered strain of
该方法步骤烦琐，且必须使用硅胶为介质的反向层析填料来完成分离纯化工艺。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种步骤简单、适合大规模工业生产、具有很好的商业价值的提取微生物发酵产生的表柔红霉素的方法。尤为重要的是，本发明方法所得的表柔红霉素的最终纯度将提高到97％以上。
本发明所述的制备表柔红霉素的方法包括以下步骤：
a)预处理后的表柔红霉素发酵液上大孔弱酸树脂，用添加盐酸的丙酮或甲醇水溶液进行洗脱；
b)将表柔红霉素洗脱液蒸干后溶于水中，然后用氯仿进行萃取；
c)表柔红霉素萃取液上非极性吸附树脂，再用丙酮水溶液进行洗脱，制得表柔红霉素。
本发明中，表柔红霉素发酵液的预处理过程按照下列步骤进行：取表柔红霉素发酵液，将其pH值调至3-5，离心，取菌丝体，用丙酮或甲醇水溶液抽提，蒸干抽提液，用蒸馏水溶解，抽滤，即得所述预处理后的表柔红霉素发酵液。
根据本发明，将所述预处理后的表柔红霉素发酵液的pH值调整为5-8，优选调整为7.0。
根据本发明的一个优选的实施方式，表柔红霉素发酵液的预处理过程按照下列步骤进行：表柔红霉素发酵液调pH为3.0，静置一段时间后高速离心取菌丝体，用1.5倍体积的丙酮抽提菌丝体中表柔红霉素，抽滤除去菌丝体，即得预处理后的表柔红霉素发酵液。
上述表柔红霉素发酵液的预处理步骤可以对发酵液进行初步纯化，得到纯度为5％左右的表柔红霉素发酵液。但是，该预处理步骤不是必须的，也可以直接对表柔红霉素发酵液进行以下处理。
表柔红霉素发酵液中的杂质非常多。发明人通过筛选各种树脂，发现当表柔红霉素水溶液经过大孔弱酸吸附树脂时，很多极性杂质吸附不上去，而表柔红霉素能够很好的被交换吸附上去。本发明所述大孔弱酸树脂的型号可以包括CD40和D152。
根据上述方法的步骤a)，所述第一种有机溶剂选自丙酮或甲醇，优选第一种有机溶剂为丙酮。所述丙酮的浓度可以是20-80％，该浓度越高越好，但考虑到成本问题，优选50％的丙酮，当用50％的酸性丙酮水洗脱液洗脱时表柔红霉素被完全洗下，而很多非极性的杂质保留在树脂上，从而提高了表柔红霉素的纯度。
根据本发明一个优选的实施方式，a)步骤中所添加HCl的浓度可以为0.01-0.1N，优选0.05N。
通过步骤a)，可以得到纯度为20％左右的表柔红霉素洗脱液。
根据上述方法的步骤b)，所用氯仿的体积优选为和表柔红霉素水溶液的体积相等，且氯仿的浓度优选为100％。水相和氯仿相的比例没有严格的限定，但每一相的比例不能少于两相体积之和的30％。
该步骤的主要作用是除去了大部分的水溶性杂质，使得表柔红霉素的纯度有较大的提高。同时，它也除去了一些极性低的杂质。
优选所述b)步骤采用调节pH的方法进行萃取和反萃取。具体而言，先将所述pH调至8-9，将表柔红霉素萃取到氯仿有机溶剂相中，再将pH调至3-5，将表柔红霉素反萃取到水相。
根据本发明一个优选的实施方式，根据b)步骤将表柔红霉素洗脱液蒸干溶于水后，用氯仿-水体系进行萃取，当调节pH为8-9时，表柔红霉素主要在氯仿相，而当调节pH在3-5时，表柔红霉素主要在在水相，因此采用调节pH的方法先将表柔红霉素萃取到氯仿相中，再反萃取到水相，从而除去杂质。
通过步骤b)，可以得到纯度为71％左右的表柔红霉素萃取液。
根据上述方法的步骤c)，所述非极性吸附树脂为反相吸附树脂，优选的型号是微球1号。
根据本发明一个优选的实施方式，将步骤b)得到的表柔红霉素萃取液上反相层析柱，用1∶1的丙酮水溶液进行洗脱，分步接收，收集纯度较高的部分。该步骤的主要作用是通过反向层析得到纯度较高的表柔红霉素，采用1∶1的丙酮水溶液洗脱时表柔红霉素与杂质有很好的分离度。
