JPS6158593A - 新規サフラマイシンａ誘導体およびその製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は新規な抗生物質であるサフラマイシンＡ誘導体
に関し、またこれの製造法に関する。

抗菌活性、抗腫瘍活性を示す抗生物質としてサフラマイ
シンＡ、Ｂ、Ｃ，Ｄ及びＥがストレプトマイセス　ラペ
ンデュレＡ３１８株によって生産されることは知られて
いる（特開昭５４−４４０９ｇ号公報・米国特許第４．
２４８，８６３号明細書参照）。これらサクシマイシン
類のうち、サフラマイシンＡが最も活性が高いが、本発
明によるサフラマイシンＡ誘導体はサフラマイシン人よ
りも更に活性が増強されているものである。

従来の技術 本発明者らは、歴史的な抗生物質であるストレフトスリ
シンを生産する放線菌として知られるストレプトマイセ
ス・ラペンデュレ墓３１４株の生産する抗生物質の微量
成分を独特なスクリーニング法で検出し、これら成分を
特殊な培養環境で多量に生産させることを考案して上記
サフラマイシンＡ、Ｂ、Ｃ，Ｄ、Ｅを先に発見した（前
出の特開昭公報）。これらは共通して、それ迄天然には
発見されていないイソキノリン抗生物質であるミモサマ
イシン（特公昭５７−５３０７５号）の二量体を分子の
母格とし、♂ルボイール側鎖を有しており、新規な化学
グループに属する抗生物質である。これら５種のサクシ
マイシン類の内では、Ｃ−２１位ニジアノ基を有するサ
フラマイシン人が他のものに比して格段に抗腫瘍作用を
はじめとする生物活性が高いことが明らかにされた。サ
フラマイシンＡは各種の実験動物腫瘍・人癌に有効であ
るが、特に免疫担当細胞や臓器に障害が少なく１骨髄抑
制もなく、癌化学療法剤として非常に有望である。

他方、本発明者らは、サフラマイシン人より更に抗腫瘍
スはクトルが広く化学療法係数が一層優れた新規す７ラ
マイクン誘導体を求めて、生産菌、ストレプトマイセス
　ラペンテエレＡ３１４株（Ｄ生産物の更に詳細な検索
を行ったり、他の微生物による既知サフラマイシンの微
生物転換により新しい誘導体の作製を試みることにより
、これ迄新規な数種のサフラマイシン誘導体が得られて
いる。

すなわち天然のサフラマイシン同族体としてはサフラマ
イシンＦ、Ｇ、Ｈが得られている。サフラマイシンＦは
Ｄと同様圧母格のキノン環が還元されていることが判明
している。サフラマイシンＡＲ，とＡＲ３はサフラマイ
シン人から微生物変換によって得られたもので、いずれ
も側鎖Ｃ−２５位のカルボニール基が水酸基に還元され
たものである。サフラマイシンＲも別に天然サフラマイ
シン類として得られている。

一方、サフラマイシン類の生合成についての本発明者ら
の研究により、サフラマイシンＡの生合成径路が判明し
た。すなわち、サフラマイシンＡ分子中のイソキノリン
キノンニ量体よりなる母格はチロシンより、メチル、メ
トキシ置換基はメチオニンから、またビルホイール側鎖
はグリシン、アラニンなどのアミノ酸類から誘導される
ことが認められた。

これまで、多数の抗生物質が単離報告され、新規抗生物
質の発見は次第に困難となりつつあるが、従来の抗生物
質に対する耐性菌の出現広域抗生物質〜ステロイドホル
モン、制癌剤１免疫抑制剤の汎用による新しい感染症の
出現により新規抗生物質の要求は益々高い。

本発明者らは既知の抗生物質生産菌であっても培養条件
を改良し、微量な共存抗生物質の生産量を著しく高める
方法（（ついて研究を重ねて来た。

本発明者らが今回、研究を進めた結果、サフラマイシン
生産菌ストレプトマイセス　ラベンデュレ黒３１４株を
サフラマイシン生産用の培地で深部培養し、特定の培養
時間、すなわち菌体が青色に着色した１時間後（通常、
培養１５時間後）の、静止又は休止状態にあると認めら
れる菌体を遠心沈澱により集菌し、洗滌シ１、それら静
止状態の菌体をバッファーまたは生理食塩水に懸濁し、
各種のアミノ酸例えばグリシン、Ｌ−アラニン、Ｌ−バ
リン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−セリン、
Ｌ−スレオニン、Ｌ−ｆスチン、β−アラニン、２−ア
ミノ−イソ−酪酸、γ−アミノーノルマルー酪酸、ＤＬ
−２−アミノ−ノルマル−酪ｅ、ｔルコシン、Ｎ−アセ
チルグリシン、タウリン、ＤＬ−エチオニン、ＤＬ−ノ
ルバリン。

１）　Ｌ−ノルロイシン、あるいはアラニールグリシン
、２−アミノーインープチリルダリシンなどのジペプチ
ド、並びＫＬ−メチオニン、Ｌ−チロシンをそれぞれｌ
０ｍＭ添加した後振盪または通気、攪拌下に反応するこ
とにより、側鎖の異なった各種の新規サフラマイシン誘
導体を作製することができることを知り、これを１目的
指向性生合成法”と命名した。

