IT9021293A1 - Antibiotici ab-023 e processo per la loro preparazione - Google Patents
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Description
Descrizione dell'invenzione industriale
La presente invenzione si riferisce a sostanze antibiotiche denominate complesso Antibiotico AB-023 ed ai suoi componenti: Antibiotico A8-G23a ed Antibiotico AB-023b.
La presente invenzione si riferisce inoltre al processo per la preparazione dei detti Antibiotici AB-023, mediante fermentazione dello Streptomyces sp. NCIMB 40212, ed al loro impiego nel trattamento delle fitopatie causate dalle specie fungine a loro suscettibili.
Il complesso Antibiotico AB-023 ed i suoi componenti Antibiotico A8-023a ed Antibiotico AB-023b sono differenti dagli altri antibiotici noti.
Con il termine "complesso Antibiotico AB-023", usato nella presente invenzione, viene indicata una miscela che comprende tutti i componenti, dotati di una o più attività biologiche, prodotti dalla fermentazione dello Streptomyces sp. NCIMB 40212, nelle condizioni che verranno di seguito specificate.
Detti componenti biologicamente attivi comprendono, ma non sono limitati a, quelli denominati Antibiotico AB-023a ed Antibiotico AB-023b isolati dalla miscela.
Come è noto all'esperto nell'Arte della Fermentazione, il numero ed il rapporto relativo delle componenti che formano il complesso Antibiotico AB-023 possono variare, in dipendenza delle condizioni di fermentazione (quali, ad esempio, il terreno di coltura, la temperatura di fermentazione, la durata della fermentazione stessa, l'areazione eccetera) e del ceppo utilizzato.
Si deve inoltre intendere che la presente invenzione non è limitata all'impiego dello Streptomyces sp. NCIMB 40212, ma comprende anche l'impiego di varianti e/o mutanti ottenuti spontaneamente od artificialmente dal suddetto microorganismo, purché essi producano gli Antibiotici AB-023.
Costituisce pertanto oggetto della presente invenzione il complesso Antibiotico AB-023 ottenibile mediante coltivazione aerobica controllata dello Streptomyces sp. NCIMB 40212, o di un suo equivalente variante o mutante spontaneo od artificiale, in un mezzo nutriente di coltura acquoso, contenente fonti di carbonio assimilabili, azoto, sali inorganici e metalli in tracce e la successiva separazione di detto complesso Antibiotico AB-023 e dei suoi componenti Antibiotico AB-023a ed Antibiotico AB-023b.
Caratteristiche chimico fisiche del complesso Antibiotico AB-023.
Il complesso Antibiotico AB-023 è composto principalmente dagli Antibiotici AB-023a ed AB-023b e si presenta come una polvere gialla caratterizzata da:
(a) buona solubilità in dimetilsolfossido, in metanolo, in etanolo, in miscele di metanolo/acqua (1:1, V/V) e di etanolo/acqua (1:1, V/V); insolubile in acqua, idrocarburi, acetonitrile, cloruro di metilene, cloroforinio.
(b) Analisi elementare approssimata, determinata su un campione tenuto sotto vuoto a 4Q°C per 2 ore, in percentuale: carbonio: 64,06; idrogeno: 8,78; non contiene azoto, fosforo e zolfo.
(c) Lo spettro di assorbimento ultravioletto {UV) è mostrato in Figura 1 dei disegni allegati. Esso presenta un1assorbenza massima di 304,0 nm, 317,2 nm, 332,4 nm, 350,4 nm ad una concentrazione di 0,022 mg/ml in etanolo: acqua (50:50, V:V).
(d) Lo spettro di assorbimento infrarosso (IR) in pastiglia di KBr è mostrato in Figura 2 dei disegni allegati e presenta i seguenti massimi di assorbimento (cm 1):
3402, 3014, 2970, 2936, 2879, 2041, 1725, 1636, 1457, 1379, 1311, 1266, 1175, 1109, 1072, 1008, 905, 847, 823, 745, 706, 583, 535, 515, 480.
(e) Lo spettro NMR dell'1H è mostrato in Figura 3 e presenta segnali registrati con uno spettrometro BRUKER AM 300 MHz in esadeutero - dimetilsolfossido (DMS0d6).
I Chemical shifts sono stati riferiti indirettamente al TMS=0,00 ppm ( TMS) usando come riferimento interno il picco centrale dell‘esadeutero - dimetilsolfossido preso a TMS = 2,56 ppm.