通过步骤c)，可以得到纯度为97％左右的表柔红霉素。
因此，本发明制备表柔红霉素的方法的总收率在20％以上，最高可达45％以上；最终表柔红霉素的纯度为94％以上，最高可达97％以上。
与前述文献的工艺相比，本方法步骤及设备简单，却同样能达到文献工艺的纯度，因而更加适合工业化生产。
具体实施方式
本发明表柔红霉素发酵条件如下：
本发明实施例1-10采用以下菌种：Streptomyces peucetius，保藏号为ATCC 29050，购自美国微生物保藏中心。实施例11-14采用其他类似菌种。
培养配方：
斜面：高氏培养基
种子培养基(g/L)：淀粉20，酵母浸膏20，葡萄糖20，
麸皮20，MgSO4.7H2O1；
种子培养条件：28℃，220rpm，36h
接种量：10％
发酵培养基(g/L)：黄豆饼粉60，葡萄糖10，麸皮20，K2HPO4.3H2O0.5，(NH4)2SO42，豆粕10-15，MgSO4.7H2O 0.5，淀粉酶1。
发酵培养条件：28℃，220rpm，6天
表柔红霉素的HPLC检测条件：
色谱柱：agilent C184.6*250mm；
检测波长：254nm；
流动相：0.2％H3PO4∶MeOH＝45∶55；
流速：0.800ml/min
柱温：40℃
实施例1-2考察不同来源的发酵液对分离工艺的影响
实施例1
表柔红霉素发酵液的预处理过程：
取发酵液1000ml，其纯度为1.6％，单位为24ug/ml，将发酵液pH调为3.0后静置一段时间，高速离心后弃去上清液，用1倍的丙酮浸取其中的表柔红霉素，过滤除去菌丝体，再将丙酮蒸干后用水溶解表柔红霉素，同样过滤除去其中的不溶物，检测其纯度为3.2％。
表柔红霉素的制备方法：
装一根高约20cm，直径约为4cm的大孔弱酸离子交换柱，将表柔红霉素的水溶液以2ml/min的流速过柱，表柔红霉素完全被吸附在柱上，再用1∶1的丙酮水(0.01MHCl)洗脱柱子，收集全部洗脱液，其纯度为23.2％。
将表柔红霉素洗脱液中丙酮蒸去，调节水溶液pH为8.0，加入等体积氯仿充分混匀，静置30分钟，弃去水相。再在氯仿相中加入等体积蒸馏水，调pH为3.0，充分混匀，静置30分钟，弃去氯仿相。检测发现纯度为69.8％。
装一根高约20cm，直径约为4cm的微球一号层析柱，将表柔红霉素的水溶液以2ml/min的流速过柱，再用1∶1的丙酮水洗脱柱子，分步收集洗脱液中纯度较高的部分，检测发现纯度为97.3％。以上几步的总收率约为48％。
实施例2
表柔红霉素发酵液的预处理过程：
取发酵液1000ml，其纯度为2.2％，单位为21ug/ml，将发酵液pH调为5.0后静置一段时间，高速离心后弃去上清液，用2倍的丙酮浸取其中的表柔红霉素，过滤除去菌丝体，再将丙酮蒸干后用水溶解表柔红霉素，同样过滤除去其中的不溶物，检测其纯度为3.5％。
表柔红霉素的制备方法：
装一根高约20cm，直径约为4cm的D152交换柱，将表柔红霉素的水溶液以2ml/min的流速过柱，表柔红霉素完全被吸附在柱上，再用1∶1的丙酮水(0.05MHCl)洗脱柱子，收集全部洗脱液，其纯度为26.4％。
将表柔红霉素洗脱液中丙酮蒸去，调节水溶液pH为9.0，加入等体积氯仿充分混匀，静置30分钟，弃去水相。再在氯仿相中加入等体积蒸馏水，调pH为5.0，充分混匀，静置30分钟，弃去氯仿相。检测发现纯度为72.1％。
装一根高约20cm，直径约为4cm的微球一号层析柱，将表柔红霉素的水溶液以2ml/min的流速过柱，再用1∶1的丙酮水洗脱柱子，分步收集洗脱液中纯度较高的部分，检测发现纯度为96.9％。以上几步的总收率约为53％。