すなわち１本発明者らは、サフラマイシン人生産菌であ
るストレプトマイセス　ラペンデュレ屋３１４株の静止
菌体をバッファー又は生理食塩水に懸濁して用いて、各
種のアミノ酸又はＲプチドを作用させるという”目的指
向性生合成法”によって、サフラマイシン人のピルボイ
ルアミノメチル側鎖がα−アルキル−α−アミノメチル
側鎖に変換したサフラマイシン人誘導体１すなわち前記
一般式ＣＩ）で表わされるサフラマイシン人誘導体を創
製、単離することに成功したのである。しかも、これら
サフラマイシン人訪導体が抗腫瘍作用をはじめとする生
物活性がサブラマイシン人に比べて増強されていること
を生物試験で知見した。

また、これらサフラマイシン人誘導体は塩基性物質であ
って種々の酸と酸付加塩を形成することを認めた。

従って、第一の本発明においては、次の一般式〔式中・
Ｒは水素原子又は低級アルキル基を示す〕で表わされる
サフラマイシンＡ誘導体、またはその酸付加塩を要旨と
するものである。

一般式（Ｉ）において、Ｒが低級アルキル基である時に
は炭素数１〜４のものであり得る。サブラマイシンＡ誘
導体の酸付加塩としては、塩酸、硫酸・リン酸の如き薬
学的に許容できる無機酸、あ・るいはステアリン酸、酢
酸、ピロピオン酸、酒石酸）マレイン酸の如き薬学的に
許容できる有機酸との塩がある。

本発明による式ＣＩ）のサフラマイシンＡ誘導体の例に
は、α−メチル−α−アミノアセチル−アミノメチル側
鎖を有するサフラマイシンＹ３（一般式ＣＩ）において
Ｒが水素原子である場合に相当）と、α−エチル−α−
アミノアセチル−アミノメチル側鎖を有するサフラマイ
シンＹｄ−１（一般式ＣＩ：］　ｖｃおいてＲがメチル
基である場合に相当）とがある。　　　　・ これら２つの化合物例の性状を以下に記載する。

［Ａ］す７ラマイシンＹ３の理化学的性状（１）　　物
質の色と形状 サフラマイシンＹ３（塩基）は黄色粉末として得られる
。

（２）融点 ＋４３−＋４６°Ｃ （３）　　元素分析 Ｃ６１，４５，Ｈ５，９９，Ｎ　１１．９１％（４）　
　分子量（ＦＤ−マススペクトル）（５）実験式 ％式％ （７）　　紫外線吸収スペクトル（メタノール中Ｍ第１
）：ＵＶ、　　２メチＡ′Ｔ″’−Ａ／ｎｍ　（ｌａｙ
　ｔ　）：　２６ｇ（４，２７）ｅａｘ ３４０　（ｓｈ）。

（８）　赤外線吸収スはクトル（クロロホルム中）（第
２図）：ＩＲ，ｖｏ”１３（ｃ笥−’）　：　３３ｇ０
．１６５５．１６１５．１５１５ａｘ （９）　　核磁気共鳴スペクトル（Ｃ１）Ｃ／３）　：
δ（ｐｐｍ）　：　７．２３　（ＩＨ，ｄ−ｄ）、　４
．０７（１■ｆ、ｂｓ）。

４．０６（３Ｈ，ｓ）、　４．０３（３Ｈ，ｓ）、　４
．００（ＩＨ，ｄ）。

３．９４（ＩＨ，ｂｓ）、　３Ｊ３（ＩＨ，ｄ−ｄ−ｄ
）、　３．４５（ＩＨ。

ｄ−ｒＤ、３．２７（ＩＨ，ｑ）、３．１５（ＩＨ，ｔ
−ｄ）、３．００（ＩＨ，ｔ−ｄ）、　２．８８（ｌ）
Ｉ、ｄ−ｄ）、　２．８２（ＩＴ（、ｄ−ｄ）。

２−３３（３Ｈ＝ｓ）ｔ　２−２７（ＩＨ９ｄ）、ｌ−
９２（３１（、ｓＬｌ、ｇ８（３Ｈ，ｓ）、　　１．６
２（２Ｈ，ｂ）、　　１．３７（ＩＨ，ｄ−ｄ−ｄ）。

０．９２（３Ｉ（、ｄ）。

＊Ｄ２０と交換可能 Ｇ１　　溶解度 易溶：ｍ級アルコール、クロロホルム。

エステル類、アセトン、ベンゼン 難溶：エチルエーテル 不溶：水、ｎ−ヘキサン Ｇ９　　呈色反応 ドラーゲンドルフ反応陽性、ニンヒドリン反応陽性、過
りロール鉄、アンスロン反応陰性。

〔Ｂ〕サフラマイシンＹｄ−１（塩基）の理化学的性状
（１）物質の色と形状 塩基性、黄色粉末 （２）融点 ＋２４−１２７°Ｃ （３）　　元素分析 Ｃ６０，７ｇ、　Ｉ（５，８３，Ｎ　１１．７８％（４
）　　分子１１（Ｆｌ）−マススペクトル）（５）　　
実験式 ％式％ （７）　　紫外線吸収スはクトル（メタノール中）（第
３図）：Ｕｖ、　　λメチＪＶｒ”−／′ｎｍ（Ｌｏｔ
　り：　　２６９（４，２６）。

