JP2001515364A - アントラサイクリングリコシド - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 Ｒが２つの残基(ａ)または(ｂ)のいずれかを表わす式(Ｉ)のアントラサイクリングリコシドと、その薬学的に認容される塩は、抗腫瘍剤である。

Description

【発明の詳細な説明】 アントラサイクリングリコシド 本発明は、アントラサイクリングリコシド、その単離およびアントラサイクリ ングリコシドを含有する薬剤組成物に関する。 本発明は、式Ｉのアントラサイクリングリコシドまたはその薬学的に認容され る塩を提供する。 ただし、Ｒは以下の２つの残基のいずれかを表わす。 本発明のこれらの化合物は抗腫瘍剤である。新規アントラサ イクリンはグラム陽性菌感染およびグラム陰性菌感染の治療薬として有用であり 、腫瘍細胞の増殖を阻害する。 本発明の好ましい化合物は特に次の２つである。 化合物Ａ： 下記の式の４’−Ｏ−［３”−ヒドロキシ−１”−（２"'−ヒドロキシ−１"' −メチル−４"'−オキソ−ペンチルオキシ）−ブチル］−ダウノルビシン化合物Ｂ： 下記の式の４’−Ｏ−［４”−ヒドロキシ−３”−（１"'−ヒドロキシ−エチ ル）−５”−メチル−テトラヒドロ−フラン−２−イル］−ダウノルビシン さらに、本発明は、Streptomyces peucetius、特にStreptomyces peucetius A TCC 27952を培養し、その結果得られる式Ｉのアントラサイクリングリコシドを そのものまたはその薬学的に認容される塩の形で単離することを含む、式Ｉのア ントラサイクリングリコシドまたはその薬学的に認容される塩の製造方法を提供 する。 したがって、本発明のアントラサイクリングリコシドは、炭素源と窒素源と無 機成分と任意選択の微量成分とを含有する培地でStreptomyces peucetiusを好気 条件下で培養することによって得ることができる。本発明のアントラサイクリン グリコシドは、有機抽出、カラムクロマトグラフィ、塩形成、分取薄層 クロマトグラフィ（ＴＬＣ）、結晶化のいずれかまたはこれらすべての従来の方 法で単離することができる。 したがって、本発明は、上記で定義した式Ｉの化合物またはその薬学的に認容 される塩を発酵と抽出と精製とによって製造する方法も提供する。 式Ｉの前記化合物の薬学的に認容される塩には、薬学的に認容される酸、たと えば塩酸、臭酸、硝酸、硫酸などの無機酸、またはクエン酸、酒石酸、マレイン 酸、フマル酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸などの有機酸のいずれかと の塩が含まれる。 本発明の好ましい塩は塩酸塩である。 本発明の新規アントラサイクリン誘導体は有用な抗腫瘍活性を有する。 本発明は、薬学的に認容される希釈剤または担体と、有効成分として式Ｉのア ントラサイクリン類縁物質またはその薬学的に認容される塩とを含む薬剤組成物 も提供する。 発酵過程 よく知られている方法で製造を行った。予め滅菌した液体培地で好気条件下で ２５℃〜３５℃の温度（３０℃が好ましい） で５〜８日の期間（７日が好ましい）、発酵過程の開始時はｐＨ６．５〜７．０ 、終了時はｐＨ５〜７．０で微生物を培養した。 培地は炭素源および窒素源ならびに無機塩類から構成されていた。 炭素源としては、デンプン、デキストリン、ブドウ糖、麦芽糖を使用できる。 窒素源としては、ひき割り大豆粉、乾燥酵母、食肉、ペプトン、カゼインを使 用できる。 硝酸アンモニウム、硫酸アンモニウム、リン酸アンモニウムなど、あらゆるア ンモニウム塩が使用できる。 製造に有用な無機塩類は、使用する培地によって異なる可能性がある。 