实施例3-5考察不同的抽提溶剂对分离工艺的影响
实施例3
表柔红霉素发酵液的预处理过程：
取发酵液1000ml，其纯度为1.8％，单位为19ug/ml，将发酵液pH调为3.0后静置一段时间，高速离心后弃去上清液，用3倍的甲醇浸取其中的表柔红霉素，过滤除去菌丝体，再将甲醇蒸干后用水溶解表柔红霉素，同样过滤除去其中的不溶物，检测其纯度为3.5％。
表柔红霉素的制备方法：
装一根高约20cm，直径约为4cm的D152离子交换柱，将表柔红霉素的水溶液以2ml/min的流速过柱，表柔红霉素完全被吸附在柱上，再用1∶1的丙酮水(0.1MHCl)洗脱柱子，收集全部洗脱液，其纯度为24.8％。
将表柔红霉素洗脱液中丙酮蒸去，调节水溶液pH为9.0，加入等体积氯仿充分混匀，静置30分钟，弃去水相。再在氯仿相中加入等体积蒸馏水，调pH为3.0，充分混匀，静置30分钟，弃去氯仿相。检测发现纯度为68.7％。
装一根高约20cm，直径约为4cm的反向吸附层析柱，将表柔红霉素的水溶液以2ml/min的流速过柱，再用1∶1的丙酮水洗脱柱子，分步收集洗脱液中纯度较高的部分，检测发现纯度为95.9％。以上几步的总收率约为49％。
实施例4
表柔红霉素发酵液的预处理过程：
取发酵液1000ml，其纯度为1.3％，单位为22ug/ml，将发酵液pH调为3.0后静置一段时间，高速离心后弃去上清液，用2倍的丙酮浸取其中的表柔红霉素，过滤除去菌丝体，再将丙酮蒸干后用水溶解表柔红霉素，同样过滤除去其中的不溶物，检测其纯度为2.9％。
表柔红霉素的制备方法：
装一根高约20cm，直径约为4cm的D152离子交换柱，将表柔红霉素的水溶液以2ml/min的流速过柱，表柔红霉素完全被吸附在柱上，再用1∶1的丙酮水(0.01MHCl)洗脱柱子，收集全部洗脱液，其纯度为19.5％。
将表柔红霉素洗脱液中丙酮蒸去，调节水溶液pH为9.0，加入等体积氯仿充分混匀，静置30分钟，弃去水相。再在氯仿相中加入等体积蒸馏水，调pH为4.0，充分混匀，静置30分钟，弃去氯仿相。检测发现纯度为67.5％。
装一根高约20cm，直径约为4cm的微球一号层析柱，将表柔红霉素的水溶液以2ml/min的流速过柱，再用1∶1的丙酮水洗脱柱子，分步收集洗脱液中纯度较高的部分，检测发现纯度为97.2％。以上几步的总收率约为50％。
实施例5
表柔红霉素发酵液的预处理过程：
取发酵液1000ml，其纯度为2.1％，单位为26ug/ml，将发酵液pH调为3.0后静置一段时间，高速离心后弃去上清液，用1.5倍的甲醇浸取其中的表柔红霉素，过滤除去菌丝体，再将乙醇蒸干后用水溶解表柔红霉素，同样过滤除去其中的不溶物，检测其纯度为3.7％。
表柔红霉素的制备方法：
装一根高约20cm，直径约为4cm的D152离子交换柱，将表柔红霉素的水溶液以2ml/min的流速过柱，表柔红霉素完全被吸附在柱上，再用3∶1的丙酮水(0.01MHCl)洗脱柱子，收集全部洗脱液，其纯度为26.4％。
将表柔红霉素洗脱液中丙酮蒸去，调节水溶液pH为9.0，加入等体积氯仿充分混匀，静置30分钟，弃去水相。再在氯仿相中加入等体积蒸馏水，调pH为3.0，充分混匀，静置30分钟，弃去氯仿相。检测发现纯度为69.8％。
装一根高约20cm，直径约为4cm的微球一号层析柱，将表柔红霉素的水溶液以2ml/min的流速过柱，再用1∶1的丙酮水洗脱柱子，分步收集洗脱液中纯度较高的部分，检测发现纯度为96.8％。以上几步的总收率约为49％。
实施例6-7考察不同大孔弱酸吸附树脂对分离的影响
实施例6
表柔红霉素发酵液的预处理过程：