ａｘ λメチＡ４／′’−″　ｎｍ（ｔｏ１６）：　　２３３
（３，７７）。

１ｎ （８）　　赤外線吸収スはクトル（クロロホルム中）（
第４図）：ＣＨＣｌ３　　−１ １Ｒ，ν（ｃｍ　　）　：　　３３Ｂ０．　１６６０．
　１６１５゜ａＸ （９）　核磁気共鳴スはクトル（ＣＤＣ７！　）：δ（
ｐｐｍ）　：　７．２５（ＩＨ，ｄ−ｄ）　、　４．０
５−４．０３゜４−０５（３Ｈ＝ｓ）＊　４−０３（３
Ｈ，ｓ）、４．０１（ｌＨ９ｄ）−３．９１（ＩＩ（、
ｂｓ）、３４３（ＩＨ，ｄ−ｄ−ｄ）、３．４５（ｌ）
Ｉ。

ｄ−ｄ）、３．１４（ＩＨ，ｔ−ｄ）、３．０６（ＩＨ
，ｔ−ｄ）、３．０５（ＩＨ，ｔ）、２．８６（ＩＨ，
ｄ−ｄ）、２．３２（ＩＨ，ｄ）、２．３２（３）（、
ｓＬ　　１．９３（３Ｈ，ｓ）、　　ＩＪ’？（３Ｈ，
ｓ）、　　１．４８（ｌＨ，ｍ）、　　１．４５（２１
（、ｂ）、１．３５（ＩＨ，ｄ−ｄ−ｄ）。

１．０６（ＩＨ，ｍ）、　　０．７４（３Ｆｒ、ｔ）。

＊　１）２Ｑと交換可能 ＋ＩＱ　　溶解度 ８　溶：　低Ｒアルコール、クロロホルム。

エステル類、アセトン、ベンゼン 難溶：エチルエーテル 不溶：水、ｎ″′−・キサン α乃　呈色反応 ドラーゲンドルフ反応陽性ｐニンヒドリン反応１陽性。

過りロール鉄、アンスロン反応陰性 すフラマイシンＹ３．　Ｙｄ−１の生物活性としては抗
菌作用−抗腫瘍作用を示し医薬として用いられるもので
ある。サフラマイシンＹ３　　とＹｄ−１の抗菌スはク
トル（ＭＩＣ）を第１表及び第２表に示す。

前記の第１表及び第２表に示したＭＩＣ（最低阻止濃度
）は、細菌については３７°Ｃ２２４〜４８時間培養、
また真菌については２７°Ｃ２４８時間培養した後に判
定したものである。これらの表から、サフラマイシンＹ
３およびＹｄ−１は、真菌にはＩ００ｍｃｇ／ゴで無効
であるが、ダラム陰性菌や抗酸菌Ｖても効力が弱＜、シ
かもダラム陽性菌には強い抗菌作用を示すことが認めら
れる。特にストレプトコッカス　ピオゲーネスやコリネ
バクテリウム　ジフテリエは低濃度で発育が完全に阻止
される。サフラマイシンＹ　３　トＹｄ−１ノ間に抗菌
スはクトルの差はなく、両者は非常に似かよっている。

サフラマイシンＹ３およびＹｄ−１の毒性を体重２０９
のＤＤＹマウスを使用して評価すると、Ｙ３のＬＤ５ｏ
　が静脈投与で３．２■／ｍ、腹腔内投与で４．０１ｎ
９／ｋｇであり、Ｙｄ−１のＬＤ５ｏハ同じく静脈投与
で２．４２ダ／に９．腹腔内投与で３．２ｑ／ｋｙであ
った。

サフラマイシンＹ３とＹｄ−１の抗腫瘍作用は次のよう
なものである。

試験管内でマウス白血病Ｌ　１２１０培養樹立細胞に対
し試験すると、細胞変性効果ＥＤ　ｓｏはサフラマイシ
ンＹ３が０．００１６　ｍｃｇ　／　ｍ　、　Ｙｄ−１
が０．００２ｍｃｇ／−であった。

また、１群１０匹のＩＣＲマウスにエールリッヒ腹水癌
を接種して２４時間後、腹腔内にす７ラマイシンＹ３を
ＩＯμｆ／マウス／日、　Ｙｄ−１をεμｔ／マウス／
日を７日間投与すると、金側のマウスが延命し、Ｙ３の
５μｔ／マウス／日、　Ｙｄ−１の４μｔ／マウス／日
を投与すると、６０％〜７０％のマウスが２０日間以上
延命した。

更に・ＢＤＦ、　　マウスを使用し、米国国立癌研究所
の手法に準じてマウス白血病Ｌ　１２１０に対する効果
を試験したところ、癌移植後２４時間後から腹腔内−週
間投与の場合にサフラマイシンＹ３は投与量１０μｔ／
マウス／日でＴ（治療群の生存日数）／Ｃ（対照群の生
存日数）Ｘ１００＝１３０％為サフラマイシンＹｄ−１
は同じ投与量でＴ　／　ＣＸ１００＝＋４０％と延命効
果を示し１生存期間の延長がみられ、これらの価は上記
研究所の有効基準を越えるものである。

人の結節癌を良く予言するマウスの腫瘍としてリューラ
イス（Ｌｅｗｉｓ　）肺癌があるが、癌転移に対する効
果を判定するためにも好適な実験モデルとされている。

この腫瘍を使用して下記のように癌転移に対するサフラ
マイシンＹｄ−１の効果を試験した。

リヱークイス肺癌細胞を体重２０ｆのＢＤＦ、マウスに
１．５Ｘｌｏ個左下腿部皮下に接種し、７日後に同下肢
を切断する。

対照群には生理食塩水−治療群にはサフラマイシンＹｄ
−１を４０μグ／マウス７日、１０日間腹腔内投与を行
った。最終投与７日後にマウスを犠牲死させ、肺での転
移を比較した。対照群では無数の大きな転移巣のため肺
の原形をとｙめない程であったが、治療群では殆んど転
移が認められなかった。同じくリューライス肺癌に対す
る効果判定の米国国立癌研究所の指針に従った実験方法
では、サフラマイシンＹｄ−１の２０μｙ／マウス／日
、１０日間の腹腔内投与でＴ／ＣＸ１００は１４０％以
上となリーサフラマイシンＡでは得られない著明な癌転
移防止効果が認められた。