発酵は様々な容量のフラスコまたはパイロットスケール発酵槽内で行うことが できる。 抽出方法 発酵過程の終了時に、新規アントラサイクリングリコシドは、ｐＨ７．５でろ 過により発酵上清液から分離した菌糸中に主に発見された。 アセトンやメタノールなどの水混和性有機溶媒を用いて菌糸を抽出し、次いで 菌糸抽出物を真空内で濃縮して水溶液を得た。ｐＨを７．２に調整した後、その 水溶液をアンバーライトカラ ムに入れた。得られた画分のうち選択した画分を真空下で濃縮し、ジクロロメタ ンを用いてアルカリ条件下で抽出した。この有機抽出物を少量に濃縮し、石油エ ーテルを加えて沈殿させ、未精製抽出物を得た。 精製方法 精製方法は、カラムクロマトグラフィや分取ＴＬＣ、結晶化など従来の方法か らなる。 抽出方法で得られた未精製抽出物をシリカゲルカラムクロマトグラフィにかけ 、メタノールを用いた段階溶離によって溶離した。得られた画分をＴＬＣでモニ ターし、選択した画分を真空内で濃縮して赤色粉末を得た。質量分析およびＮＭ Ｒ解析によってその構造を明らかにし、その生物学的活性を検討するのに十分に 純粋なアントラサイクリングリコシドを得るために、シリカゲルを用いたフラッ シュクロマトグラフィまたは分取ＴＬＣによってこの粉末を精製することができ る。その結果得られる化合物は、次いで薬学的に認容される塩に変換することが できる。 生物学的活性 Ａ）抗菌活性 ダウノルビシンと比較した新規アントラサイクリングリコシ ドの「in vitro」最小抑制濃度（ＭＩＣ）を、標準的な試験管希釈法を用いて幾 つかの微生物について測定し、その結果を表１に示す。 Ｂ）細胞毒性活性 新規アントラサイクリングリコシドの細胞毒性活性を、表２に示すとおり、培 養したＬ１２１０細胞に対し、「in vitro」でダウノルシビンと比較してテスト した。 また、化合物Ａおよび化合物Ｂの細胞毒性活性については、一群のヒト固形腫 瘍細胞系、すなわち４種類のヒト乳腺癌細胞系（ＭＣＦ−７、ＭＣＦ−７／Ｄｘ 、ＳＫＢＲ−３、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１）、２種類のヒト卵巣癌細胞系（Ａ２７ ８０、０ＶＣＡＲ３）、２種類のヒト結腸腺癌細胞系（ＨＣＴ１１６、ＨＴ２９ ）においてドキソルビシンと比較する評価も行った。 細胞毒性は、濃度の異なる前記化合物による処理後７２時間目に９６穴プレー ト上でＳＲＢアッセイ（J.N.C.I.:82，1107−1112 and 1113−1118，1990）で評 価した。増殖を５０％阻止 する濃度（ＩＣ₅₀値）を計算して求めた。その結果を表３に示す。いずれの化合 物も、テストしたすべての細胞系に対してドキソルビシンより強力な作用を有す る。特に化合物Ａは、ドキソルビシンに対して抵抗性であるＭＣＦ７クローンに 活性を示し、２種類の乳癌細胞系（ＳＫＢＲ−３およびＭＤＡ−ＭＢ−２３）お よびテストした結腸癌細胞系と卵巣癌細胞系のいずれに対しても特に強力な作用 を示す（ＩＣ₅₀＜１０ｎＭ）。 適切な投与経路としては非経口投与、たとえば静脈内投与などがある。非経口 投与用に、式Ｉのアントラサイクリングリコシドまたはその塩と、これらの有効 な化合物を溶解するかあるいはその懸濁液を提供する滅菌希釈剤または担体とを 用いて液剤を製造することができる。このような非経口剤は、生理食塩水や滅菌 水、その他の滅菌ベヒクルなど適切なベヒクルで投与前に再形成する滅菌固形の 形態で製造することができる。 本発明の化合物は抗腫瘍剤として有用であり、その結果、白血病または固形腫 瘍の治療法に使用することができる。 