取发酵液1000ml，其纯度为2.0％，单位为17ug/ml，将发酵液pH调为4.0后静置一段时间，高速离心后弃去上清液，用2倍的丙酮浸取其中的表柔红霉素，过滤除去菌丝体，再将丙酮蒸干后用水溶解表柔红霉素，同样过滤除去其中的不溶物，检测其纯度为3.5％。
表柔红霉素的制备方法：
装一根高约20cm，直径约为4cm的CD40离子交换柱，将表柔红霉素的水溶液以2ml/min的流速过柱，表柔红霉素完全被吸附在柱上，再用1∶1的丙酮水(0.01MHCl)洗脱柱子，收集全部洗脱液，其纯度为28.6％。
将表柔红霉素洗脱液中丙酮蒸去，调节水溶液pH为9.0，加入等体积氯仿充分混匀，静置30分钟，弃去水相。再在氯仿相中加入等体积蒸馏水，调pH为3.0，充分混匀，静置30分钟，弃去氯仿相。检测发现纯度为70.2％。
装一根高约20cm，直径约为4cm的微球一号层析柱，将表柔红霉素的水溶液以2ml/min的流速过柱，再用1∶1的丙酮水洗脱柱子，分步收集洗脱液中纯度较高的部分，检测发现纯度为97.3％。以上几步的总收率约为51％。
实施例7
表柔红霉素发酵液的预处理过程：
取发酵液1000ml，其纯度为2.5％，单位为20ug/ml，将发酵液pH调为3.0后静置一段时间，高速离心后弃去上清液，用1.5倍的丙酮浸取其中的表柔红霉素，过滤除去菌丝体，再将丙酮蒸干后用水溶解表柔红霉素，同样过滤除去其中的不溶物，检测其纯度为3.9％。
表柔红霉素的制备方法：
装一根高约20cm，直径约为4cm的D152大孔弱酸离子交换柱，将表柔红霉素的水溶液以2ml/min的流速过柱，表柔红霉素全部被吸附在柱上，再用1∶1的丙酮水(0.01MHCl)洗脱柱子，收集全部洗脱液，其纯度为21.5％。
将表柔红霉素洗脱液中丙酮蒸去，调节水溶液pH为9.0，加入等体积氯仿充分混匀，静置30分钟，弃去水相。再在氯仿相中加入等体积蒸馏水，调pH为3.0，充分混匀，静置30分钟，弃去氯仿相。检测发现纯度为67.5％。
装一根高约20cm，直径约为4cm的反向吸附层析柱，将表柔红霉素的水溶液以2ml/min的流速过柱，再用1∶1的丙酮水洗脱柱子，分步收集洗脱液中纯度较高的部分，检测发现纯度为96.4％。以上几步的总收率约为45％。
实施例8、9考察不同的吸附树脂对分离的影响
实施例8
表柔红霉素发酵液的预处理过程：
取发酵液1000ml，其纯度为1.8％，单位为16ug/ml，将发酵液pH调为3.0后静置一段时间，高速离心后弃去上清液，用2倍的丙酮浸取其中的表柔红霉素，过滤除去菌丝体，再将丙酮蒸干后用水溶解表柔红霉素，同样过滤除去其中的不溶物，检测其纯度为3.5％。
表柔红霉素的制备方法：
装一根高约20cm，直径约为4cm的CD40弱酸离子交换柱，将表柔红霉素的水溶液以2ml/min的流速过柱，表柔红霉素完全被吸附在柱上，再用1∶1的丙酮水(0.01MHCl)洗脱柱子，收集全部洗脱液，其纯度为25.4％。
将表柔红霉素洗脱液中丙酮蒸去，调节水溶液pH为9.0，加入等体积氯仿充分混匀，静置30分钟，弃去水相。再在氯仿相中加入等体积蒸馏水，调pH为3.0，充分混匀，静置30分钟，弃去氯仿相。检测发现纯度为72.1％。
装一根高约20cm，直径约为4cm的反相吸附树脂1400，将表柔红霉素的水溶液以2ml/min的流速过柱，再用1∶1的丙酮水洗脱柱子，分步收集洗脱液中纯度较高的部分，检测发现纯度为94.8％。以上几步的总收率约为52％。
实施例9
表柔红霉素发酵液的预处理过程：
取发酵液1000ml，其纯度为1.7％，单位为18ug/ml，将发酵液pH调为3.0后静置一段时间，高速离心后弃去上清液，用2.5倍的丙酮浸取其中的表柔红霉素，过滤除去菌丝体，再将丙酮蒸干后用水溶解表柔红霉素，同样过滤除去其中的不溶物，检测其纯度为3.9％。