本発明による一般式［Ｉ］のサフラマイシンＡ誘導体の
製造は、サフラマイシンＡ生産菌の代表例であるストレ
プトマイセス　ラペンデュレ４３１４株の静止又は休止
菌体を用いて、これにアミノ酸及びペプチドの少くとも
一つを反応させることによって前述の“目的指向性生合
成法″により達成される。

従って、第二の本発明の要旨とするところは１ストレプ
トマイセス属に属するサフラマイシン人生産菌を培地中
で培養し、その培養物から静止状態の菌体を分離し１こ
の菌体にアミノ酸及びはプチドの少くとも一つを反応さ
せて次の一般式〔式中、Ｒは水素原子又は低級アルキル
基を示す〕で表わされるサフラマイシンＡ誘導体を生産
させ、このサフラマイシンＡ誘導体を採取することを特
徴とする、一般式〔Ｉ〕のサフラマイシンＡ誘導体の製
造法にある０ この第二の本発明の方法に用いるサフラマイシン人生産
菌の一例には、ストレプトマイセス　ラペンデュレ４３
１４株がある。このストレプトマイセス　ラベンデュレ
Ａ３１４株は京都の土壌よす分離されたストレプトマイ
セス属に属する菌で工業技術院微生物工業技術研究所に
昭和５０年９月２日以来寄託され、微生物受託番号３２
１８号として登録されている。

ストレフトマイセス　ラペンデュレＡ３１４株の気菌糸
の形態、胞子表面構造の観察はＩＭＦ　（国際ストレプ
トマイセス協力機構）の基準〔シャーリングアンド・ゴ
ツトリープ（８ｈｉｒｌｉｎｇ、　Ｅ、Ｂ。

ｓｔ　Ｄ、　Ｇｏｔｔｌｉｅｂ　；　工ｎｔｅｒｎａｔ
ｔｏｎａｔ　、ｒ、　ＳｙｓｔｅｍａｔｉｃＢａｃｔｅ
ｙｉｏｌ、　１６．３１３〜３４０．１９６６　）　）
　　による培地、即ち、イースト・スターチ寒天無機塩
・澱粉寒天およびマルトース加炭素源利用能検索基礎培
地（ゴツトリープおよびプリダム）のそれぞれ寒天子板
１ｃ　２７’ＣＩ週間乃至２週間培養し、送日行った。

また成熟した胞子着生菌糸、栄養菌糸その他の色調の決
定の記載には［デイスタリプテイプカラー　ネイム　デ
ィクショナリー（ＤｅｓｃｒｉｐｔｉｖｅＣｏｌｏｒ　
Ｎａｍｅ　Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ、　）　Ｊ　（：Ｉン
テイナーコーポレーション　オツ　アメリカ（Ｃｏｎｔ
ａｉｎｅｒ’５Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ａｍｅ
ｒｉｃａ　１９５０　年出版）および　　　゛［カラー
　ハーモニイ　マニュアル（ＣｏｌｏｒＨａｒｍｏｎｙ
　ｈＩａｎｕａｌ　）　Ｊ　（１９５３年コンテイナー
　コーポレーション　オブ　アメリカ社発行）に含まれ
るカラー　チップ　ナンバー（Ｃｏ１ｏｒ　ｃｈｉｐｎ
ｕｍｂｅｒ　）　　に準拠して行った。

崖３１４株は、イースト・スターチ寒天平板においては
、直径約０．６〜１．０μの長い分岐を形成する液状に
くねった気菌糸を進展し多数の円柱状の胞子を着生する
。

胞子の大きさは０．６〜１．０μｘｏ、ｇ〜２．０μで
ある。

この形態はＩＳＰの基準によれば、セクションレクチフ
レキシビレス（５ｅｃｔｉｏｎ　Ｒｅｃｔｉｆｌｅｘｉ
ｂｉｌｅｓ）に属する。しかし無機塩・澱粉寒天平板や
マルトース加炭素源利用能検索培地平板では、気菌糸は
ループ１不完全もしくは長く引き伸ばした１〜２回転の
ラセンを形成した。したがってＡ３１４株は形態学的ｄ
は１セクシヨン　レチナクリアパーティー（５ｅｃｔｉ
ｏｎ　Ｒｅｔｉｎａｃｕｌｉａｐｅｒｔｉ　）　　ニ属
すると決定された。