有効な量の式Ｉのアントラサイクリングリコシドまたはその薬学的に認容され る塩の投与を含む方法により、腫瘍を有するヒトまたは動物を治療することがで きる。この治療により、腫瘍を有するヒトまたは動物の状態を改善することがで きる。 治療可能な腫瘍の例としては、肉腫、癌腫、リンパ腫、神経芽細胞腫、黒色腫 、骨髄腫、ウイルムス腫瘍、白血病、腺癌などがある。本発明の化合物は、卵巣 癌、プラチナ抵抗性の癌、転移性乳癌、非小細胞肺癌、頭頸部癌の治療に使用で きる。 治療上有効な量の式Ｉのアントラサイクリングリコシドまたはその塩を、腫瘍 を有するヒトまたは動物に投与してその状態 を改善する。腫瘍の増殖を阻止するのに十分な量を投与することができる。投与 すべき量は、in vitroおよびin vivoの抗腫瘍テストにおいて本発明の化合物が 示す活性を参考にして修正した、ドキソルビシンおよびダウノルビシンの知られ ている用量範囲を用いて確認することができる。適切な用量は、一般に体表面積 １ｍ²当たり０．０１〜１００ｍｇの範囲、好ましくは０．１〜１０ｍｇであり 、治療する疾患の性質や重症度および患者の全身状態によって異なる。 後述の実施例および調製は、例示的なものとして示したものであり、本発明を 限定するものではない。 調製ａ ショ糖３％、酵母抽出物０．４％、ＮａＮＯ₃０．３％、Ｋ₂ＨＰＯ₄０．１％ 、ＭｇＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ０．０５％、ＫＣｌ０．０５％、ＦｅＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ０． ００１％、寒天２％、水道水最高１００ｍＬからなるｐＨ７．３の維持培地(Ｃ ＺＹ培地、％は重量に対する割合)の寒天斜面培地上で、Streptomyces peucetiu s株ＡＴＣＣ ２７９５２の培養物を２８℃で１２日間培養した。オートクレー ブ内で１２０℃で２０分加熱することにより、滅菌を行った。培養菌の芽胞が固 体培地の表面上に 生じるが、これを採取して蒸留水１ｍＬに懸濁した。こうして得た懸濁液が均一 になるよう撹拌し、デキストリン２％、コーンスティープリカー１％、（ＮＨ₄ ）₂ＳＯ₄０．１％、Ｋ₂ＨＰＯ₄０．０１％、ＣａＣＯ₃０．５％、水道水最高１ ００ｍＬからなる液体培地３０ｍＬを含有する３００ｍＬのエルレンマイアーフ ラスコに接種した。オートクレーブ内で１２０℃で２０分加熱することにより、 滅菌を行った。滅菌後のこの培地のｐＨ値は６．５〜７．０である。２８０ｒｐ ｍで稼働して直径７ｃｍの円を描く回転式振とう器を用いて、接種したフラスコ を２８℃の温度で２日間振とうする。 デンプン６％、ブドウ糖３％、乾燥酵母１．５％、ひき割り大豆粉１％、Ｎａ Ｃｌ０．２％、ＣａＣＯ₃０．３％、ＭｇＳＯ₄０．０１％、ＦｅＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ ０．０１％、ＣｕＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ０．０１％、ＺｎＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ０．０１％、 水道水最高１００ｍＬからなる産生培地（％は重量に対する割合）３０ｍＬを含 有する３００ｍＬのフラスコに前述の培養物１．５ｍＬを接種した。オートクレ ーブ内で１２０℃で２０分加熱することにより、この培地を滅菌した。滅菌後の 培地のｐＨ値は６．４である。接種期と同じ条件下で回転式振とう器を用いて３ ０℃ で７日間フラスコをインキュベートした。 調製ｂ 調製ａに従って得られた発酵物質の全ブイヨン（４Ｌ）を、１ＭのＮａＯＨで ｐＨを７．