表柔红霉素的制备方法：
装一根高约20cm，直径约为4cm的D152离子交换柱，将表柔红霉素的水溶液以2ml/min的流速过柱，表柔红霉素完全被吸附在柱上，再用1∶1的丙酮水(0.01MHCl)洗脱柱子，收集全部洗脱液，其纯度为27.3％。
将表柔红霉素洗脱液中丙酮蒸去，调节水溶液pH为9.0，加入等体积氯仿充分混匀，静置30分钟，弃去水相。再在氯仿相中加入等体积蒸馏水，调pH为3.0，充分混匀，静置30分钟，弃去氯仿相。检测发现纯度为72.5％。
装一根高约20cm，直径约为4cm的反相吸附YPRII，将表柔红霉素的水溶液以2ml/min的流速过柱，再用1∶1的丙酮水洗脱柱子，分步收集洗脱液中纯度较高的部分，检测发现纯度为95.0％。以上几步的总收率约为47％。
实施例10
表柔红霉素发酵液的预处理过程：
取发酵液1000ml，其纯度为1.9％，单位为23ug/ml，将发酵液pH调为3.0后静置一段时间，高速离心后弃去上清液，用1.5倍的丙酮浸取其中的表柔红霉素，过滤除去菌丝体，再将丙酮蒸干后用水溶解表柔红霉素，同样过滤除去其中的不溶物，检测其纯度为3.5％。
表柔红霉素的制备方法：
装一根高约20cm，直径约为4cm的D152离子交换柱，将表柔红霉素的水溶液以2ml/min的流速过柱，表柔红霉素完全被吸附在柱上，再用1∶1的丙酮水(0.05MHCl)洗脱柱子，收集全部洗脱液，其纯度为25.4％。
将表柔红霉素洗脱液中丙酮蒸去，调节水溶液pH为9.0，加入等体积氯仿充分混匀，静置30分钟，弃去水相。再在氯仿相中加入等体积蒸馏水，调pH为3.0，充分混匀，静置30分钟，弃去氯仿相。检测发现纯度为68.8％。
装一根高约20cm，直径约为4cm的反相吸附树脂微球一号，将表柔红霉素的水溶液以2ml/min的流速过柱，再用1∶1的丙酮水洗脱柱子，分步收集洗脱液中纯度较高的部分，检测发现纯度为97.9％。以上几步的总收率约为48％。
实施例11-14比较不同菌种来源的发酵液的分离效果
实施例11
采用天蓝淡红链霉菌ATCC29050进行发酵培养，取发酵液1000ml，其纯度为2.1％，单位为21ug/ml，将发酵液pH调为3.0后静置一段时间，高速离心后弃去上清液，用1.5倍的丙酮浸取其中的表柔红霉素，过滤除去菌丝体，再将丙酮蒸干后用水溶解表柔红霉素，同样过滤除去其中的不溶物，检测其纯度为3.7％。
表柔红霉素的制备方法：
装一根高约20cm，直径约为4cm的D152离子交换柱，将表柔红霉素的水溶液以2ml/min的流速过柱，表柔红霉素完全被吸附在柱上，再用1∶1的丙酮水(0.05MHCl)洗脱柱子，收集全部洗脱液，其纯度为27.3％。
将表柔红霉素洗脱液中丙酮蒸去，调节水溶液pH为9.0，加入等体积氯仿充分混匀，静置30分钟，弃去水相。再在氯仿相中加入等体积蒸馏水，调pH为3.0，充分混匀，静置30分钟，弃去氯仿相。检测发现纯度为71.2％。
装一根高约20cm，直径约为4cm的反相吸附树脂微球一号，将表柔红霉素的水溶液以2ml/min的流速过柱，再用1∶1的丙酮水洗脱柱子，分步收集洗脱液中纯度较高的部分，检测发现纯度为96.9％。以上几步的总收率约为47％。
实施例12
采用天蓝淡红链霉菌mYG1118进行发酵培养。该菌株由上海医工院保藏，是以表柔红霉素产生菌mHJ-02-30-1为原始菌株，构建含有两个aveBVI表达单元的整合型质粒，并将其转入mHJ-02-30-1中，使菌株内aveBVI的表达单元数由1个增加到3个，由于增加aveBIV基因表达单元数可以提高表柔红霉素的产量，其发酵单位比mHJ-02-30-1提高了1倍。