(ppmi): 6,43-6,24 (in, 12H); 6,24-6,07 (m, 4H); 5,96 (m,
2H) ; 5,62 (m, 2H); 5,33 (bs, IH); 5,19 (bs, IH); 5,03 (bs, IH); 4,96 (bs, 2H); 4,93 (bs, IH); 4,86 (in, 4H); 4,70 (m, 2H); 4,42 (bs, 2H); 3,94-3,36 (m, 12H); 2,41 (in, 2H); 2,32 (m, IH); 2,20 (m, IH); 1,92-1,45 (in, 6H); 1,45-1,09 (m, 42H); 1,25 (d, 6H); 1,11 (d, 3H); 1,07 (d, 6H); 0,95 (d, 6H); 0,88 (t, 3H).
13
(f) Lo spettro NMR del C è mostrato in Figura 4 e presenta segnali registrati con uno spettrometro BRUKER AM 300 MHz in esadeutero - dimetilsolfossido (DMSOd,).
I Chemical shifts sono stati riferiti indirettamente al TMS=0,00 ppm ( TMS) usando come riferimento interno il picco centrale del dimetilsolfossido deuterato preso a TMS = 39,50 ppm.
I dati relativi alla molteplicità dei segnali sono stati ottenuti mediante esperimenti di DEPT a 45“, 90° e 135°.
(ppm): 173,7 (s); 173,1 (s); 136,5 (d); 136,5 (d); 136,5
(d); 136,3 (d); 133,1 (d); 133,1 (d); 132,9 (d); 132,9 (d); 132,7 (d); 132,5 (d); 132,1 (d); 131,9 (d); 131,6 (d); 131,4 (d); 131,2 (d); 131,1 (d); 130,6 (d); 130,3 (d); 129,5 (d); 129,2 (d); 74,7 {d ); 74,4 (d); 74,1 (d); 73,6 (d); 72,0 (d); 71,9 (d); 71,5 (d); 71,4 (d); 71,4 (d); 71,2 (d); 69,7 (d); 69,6 (d); 67,7 (d); 67,3 (d); 54.1 (d); 46,1 (d); 45.5 (d); 45,4 (d); 43,4 (t); 42.9 (t); 41,7 (t) ; 41.5 (t); 40,1 (d); 39,5 (d); 38.9 (t); 38,9 (t ); 38,8 (t); 38,7 (t); 38,2 (t); 38.1 (t); 22,5 (t); 22,4 (t); 22,1 (t); 19,0 (q); 18,7 {q); 15,9 (q ); 15.6 (q); 13,2 (q)i Π .3 (q); 10,4 (q); 10,2 (q).
(g) il tempo di ritenzione (Rt) del complesso Antibiotico AB-023 , individuato come unico picco, è di circa 3,65 minuti, se analizzato su colonna HPLC in fase inversa nelle seguenti condizioni:
Colonna: Lichrosorb Merck RP-18, mm 250 x 4
Precolonna: Merck C18
Eluente MeOH : H20 (86:14 V:V)
Flusso: 1 ml/min
Rivelatore: UV 333 nm
Temperatura: 35°C.
Il tempo di ritenzione dei singoli componenti antibiotici
AB-023a e AB-023b come picchi risolti è di 6,18 minuti e 6,76 minuti rispettivamente, se analizzati su colonna HPLC in fase inversa nelle seguenti condizioni:
Colonna: Lichrosorb Merck RP-18, mm 250 x 4
Precolonna: Merck C18
E' uente Acetonitrile : H20 (52:48 V:V)
FLusso : 1 ml/min
Rivelatore: UV 333 nm
Temperatura: 35°C.
Caratteristiche chimico fisiche dell'Antibiotico AB-023a.
L'Antibiotico AB-023a si presenta come una polvere gialla caratter izzata da:
(a) buona solubilità in dimetilsolfossido, in metanolo, in etanolo, in miscele di metanolo/acqua (1:1, V/V) e di etanolo/acqua (1:1, V/V); insolubile in acqua, idrocarburi, acetonitrile, cloruro di metilene, cloroformio.
(b) Analisi elementare approssimata, determinata su un campione tenuto sotto vuoto a 40°C per 2 ore, in percentuale: carbonio: 63,88; idrogeno: 8,64; non contiene azoto, fosforo e zolfo.