電子顕微鏡下でこれら培地上で着生した胞子の表面構造
を研究した結果、この菌の胞子は平滑な表面構造を示す
ことが判明した煮３１４株は、このよ５に気菌糸がセク
ション　レチナクリアパーティーの形態を示し、成熟し
た胞子を着生した気菌糸は各種の培地でパラ色からラベ
ンダーの色調を呈し、また合成培地で時に青色乃至青褐
色の栄養菌糸を生じメラニン色素の生産性が陽性である
点などが主な特徴である。そこで、ワックスマン著「ジ
　アクチノミセーテス２巻」（ウィリアムウイルキンス
社１９５３年発行）、「（パージ−の分類書第ｇ版（Ｂ
ｅｒｇｅｙ’　ｓ　ＤｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｖｅＢａｃ
ｔｅｒｌｌｏｇｙ　）　Ｊ　（ウィリアム　　ウィルキ
ンス社１９７４　年発行）のストレプトマイセス属を検
索し、ストレプトマイセス　ラベンデュレに最も類似点
が多いことが推察された。またＡ３１４株を通常の抗生
物質生産培地に接種し、２７°Ｃで振盪培養すれば・培
養時間１ｇ乃至７２時間で大腸菌に高い力価を有する培
養ｆ液が得られ、このｒ液をアルカリ性で活性炭処理、
酸性アセトン溶出もしくは弱陽イオン交換樹脂ＩＲＣ−
５０による吸着、０・ＩＮ塩酸脱着により抗大腸菌物質
が抽出され、更にＣＧ−５０によるクロマトグラフィー
によって精製した有効物質をライネッケ塩、ピクリン酸
塩により結晶化することてよって、この物質がストレプ
トスリシンであることが同定される。

更に、本菌株煮３１４株は現在ストレプトマイセス菌種
同定規準に使用される諸性状においてすべてストレプト
マイセス　ラペンデュレに一致し、ストレプトマイセス
　ラペンデュレであることは明らかである◇ 以下にＩ６３＋４株の菌学的性状を次の第３表〜第５表
に示す。

第　　４　　表 ストレプトマイセス　ラペン デスレム３１銖の生理学的特性 第　　５　　表 ストレプトマイセス　ラペンデュレ 墓３１４株の炭素源利用能 アンダーラインはｌ０ＰＫ記載された炭素源本発明によ
り得られる式〔Ｉ〕のサフラマイシン人誘導体は公知の
ストレプトマイセス　ラペンデュレの菌の培養液中から
未だ見い出されなかったものである。

第二の本発明の方法においてサフラマイシンＡ誘導体の
生産は先づサフラマイシンＡ生産菌、特にストレプトマ
イセス　ラペンデュレＡ３１４株を培養することによっ
て行われる。菌の培養方法は原則的には、一般微生物の
培養方法に準するが通常は液体培地による深部培養法が
有利である。

培地に用いられる培地はストレプトマイセス属に属する
微生物が利用する栄養源を含有する培地であればよい。

すなわち合成培地、半合成培地あるいは天然培地が用い
られ培地の組成としては、炭素源として、例えばグルコ
ース、　マルトース、フルクトース、　キシロース、　
　澱粉、　　’グリセロールなどであり・、窒素源とし
ては肉エキス、ペプトン、　グルテン・ミール、　綿実
油、　大豆粉、　コーンスターチリカー、　乾燥酵母、
酵母エキス、　硫酸アンモン、　塩化アンモン、尿素そ
の他の有機または無機の窒素源が用いられる。この他金
属の炭酸塩や燐酸塩等が添加されることがある。培養中
発泡の著しい時は、シリコン、大豆油等の植物油、ポリ
オキシアルキレン系、アデカノール等の鉱物油の消泡剤
を添加するとよい。

培養温度は２７°Ｃから３０°Ｃ前後が適当であって培
養容量の増量に従って適宜、前培養を行って接種する。

本培養の培養時間は菌が静止又は休止（ｒｅｓｔｉｎｇ
　）状態になるまでであり、通常は３０時間位である。

このようにして得られた培養物から菌をｒ過又は遠心分
離によって分離し、洗滌する。次いで、この静止菌体に
対してアミノ酸及び／又ははプチドを反応させる。反応
温度は菌の生育温度、例えば２５〜３５°Ｃであること
ができる。このように。

サフラマイシンＡ生産菌の静止又は休止菌体にアミノ酸
及びはプチドの少くとも一つを反応させる目的指向性生
合成法によって一般式ＣＩ、１の新規サフラマイシンＡ
誘導体を生産させ、その反応液から目的物質を抽出、精
製することも、上記培養液中よりサフラマイシン類を抽
出、精製する特開昭５４−４４０９８号公報記載の方法
に準じて行なわれる。

第二の本発明の方法は次のようにして行うのが便利であ
る。ストレプトマイセス　ラペンデュレＡ３１４株（微
工研菌寄第３２１８号）をサフラマイシン生産用培地に
接種し、２７°Ｃ１３０時間深部培養時間−、遠心沈澱
、またはフィルタープレスによって集菌し、菌体を生理
食塩水で充分洗滌する。この湿菌体を、５ｒ／＋ｏＯ＊
の割合に生理食塩水、もしくは菌体を生存、維持できる
バッファー、例えば０．１　ＭＭＥＳ　　バッファー（
ｐｌ（５，７５）に懸濁し、１０ｍＭの前記アミノ酸（
ＤＬ体は２０ｍＭ）またはジはプチドを添加し、２７°
Ｃ１２０１／分の通気量、６００　ｒ、ｐ、ｍ、　　で
攪拌しながら菌をインキュベートすると、側鎖の異なっ
た各種サフラマイクン誘導体が生産される。この反応液
から、各誘導体は弱アルカリ性で水と混和しない有機溶
媒で抽出される。抽出液から減圧下に溶媒を留去、乾固
し、再び溶媒に溶解、１０％酢酸に有効成分を転溶する
。得られた酢酸水中の溶液をアンモニア水または炭酸ナ
トリウムで弱アルカリ性にし、さらに有機溶媒にサフラ
マイシンＡ誘導体を転溶する操作を繰り返し、濃縮と精
製が行なわれる。最終的に、有機溶液から溶媒を留去、
乾固し、得られた組物質をシリカゲルのカラムクロマト
グラフィーで精製する。