５に調整した後、ろ過により上清液と菌糸とに分離した。フィルタの 補助として珪藻土を使用した。 アセトン３Ｌを用いて２回、メタノール（ｐＨ５．３）３Ｌを用いて１回、菌 糸を抽出した。この抽出物を合わせ、真空内で濃縮した。得られた水溶液のｐＨ を１ＭのＮａＯＨで７．２に調整し、ろ過した後、アンバーライトＸＡＤ２カラ ムにかけた。水で洗った後、メタノールを用いた段階溶離によりこのカラムを溶 離した。 発色した溶出物質をプールし、真空内で濃縮してから、ジクロロメタンを用い てアルカリ条件下で抽出した。 有機層を真空内で蒸発させて少量にし、次いで石油エーテル沈澱法により末精 製抽出物を得た。 調製ｃ 新規アントラサイクリングリコシドと化合物Ａと化合物Ｂとを含有する、発酵 ブイヨン１４０Ｌから調製ｂに従って得られ た未精製抽出物６．７ｇを少量のジクロロメタンに溶解し、シリカゲル乾燥カラ ム（シリカゲル６０、７０〜２３０メッシュＡＳＴＭ、粒子サイズ０．０６３〜 ０．２００ｍｍ、メルク）に入れた。ジクロロメタンで洗浄した後、メタノール （１０％〜４０％）を用いて段階溶離によりカラムを溶離した。シリカゲルカラ ムから得られた画分をＴＬＣでモニターした。この画分の一部は化合物Ａを、他 の部分は化合物Ｂを含有していた。 分析法 未精製抽出物のサンプルおよび精製段階で得られたサンプルを、以下の溶媒シ ステムを溶離液として用いて薄層クロマトグラフィ（ＴＬＣ）にかけた。 １）ジクロロメタン：メタノール １０：１（体積） ２）ジクロロメタン：メタノール：酢酸 ８０：２０：４（体積） ３）ジクロロメタン：メタノール：トルエン ７０：３：３（体積） ＴＬＣプレートはシリカゲル６０ Ｆ ２０５（メルク社）。 これら３つの溶媒システムで展開した化合物Ａおよび化合物Ｂの各Ｒｆ値を下 記の表に示す。 実施例１ 調製ｃに従って得られ、化合物Ａを含有する画分を真空内で乾燥し、褐色がか った紫色の粉末を得た。この粉末を少量のジクロロメタンに溶解し、シリカゲル のフラッシュクロマトグラフィで精製した（フラッシュクロマトグラフィ用シリ カゲル６０、２３０〜４００メッシュＡＳＴＭ、粒子サイズ０．０４０〜０．０ ６３ｍｍ、メルク）。 カラムをジクロロメタンで洗い、メタノール（１〜５％）を用いた段階溶離に より溶離を行った。ＴＬＣで検出し、化合物Ａを含有する選択した画分を、真空 内で少量に濃縮した後、石油エーテルを用いて沈澱させ、約５０ｍｇを得た。 実施例２ 調製ｃに従って得られ、化合物Ｂを含有する画分を真空内で乾燥し、褐色がか った紫色の粉末を得た。この粉末を少量のジクロロメタンに溶解し、（前述の分 析法の）溶媒システム２を 溶離液として用いる分取ＴＬＣ（シリカゲル６０Ｆ ２５０２０×２０ｃｍ×１ ｍｍ）にかけた。 化合物Ｂは０．５４という中央Ｒｆ値を示した。このバンドをメタノールで溶 離し、水で洗った後、アルカリ条件下でジクロロメタンを用いて抽出した。石油 エーテルを用いて沈澱させた後、２ｍｇの化合物Ｂを得た。 化学物理的特性 精製したサンプルに以下の条件で質量分析とＮＭＲとＩＲ分析とを行った。Ｆ ＡＢ（高速原子衝撃）質量スペクトルを、Ｊｏｎ Ｔｅｃｈ ＦＡＢ銃付きＶａ ｒｉａｎ Ｍａｔ ３１１−Ａ質量分析計で記録した。精製サンプルを、（２Ｎ のトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）で酸性化した）ジチオトレイトール／ジチオエリ トリトール（５／１）に溶解した。ソース温度は４５℃、衝撃ガスはキセノン、 原子の運動エネルギーは約９Ｋｅｖであった。 ＦＤ（電界脱離）質量スペクトルを、ベンゾニトリル活性化エミッタを用いる 複合電界イオン化（ＦＩ）／ＦＤ／ＥＩイオン源付きＶａｒｉａｎ Ｍａｔ ３ １１−Ａ質量分析計で記録した。