(c) Il peso molecolare dell'Antibiotico AB-023a è di 550 Da, come desunto dallo spettro FAB-MS che mostra un picco a m/z=551 Da, corrispondente allo ione ed un picco a m/z=549 Da, corrispondente allo ione
Le condizioni operative sono le seguenti:
Ioni negativi e Ioni positivi FAB, Xe a 9,5 KV,
Matrice glicerolo,
Finning Mat 8424.
(d) La formula minima più probabile dell'Antibiotico AB-023a risulta essere:
come dedotto dai dati di spettroscopia H-NMR e C-NMR e dai dati di spettrometria di massa.
(e) Lo spettro di assorbimento ultravioletto (UV) è mostrato in Figura 5 dei disegni allegati. Esso presenta un'assorbenza massima di 303,0 nm ( =22678), 316,6 nm ( =44979), 331,6 nin ( =71198), 349,8 nm ( =71952) ad una concentrazione di 0,0073 mg/ml in etanolo.
(f) Lo spettro di assorbimento infrarosso (IR) in pastiglia di KBr è mostrato in Figura 6 dei disegni allegati e presenta i seguenti massimi di assorbimento (cm 1):
3402, 3014, 2970, 2936, 2879, 2041, 1725, 1636, 1457, 1379,
1311, 1266, 1175, 1109, 1072, 1008, 905, 847, 823, 745,
706, 583, 535, 515, 480.
(g) Lo spettro NMR dell '1H è mostrato in Figura 7 e presenta segnali registrati con uno spettrometro BRUKER AM 300 MHz in esadeutero - dimetilsolfossido (DMS0d6).
I Chemical shifts sono stati riferiti indirettamente al TMS=0,00 ppm ( TMS ) usando come riferimento interno il picco centrale dell 'esadeutero - dimeti1solfos sido preso a TMS=2,56 ppm.
(I segnali maggiormente sovrapposti sono stati identificati tramite tecniche di NMR bidimensionale).
(ppm): 6,32 (m, 6H); 6,17 (m, IH); 6,16 (m, IH); 5,93 (dd, IH); 5,64 (dd, IH); 5,18 (d, IH); 4,96 (d, IH); 4,87-4,85 (m, 3H); 4,70 (m, IH); 4,43 (d, IH); 3,86 (m, IH); 3,77 (m, IH); 3,68 (m, IH); 3,57 (m, IH); 3,51 (m, IH); 3,48 (m, IH); 2,40 (m, IH); 2,32 (m, IH); 1,68 (m, IH); 1,46-1,09 (m, 14H), 1,24 (d, 3H); 1,11 (d, 3H); 1,07 (d, 3H); 0,93 (d, 3H).
(h) Lo spettro NMR del C è mostrato in Figura 8 e presenta segnali registrati con uno spettrometro BRUKER AM 300 MHz in esadeutero - dimetilsolfossido (DMSOd-) .
I Chemical shifts sono stati riferiti indirettamente al TMS=0,00 ppm ( TMS) usando come riferimento interno il picco centrale del dimetilsolfossido deuterato preso a TMS=39,50 ppm.
I dati relativi alla molteplicità dei segnali sono stati ottenuti mediante esperimenti di DEPT a 45°, 90° e 135°.
(ppm): 173,7 (s); 136,5 (d); 136,3 (d); 132,9 (d); 132,9
(d); 132,5 (d); 132,1 (d); 131,6 (d); 131,2 (d); 130,3 (d); 129,5 (d); 74,4 (d); 73,6 (d); 72,0 (d); 71,4 (d); 71,2 (d); 69,6 (d); 67,7 (d); 46,1 (d); 45,4 (d); 43,4 (t); 41,5 (t); DMSO*; DMSO*; DMSO*; 38,2 (t); 22,4 (t); 18,7 (q); 15,9 (q); 13,2 (q); 10,4 (q);
( ): questi picchi sono coperti dall'intenso segnale del solvente.