上記の手法で前記アミノ酸としてＬ−チロシン。

Ｌ−メチオニン、グリシ、Ｌ−アラ二ンヲ用いると、α
−メチル−α−アミノアセチル−アミノメチル側鎖を有
するサフラマイシンＹ３、およびα−エチル−α−ア之
ソノアセチル−アミノメチル側鎖有するサフラマイシン
Ｙｄ−１が製造される。

更に、本発明者は、サフラマイシンＡ生産菌としてのス
トレプトマイセス　ラベンデュレＡ３１４株ヲサフラマ
イシンＡの製造の場合と同様に培養し、その培養物中に
含有される抗生物質微量成分について前記の第−及び第
二の本発明の知見に基づいて更に探索した結果、一般式
〔■〕のサフラマイシンＡｌｌ導体としてのサフラマイ
シンＹ３とＹｄ−１が培養物中に天然に生産されている
ことを発見した。

従って、第三の本発明においては、ストレプトマイセス
属に属して次の一般式 〔式中、Ｒは水素原子又は低級アルキル基を示す〕で表
わされるサフラマイシンＡ誘導体を生産する菌を培地中
で培養し、次いでその培養物から一般式〔Ｉ〕のサフラ
マイシンＡ誘導体を採取することを特徴とする。一般式
ＣＩ）のサフラマイシンＡ誘導体の製造法を提供する。

この第三の本発明の方法で用いられるサフラマイシンＡ
誘導体生産菌の一例は、前記のストレプトマイセス　ラ
ペンデュレ４３１４株Ｃ微工研菌寄第３２１８号）であ
る。

この第三の本発明方法において、サクラマイシンＡ誘導
体生産菌の培養条件、方法は第二の本発明の方法のそれ
と同様である。培養温度は２７〜３０’Ｃ、培養時間は
］８〜３０時間が適当である。

培養条件は使用される生産菌株の特性に応じて、それぞ
れの最適の条件を選択して適用される。このようにして
培養物中に蓄積された抗生物質は通常、菌体および培養
液中に含有されるので遠心分離またはｒ過により固体を
集めた後菌体およびｒ液から有効物質の抽出を行う。す
なわち適当な溶媒に対する溶解性および溶解度の差、溶
液からの析出性および析出速度の差、種々の吸着剤に対
する吸着親和力の差、２種の液相間における分配の差な
どを利用する一般の天然物の製造に用いられる手段によ
って分離、採取、精製される。これらの方法は必要に応
じて単独に用いられ、あるいは任意の順序に組合わせ、
また反復して適用できる。

その例をあげると次のとおりである。

培養終了後、培養液を濾過し、ｒ液と菌体に分けるＯｒ
液をＩＯＮの水酸化ナトリウムでｐｌ（８，０に調整す
る。クロロホルム又はジクロロメタンの如き有機溶媒に
よる抽出効率を良くする目的で予め培養ｒ液を１−丁に
濃縮しておいても良い。この溶媒抽出操作で、Ａ　３　
Ｉ　４株によって同時に生産される塩基性水溶性抗生物
質ストレプトスリシンなどはｒ液に残留し、サフラマイ
シン複合体は溶媒層に抽出される。溶媒層を減圧にして
濃縮乾固後、これを少量の酢酸エチルに溶解し、炭酸ナ
トリウムの水溶液で溶媒層と振盪後、分液すれば酸性物
質は水層に転溶される。この溶媒層をＩＮ塩酸で抽出し
、この水層を再びアンモニア水で−８〜９とし、クロロ
ホルムで抽出する。この操作を数回繰り返し、溶媒層を
減圧にて濃縮乾固すれば、サクラマイシン複合体を含ん
だ粗塩基成分が得られる。この粗塩基成分をシリカゲル
のカラムクロマトグラフィーでベンゼン・酢酸エチル混
液で展開後、サフラマイシンＡを主として含有するクラ
クションが得られる。このフラ、クシシンをセファデッ
クスＬＩ（−２０のカラムクロマトグラフィーでメチル
アルコールを溶出液として用いることにより、各種のサ
フラマイシンを分画することができる。

実施例１ （イ）グルコース０．１％、スターチ／、Ｑ％　ｄ　リ
ペプトン／、Ｑ％、肉エキスｏ、ｓ％、　Ｎａ０Ａ　　
Ｏ，３％シリコンＫＭ７λＦ　０．０１％を含有する培
地（ｐＨ７，０）を１００ｄ宛振盪フラスコ／Ｊ本に分
注、１２０℃、ｌＳ分高ＥＥ赦菌した。ストレゾトマイ
セス　ラペンデュレ＆　Ｊ　／　ａ株（微工研菌寄第、
？ＪＩ１号）のクラインスキー斜面寒天λ週間培養より
胞子をかき取りコ白金耳宛上記フラスコに接種し、１７
℃、３０時間振盪培養した。この培養物ｉ１２グルコー
スＯ０Ｓ％、スターチｏ、ｊ％、ポリペプトン’−（’
　！Ｘｓ肉エキス０．３％、Ｎａ０１ｋ０．３％、アデ
カノールＬＧ−１０９０，０２％の培地（ｐＨ７，０）
／　００Ｚ金含む容量コｏｏ！／のステンレススチール
タンクに接種し、２７℃で通気量１００１７分の条件下
で／ｊ時間攪拌培養した。

培養液をフィルタープレスで濾過し菌体を集め、生理食
塩水６ｏｔｔで菌体を洗滌した。この菌体をｓｏｂの生
理食塩水ＫＭｆｌａ　Ｌ、容量ノＯ！のファーメンタ−
２機にそれぞれ１６！ぞつ分注した。