取天蓝淡红链霉菌mYG1118的发酵液1000ml，其纯度为3.3％，单位为64ug/ml，将发酵液pH调为3.0后静置一段时间，高速离心后弃去上清液，用1.5倍的丙酮浸取其中的表柔红霉素，过滤除去菌丝体，再将丙酮蒸干后用水溶解表柔红霉素，同样过滤除去其中的不溶物，检测其纯度为4.3％。
表柔红霉素的制备方法：
装一根高约20cm，直径约为4cm的D152离子交换柱，将表柔红霉素的水溶液以2ml/min的流速过柱，表柔红霉素完全被吸附在柱上，再用1∶1的丙酮水(0.05MHCl)洗脱柱子，收集全部洗脱液，其纯度为31.2％。
将表柔红霉素洗脱液中丙酮蒸去，调节水溶液pH为9.0，加入等体积氯仿充分混匀，静置30分钟，弃去水相。再在氯仿相中加入等体积蒸馏水，调pH为3.0，充分混匀，静置30分钟，弃去氯仿相。检测发现纯度为74.1％。
装一根高约20cm，直径约为4cm的反相吸附树脂微球一号，将表柔红霉素的水溶液以2ml/min的流速过柱，再用1∶1的丙酮水洗脱柱子，分步收集洗脱液中纯度较高的部分，检测发现纯度为97.6％。以上几步的总收率约为48％。
实施例13
采用天蓝淡红链霉菌mHJ-02-30-1进行发酵培养。该菌株由上海医工院保藏，是以柔红霉素产生菌SIPI-1482(医工院保藏，可购买得到)为原始菌株构建的基因工程菌，具体操作为将红霉素启动子和aveBIV基因插入柔红糖胺的生物合成基因dnmV内部，置换dnmV基因中间199bp的碱基，保持剩下的dnmV基因的两端的碱基和编码氨基酸不变，从而最大限度的减少中断dnmV和插入aveBIV基因对上下游基因的影响，其发酵单位稳定在35mg/L。
取天蓝淡红链霉菌mHJ-02-30-1的发酵液1000ml，其纯度为2.9％，单位为34ug/ml，将发酵液pH调为3.0后静置一段时间，高速离心后弃去上清液，用1.5倍的丙酮浸取其中的表柔红霉素，过滤除去菌丝体，再将丙酮蒸干后用水溶解表柔红霉素，同样过滤除去其中的不溶物，检测其纯度为4.1％。
表柔红霉素的制备方法：
装一根高约20cm，直径约为4cm的D152离子交换柱，将表柔红霉素的水溶液以2ml/min的流速过柱，表柔红霉素完全被吸附在柱上，再用1∶1的丙酮水(0.05MHCl)洗脱柱子，收集全部洗脱液，其纯度为29.4％。
将表柔红霉素洗脱液中丙酮蒸去，调节水溶液pH为9.0，加入等体积氯仿充分混匀，静置30分钟，弃去水相。再在氯仿相中加入等体积蒸馏水，调pH为3.0，充分混匀，静置30分钟，弃去氯仿相。检测发现纯度为69.8％。
装一根高约20cm，直径约为4cm的反相吸附树脂微球一号，将表柔红霉素的水溶液以2ml/min的流速过柱，再用1∶1的丙酮水洗脱柱子，分步收集洗脱液中纯度较高的部分，检测发现纯度为97.1％。以上几步的总收率约为46％。
实施例14
采用天蓝淡红链霉菌mYG1116E进行发酵培养。该菌株由上海医工院保藏，是以表柔红霉素产生菌mHJ-02-30-1为原始菌株，通过同源重组双交换的方法对其旁路代谢的dnrU基因进行敲除得到的工程菌，其发酵单位比mHJ-02-30-1提高了约40％。
取天蓝淡红链霉菌mYG1116E的发酵液1000ml，其纯度为3.4％，单位为52ug/ml，将发酵液pH调为3.0后静置一段时间，高速离心后弃去上清液，用1.5倍的丙酮浸取其中的表柔红霉素，过滤除去菌丝体，再将丙酮蒸干后用水溶解表柔红霉素，同样过滤除去其中的不溶物，检测其纯度为3.9％。
表柔红霉素的制备方法：