(i) coefficienti di ritenzione in cromatografia su strato sottile con una corsa dell'eluente di 15 cui su lastre di silice in fase inversa RP-18 F 254 (Merck-Schuchardt ) e di silice in fase inversa RP-8 F 254 (Merck-Schuchardt), nei seguenti sistemi di eluenti: eluente A = Acqua
eluente B = Acetonitrile
eluente C = Metanolo
eluente D = soluzione 10 mM di portata a pH=3 con
Visualizzazione: 1) fluorescenza alla luce UV (366 nm)
2) reattivo preparato sciogliendo 20 g. di in una soluzione acquosa al 6% in
(1) il tempo di ritenzione dell'Antibiotico AB-023a è di 6,18 minuti se analizzato su colonna HPLC in fase inversa nelle seguenti condizioni:
Colonna: Lichrosorb Merck RP-18, mm 250 x 4 Precolonna: Merck C18
Eluente: Acetonitrile: (52:48 V:V)
Flusso: 1 ml/min
Rivelatore UV 333 nm
Temperatura: 35°C.
Caratteristiche chimico fisiche dell'Antibiotico AB-023b.
L'Antibiotico AB-023b si presenta come una polvere gialla caratterizzata da:
(a) buona solubilità in dimetilsolfossido, in metanolo, in etanolo, in miscele di metanolo/acqua (1:1, V/V) e di etanolo/acqua (1:1, V/V); insolubile in acqua, idrocarburi, acetonitrile, cloruro di metilene, cloroformio.
(b) Analisi elementare approssimata, determinata su un campione tenuto sotto vuoto a 40°C per 2 ore, in percentuale: carbonio: 65,18; idrogeno: 8,87; non contiene azoto, fosforo e zolfo.
(c) Il peso molecolare dell'Antibiotico AB-023b è di 564 Da, come desunto dallo spettro FAB-MS che mostra un picco a m/z = 565 Da, corrispondente allo ione ed un picco a m/z = 563 Da, corrispondente allo ione
le condizioni operative sono le seguenti:
Ioni negativi e Ioni positivi FAB, Xe a 9,5 KV,
Matrice glicerolo,
Finning Mat 8424.
(d) La formula minima più probabile dell'Antibiotico AB-023b risulta essere: come dedotto dai dati di spettroscopia e dai dati di spettrometria di massa.
(e) Lo spettro di assorbimento ultravioletto (UV) è mostrato in Figura 9 dei disegni allegati. Esso presenta un‘assorbanza massima di 303,3 nm { =27536), 317,0 ηηι ( =72192), 332,0 nm ( =90562), 348,5 nm ( =86534) ad una concentrazione di 0,0070 mg/ml in etanolo.
(f) Lo spettro di assorbimento infrarosso (IR) in pastiglia di Klìr è mostrato in Figura 10 dei disegni allegati e presenta i seguenti massimi di assorbimento (cm 1):
3402, 3014, 2970, 2936, 2879, 2041, 1725, 1636, 1457, 1379,
1311, 1266, 1175, 1109, 1072, 1008, 905, 847, 823, 745,
706, 583, 535, 515, 480.
(g) Lo spettro NMR dell' è mostrato in Figura lì e presenta segnali registrati con uno spettrometro BRUKER AM 300 MHz in esadeutero - dimeti1solfossido (DMS0d6).
I Chemical shifts sono stati riferiti indirettamente al TMS = 0,00 ppm { TMS) usando come riferimento interno il picco centrale dell'esadeutero - dimetilsolfossido preso a TMS = 2,56 ppm.
(I segnali maggiormente sovrapposti sono stati identificati tramite tecniche di NMR bidimensionale).
(ppm): 6,43-6,22 (m, 6H); 6,22-6,10 (m, 2H); 5,97 (dd,
IH); 5,60 (dd, IH); 5,33 (bs, IH); 5,03 (bs, IH); 4,96 (bs, IH); 4,92 (bs, IH); 4,85 (m, IH); 4,70 (m, IH); 4,42 (bs, IH); 3,94-3,36 (m, 6H); 2,41 (in, IH); 2,32 (m, IH); 2,20 (m, IH); 1,92-1,45 (m, 6H); 1,45-1,09 (m, 8H); 1,25 (d, 3H); 1,07 (d, 3H); 0,95 (d, 3H); 0,88 (t, 3H).
(h) Lo spettro NMR del C è mostrato in Figura 12 e presenta segnali registrati con uno spettrometro BRUKER AM 300 MHz in esadeutero - dimetilsolfossido (DMS0dc).
I chemical shifts sono stati riferiti indirettamente al TMS = 0,00 ppm ( TMS) usando come riferimento interno il picco centrale del dimetilsolfossido deuterato preso a TMS = 39,50 ppm.