電界エミッタ陽極と陰極との間の総電位差は９ Ｋｅｖで あった。エミッタ加熱電流は３１ｍＡ、ソース温度は１００℃であった。 スペクトルは１００ｍ／ｚの値から正規化した。ＩＲスペクトルはＰａｒｋｉ ｎ−Ｅｌｍｅｒモデル１４２０分光光度計で記録した。ＮＭＲスペクトルはＶａ ｒｉａｎ Ｕｎｉｔｙ−６００分光光度計で記録した。細かい赤色粉末として得 られた化合物Ａおよび化合物Ｂはアセトンに溶けやすく、クロロホルムやジクロ ロメタン、メタノールにやや溶けやすく、エチルエーテルやｎ−ヘキサン、石油 エーテルにきわめて溶けにくいまたはほとんど溶けない。 化合物Ａおよび化合物Ｂは酸性媒質で不安定である。軽度の加水分解（４０％ ｖ／ｖ０．１ＮのＨＣｌ、６０℃で１〜２時間）で、化合物Ａおよび化合物Ｂの いずれもダウノルビシンを生じた。 化合物Ａおよび化合物Ｂの物理化学的特性を表４と表５と表６に示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） //(Ｃ１２Ｐ 19/56 (Ｃ１２Ｐ 19/56 Ｃ１２Ｒ 1:465） Ｃ１２Ｒ 1:465） (72)発明者 ブレーメ，ウンベルト イタリー国、イ―27029・ビジエバノ、ビ ア・ジヨアキーノ・ロツシーニ、８・アー (72)発明者 コロンボ，アンナ・ルイザ イタリー国、イ―20144・ミラン、ビア・ エルバ、14 (72)発明者 フランキ，ジユリアーノ イタリー国、イ―20151・ミラン、ビア・ ユージエニオ・モンターレ、12 (72)発明者 オロンツオ，ジユリアーノ イタリー国、イ―20147・ミラン、ビア・ デル・フオルツエ・アルマーテ、13 (72)発明者 タトー，マルコ イタリー国、イ―20151・ミラン、ビア・ マリオ・ボルサ、24 (72)発明者 ガロフアノ，ルイザ イタリー国、イ―20052・モンツア、ビ ア・エツトーレ・フイーラモスカ、29 (72)発明者 チヨメイ，マリーナ イタリー国、イ―27100・パビア、トー レ・デイソーラ ビア・デル・モロ、１

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．式Ｉのアントラサイクリングリコシドであって、 ただし、Ｒは次の２つの残基のいずれかを表わす アントラサイクリングリコシドまたはその薬学的に認容される塩。 ２．塩酸塩である、請求の範囲第１項に記載の塩。 ３．４’−Ｏ−［３”−ヒドロキシ−１”−（２"'−ヒドロキシ −１"'−メチル−４"'−オキソ−ペンチルオキシ）−ブチル］−ダウノルビシン または４’−Ｏ−［４”−ヒドロキシ−３”−（１"'−ヒドロキシ−エチル）− ５”−メチル−テトラヒドロ−フラン−２−イル］−ダウノルビシンである、請 求の範囲第１項に記載の化合物。 ４．Streptomyces peucetiusを培養し、その結果得られる式Ｉのアントラサイク リングリコシドをそのものまたはその薬学的に認容される塩の形で単離すること を含む、請求の範囲第１項に記載の式Ｉのアントラサイクリングリコシドまたは その薬学的に認容される塩の製造法。 ５．Streptomyces peucetiusがStreptomyces peucetius ATCC 27952である、請 求の範囲第４項に記載の方法。 ６．請求の範囲第１項に記載の式Ｉのアントラサイクリングリコシドまたはその 薬学的に認容される塩と、薬学的に認容される担体または希釈剤とを含む薬剤組 成物。 ７．ヒトまたは動物の身体の治療法での使用を目的とする、請求の範囲第１項ま たは第２項または第３項に記載の化合物。 ８．抗腫瘍剤としての使用を目的とする、請求の範囲第７項に記載の化合物。