（ロ）　この菌体懸濁液にグリシン／ｇｌｉ’、ＤＬ−
アラニン３ＪＶ％Ｌ−メチオニン＋ｌ＜ｔｆ、ｆロジｊ
　７／、Ｚ・６″加私０．！；　Ｎ　　Ｈ２８０４Ｔ”
９”、Ｓ’ｌＣ！！１整しながら−ｔ７℃で通気量−１
０ｊ１．７分の条件で攪拌しながらインキュベートした
。６時間後に、ファーメンタ−内容物の濾過により得ら
れたＦ液に、２．３２のＮａ０Ｎ　ｋ加え１時間攪拌し
た。両者のファーメンタ−からのろ液を合併して得られ
た３０ｊの反応液をジクロルメタンｌｊ！で抽出した。

（ハ）　ジクロルメタン抽出液を減圧下に濃縮し、粗抽
出物とする。得られた粗抽出物は暗褐色油状物質で、収
量的４１、粗抽出物全豹３００−の酢酸エチルに溶解す
る。酢酸エチル溶液ｆ／Ｑ％酢酸１−ｔＯｆｆｉ／でコ
回抽出した。　１０．チ酢酸浴液層を合併し、水冷下、
濃アンモニア水、又は炭酸ナトリウムを加えて、弱アル
カリ性ｐＨｒ〜９とした。

次いで酢酸エチル２００−で２回抽出した。酢酸エチル
層は、洗液がアルカリ性を呈さなくなるまで水洗を繰返
した０次いで酢酸エチル層を無水硫酸ナトリウムで乾燥
後、減圧下に溶媒を留去した。

サフラマイシンＹ３を含む黄色粉末♂３７ｍｇが得られ
た。この粗粉末を少量の酢酸エチルに溶解し、シリカゲ
ルカラムクロマトグラフィーにかけ東。

すなわち、シリカゲル（メルク社７０−２３０ｍｅｓｈ
　）約♂Ｓｖ全酢酸エチルーベンゼン（／：／）に懸濁
し、内径／、ｊｃｒｎのガラスカラムに充填した。

前記の黄色の粗粉末の酢酸エチル溶液をカラムに吸着さ
せた後、酢酸エチル−ペンゼア　（／　：　／）約２０
０−１次いで酢酸エチル、次いでｌ、、！；、１０％メ
タノール含有酢酸エチル、それぞれＪＺＯＯｍｌを用い
て溶出した。サフラマイシンＹ３は主として酢酸エチル
及び１％メタノール含有酢酸エチルによって溶出される
。収量＜ｔ／グ〜、少量はノ〜Ｓ％メ“タノール含有酢
酸エチルによって浴出される。収量／ｇ７■、ここで得
られた粗すフラマイシンＹＧｐ分取薄層クロマトグラフ
ィーによって精製した。溶媒系クロロホルム−エタノー
ル（ＩＯ：／）Ｉｒ用いて展開し、Ｒｆ値約。、Ｊ附近
の黄色・々ンドをかき取り、’ｏ％メタノーに含有酢酸
エチルで抽出した。抽出液全減圧下浴媒を留去すると、
サフラマイシンＹ、？　　３９７■が得うした。このも
のを少量の酢酸エチル、又は、ベンゼンに溶解し、水冷
下エーテルを加えると純粋なサフラマイシｙｙ　３°　
３；１１ｍｇが黄色粉末として得られた。　ｍ、ｐ、　
／　Ｉｔ　３〜ｉａ６℃。

実施例ノ （イ）　　ＧＳＢ培地（グルコースｏ、ｓ％、スターチ
Ｏ０３％、ポリペプトン１％、肉エキス。、３％、Ｎａ
０１ｔ　　０１３％、アゾカッ−＃　Ｌ　Ｇ　−／　０
９　０１）；１％、ｐＨ７，０）　／　６Ａを２０Ｚの
７フ一メンター２機に仕込み、三角コルベンで同じ培地
で２７℃、１２時間前培養したストレプトマイセス　ラ
ペンデュレＪＦＬ＆　／　（を株の種培養物に１０％接
種し、２７℃、通気量１０Ｚ／分で培養した。菌体が青
色に着色した１時間後（培養ｉｓ時間）に遠心沈澱によ
り集菌した。この集菌した菌体ケ。、０１ＭＭＢ５／々
ツ７７−　（ｐＨｊ−，７、！；）で２回洗滌し、ルグ
リシン、２０？、Ｌ−メチオニン１６１、≠ロジンざ２
を加え、’／　００ゴ宛ｊ　００　ｖｒｌの３角コルし
菌体と戸別し、１０Ａの反応液を得た。これにｌ？のＮ
ａ０Ｎ　　ｆ加え更に一時間反応させた後、これをよ！
のジクロルメタンで抽出した。

（ハ）　ジクロルメタン抽出液全減圧下に濃縮し、粗抽
出物とする。得られた粗抽出物は暗褐色油状物質で収量
約／、ｊｒ、粗抽出物を、約１００−の酢酸エチルに溶
解した。酢酸エチル溶液ｆｌＱ％酢酸ＳＯ−で２回抽出
した。ｌＯ％酢酸溶液層を合併し、水冷下の濃アンモニ
ア水又は炭酸す）　ＩＪウムを加えて弱アルカリ性ｐＨ
ざ〜９とした０次いて酢酸エチル１００＠ｌで２回抽出
した。酢酸エチル層は、洗液がアルカリ性を呈さ々くな
るまで水洗を繰返す０次いで酢酸エチル層を無水硫酸ナ
トリウムで乾燥後、減圧下に溶媒を留去した、サフラマ
イシンＹ　　を含む黄色粉末ｏ、ｔｒｓｙが得られた、
この粗粉末全少量の酢酸エチルに溶解し、シリカゲルカ
ラムクロマトグラフィーにかけた。