装一根高约20cm，直径约为4cm的D152离子交换柱，将表柔红霉素的水溶液以2ml/min的流速过柱，表柔红霉素完全被吸附在柱上，再用1∶1的丙酮水(0.05MHCl)洗脱柱子，收集全部洗脱液，其纯度为27.9％。
将表柔红霉素洗脱液中丙酮蒸去，调节水溶液pH为9.0，加入等体积氯仿充分混匀，静置30分钟，弃去水相。再在氯仿相中加入等体积蒸馏水，调pH为3.0，充分混匀，静置30分钟，弃去氯仿相。检测发现纯度为65.1％。
装一根高约20cm，直径约为4cm的反相吸附树脂微球一号，将表柔红霉素的水溶液以2ml/min的流速过柱，再用1∶1的丙酮水洗脱柱子，分步收集洗脱液中纯度较高的部分，检测发现纯度为94.1％。以上几步的总收率约为49％。
Claims (17)
1.制备表柔红霉素的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
a)预处理后的表柔红霉素发酵液上大孔弱酸树脂，用添加盐酸的丙酮或甲醇水溶液进行洗脱；
b)将表柔红霉素洗脱液蒸干后溶于水中，然后用氯仿进行萃取；
c)表柔红霉素萃取液上非极性吸附树脂，再用丙酮水溶液进行洗脱，制得表柔红霉素。
2.根据权利要求1所述的制备表柔红霉素的方法，其特征在于，所述预处理后的表柔红霉素发酵液按照下列步骤得到：取表柔红霉素发酵液，将其pH值调至3-5，离心，取菌丝体，用丙酮或甲醇水溶液抽提，蒸干抽提液，用蒸馏水溶解，抽滤，即得所述预处理后的表柔红霉素发酵液。
3.根据权利要求1或2所述的制备表柔红霉素的方法，其特征在于，将预处理后的表柔红霉素发酵液的pH值调整为5-8。
4.根据权利要求3所述的制备表柔红霉素的方法，其特征在于，将预处理后的表柔红霉素发酵液的pH值调整为7.0。
5.根据权利要求1-4任一所述的制备表柔红霉素的方法，其特征在于，a)步骤中所述盐酸的浓度为0.01-0.1N。
6.根据权利要求5所述的制备表柔红霉素的方法，其特征在于，a)步骤中所述盐酸的浓度为0.05。
7.根据权利要求1所述的制备表柔红霉素的方法，其特征在于，a)步骤中所述丙酮或甲醇水溶液的浓度为20-80％。
8.根据权利要求7所述的制备表柔红霉素的方法，其特征在于，a)步骤中所述丙酮或甲醇水溶液的浓度为50％。
9.根据权利要求1所述的制备表柔红霉素的方法，其特征在于，c)步骤中所述丙酮水溶液的浓度为30-70％。
10.根据权利要求9所述的制备表柔红霉素的方法，其特征在于，c)步骤中所述丙酮水溶液的浓度为50％。
11.根据权利要求1-10任一所述的制备表柔红霉素的方法，其特征在于，所述丙酮或甲醇水溶液所用的体积为菌丝体的1-3倍。
12.根据权利要求10所述的制备表柔红霉素的方法，其特征在于，所述第一种溶剂所用的体积为菌丝体的2倍。
13.根据权利要求1至12任一所述的制备表柔红霉素的方法，其特征在于，a)步骤所述大孔弱酸树脂的型号选自D152或CD40。
14.根据权利要求1至13任一所述的制备表柔红霉素的方法，其特征在于，c)步骤所述非极性吸附树脂为反相吸附树脂。
15.根据权利要求14所述的制备表柔红霉素的方法，其特征在于，所述反相吸附树脂的型号为微球1号。
16.根据权利要求1-15任一所述的制备表柔红霉素的方法，其特征在于，b)步骤采用调节pH的方法进行萃取和反萃取。
17.根据权利要求16所述的制备表柔红霉素的方法，其特征在于，先将所述pH调至8-9，将表柔红霉素萃取到氯仿有机溶剂相中，再将pH调至3-5，将表柔红霉素反萃取到水相。
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