すなわち、シリカゲル（メルク社、７Ｏ−２３０ｎ１ｅ
ｓｈ　）約ｊｒＯＶ”ｆ、酢酸エチル−ベンゼン（／：
／）に懸濁し、内径／、Ｏｃｍのガラスカラムに充填す
る。

前記の黄色の粗粉末の酢酸エチル溶液全、カラムに吸着
させた後、酢酸エチル−ベンゼン（）：ｌ）約／　ｓ　
ｏ　ｍｅ　、次いで酢酸エチルＩＡ；Ｏｎに、次いで！
、１０％メタノール含有酢酸エチルそれぞれｔｏｏｍｌ
ｋ用いて溶出した。サフラマイシンＹｄ　−１は主とし
て、酢酸エチルによって溶出される。収量０．Ａ；３１
．ここで得られた粗すフラマイシンＹｄ−４’に分取薄
層クロマトグラフィーによって精製した、溶媒系クロロ
ホルム−エタノール（’　ｏ　：ｌ）を用いて展開し、
Ｒｆ　　値約０．４を附近の黄色ノ々ンｒをかき取り、
７０％メタノール含有酢酸エチルで抽出した。この操作
は２回繰返した。抽出液を減圧下溶媒を留去すると、サ
フラマイシンＹ、−４約、９００〜が得られた。このも
のを、少量の酢酸エチル又は、ベンゼンに溶解し、水冷
下エーテルを加えると、純粋なサフラマイシンＹ、−，
ｘ！／■が黄色粉末として得られた。ｍ、ｐ、　／　Ｊ
　’ｔ〜ｌ　２７℃。

実施例３ 実施例１（イ）で培養液をフィルタープレスで沢過して
菌体を集めた後のＦ液を用い、これをジクロルメタンで
抽出した。

このツクｌメタン抽出液を、実施例１（ハ）に記載のサ
フラマイシンＹ３の採取工程と同様に処理すると、サフ
ラマイシンＹ３の約３０１ｖが黄色粉末として得られた
。

実施例α 実施例λ（イ）で得られた培養液から遠心沈澱により集
菌しｆｃ後の残液を用い、これをジクロルメタンで抽出
した。

このジクロルメタン抽出液を実施例コ（ハ）に記載のサ
フラマイシンＹ　　の採取工程と同様に処理すると、サ
フラマイシンＹ６−１　　の約、２ｊ■が黄色粉末とし
て得られた。

ラマシンＹ３の紫外線吸収スペクトル図及び赤外線吸収
スペクトル・図である。第３図及び第９図は夫々にサフ
ラマイシンＹ　　の紫外線吸収スペクトル図及び赤外線
吸収スペクトル図である。

特開昭Ｇｌ−５８５９３（２１） 手続補正書（自発） 昭和６０年５　月２９日

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、次の一般式 ▲数式、化学式、表等があります▼〔 I 〕 〔式中、Ｒは水素原子又は低級アルキル基を示す〕で表
   わされるサフラマイシンＡ誘導体、またはその酸付加塩
   。 ２、サフラマイシンＡ誘導体がサフラマイシンＹ３（一
   般式〔 I 〕においてＲが水素原子である場合に相当）
   である特許請求の範囲第１項に記載の化合物。 ３、サフラマイシンＡ誘導体がサフラマイシンＹ＿ｄ＿
   −＿１（一般式〔 I 〕においてＲがメチル基である場
   合に相当）である特許請求の範囲第１項に記載の化合物
   。 ４　ストレプトマイセス属に属するサフラマイシンＡ生
   産菌を培地中で培養し、その培養物から静止状態の菌体
   を分離し、この菌体にアミノ酸及びペプチドの少くとも
   一つを反応させて次の一般式 ▲数式、化学式、表等があります▼〔Ｉ〕 〔式中、Ｒは水素原子又は低級アルキル基を示す〕で表
   わされるサフラマイシンＡ誘導体を生産させ、このサフ
   ラマイシンＡ誘導体を採取することを特徴とする、一般
   式〔Ｉ〕のサフラマイシンＡ誘導体の製造法。 ５、サフラマイシンＡ生産菌としてストレプトマイセス
   　ラベンデユレ（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｌａｖｅｎ
   ｄｕｌａｅ）Ｎｏ．３１４株（微工研菌寄第３２１８号
   ）を用いる特許請求の範囲第４項に記載の方法。 ６、ストレプトマイセス属に属して次の一般式▲数式、
   化学式、表等があります▼〔Ｉ〕 〔式中、Ｒは水素原子又は低級アルキル基を示す〕で表
   わされるサフラマイシンＡ誘導体を生産する菌を培地中
   で培養し、次いでその培養物から一般式〔Ｉ〕のサフラ
   マイシンＡ誘導体を採取することを特徴とする、一般式
   〔Ｉ〕のサフラマイシンＡ誘導体の製造法。 ７、サフラマイシンＡ誘導体生産菌として、ストレプト
   マイセス　ラベンデユレＮｏ．３１４株（微工研菌寄第
   ３２１８号）を用いる特許請求の範囲第６項に記載の方
   法。