1 dati relativi alla molteplicità dei segnali sono stati ottenuti mediante esperimenti di DEPT a 45°, 90° e 135°.
(ppm): 173,3 (d); 136,7 (d); 136,7 (d); 133,2 (d); 133,2
(d)-, 132,7 (d); 132,0 (d); 131,6 (d); 131,3 (d); 130,7 (d); 129,4 (d); 74,8 (d); 74,3 (d); 72,1 (d); 71,6 (d); 71,5 (d); 69,9 (d); 67,5 (d); 54,3 (d); 45,6 (d); 43,1 (t); 41,9 (t); DMSO; DMS0; DMSO; DMSO; 22,7 (t); 22,2 (t); 19,1 (q); 15,6 (q); 11,5 (q); 10,4 (q).
(i) Coefficienti di ritenzione in cromatografia su strato sottile con una corsa dell'eluente di 15 cm su lastre di silice in fase inversa RP-18 F 254 {Merck-Schuchardt) e di silice in fase inversa RP-8 F 254 (Merck-Schuchardt), nei seguenti sistemi di eluenti:
eluente A = Acqua
eluente B = Acetonitrile
eluente C = Metanolo
eluente D = soluzione 10 mM di portata a pH = 3 con
Visualizzazione: 1) fluorescenza alla luce UV (366 nm)
2) reattivo preparato sciogliendo 20 g. di in una soluzione acquosa al 6% in
(1) il tempo di ritenzione dell'Antibiotico AB-023b è di 6,76 minuti, se analizzato su colonna HPLC in fase inversa nelle seguenti condizioni:
Colonna: Lichrosorb Merck RP-18, mm 250 x 4 Precolonna: Merck C18
Eluente: Acetonitrile: (52:48 V:V) Flusso: 1 ml/min Rivelatone: UV 333 nm Temperatura: 35°C.
Morfologia e caratteristiche colturali del microorganismo Streptomyces sp. NCIMB 40212.
Il microorganismo Streptomyces sp. NCIMB 40212, è stato isolato in un campione di suolo raccolto a Nairobi (Kenia) catalogato per uso interno di laboratorio con la sigla convenzionaie SD-58Ì.
Una coltura di questo microorganismo è stata depositata il 3 ottobre 1989, in accordo con il Trattato di Budapest, presso la National Collection of Industriai Bacteria (c/o The National Coìlection of Industriai and Marine Bacteria Ltd., Torry Research Station, P.O. Box 31, 135 Abeey Road, Aberdeen AB 98 DG - U.K.) dove le è stato accordato il numero di accesso NCIMB 40212.
Le caratteristiche morfologiche del microorganismo sono riportate nella Tabella A (i terreni di coltura sono indicati con il nome riportato nell'International Streptomyces Program).
Nelle Tabelle B e C sono riportate alcune caratteristiche colturali di questo ceppo.
(3) Eseguito con il kit API:API 20C della API System SA;
(4) Eseguito impiegando i Sensi-Disc (dimaetro 5 mm) commercializzati dalla BBL (Becton Dickinson Microbiology Systems). L'analisi per Microscopia elettronica a Scansione rivela che il micelio dello Streptornyces sp. NCIMB 40212 tende a formare filamenti di più ife attorcigliate e le catene di spore sono del tipo rectifiexibles con spore lisce. Queste caratteristiche assegnano il ceppo NCIMB 40212 al genere Streptornyces.
Come altri microorganismi, lo Streptornyces sp, NCIMB 40212 può subire variazioni e/o mutazioni spontanee od artificiali.
Ad esempio si possono ottenere dei varianti o mutanti artificiali mediante il trattamento del microorganismo con agenti mutageni chimici come, ad esempio, l'acido nitroso, la nitrosoguanidina, le alchil animine alogenate e simili o con agenti fisici come i raggi X, i raggi ultravioletti (UV) o le onde ad alta frequenza.
Si possono altresì ottenere varianti o mutanti spontanei isolando e selezionando differenti colonie ottenute dallo Streptornyces sp. NCIMB 40212.
Tutti i varianti e/o mutanti spontanei o artificiali che appartengono al genere Streptornyces e che producono gli Antibiotici AB-023 sono considerati equivalenti al microorganismo Streptornyces sp. NCIMB 40212 e sono inclusi nell'ambito della presente invenzione.
Processo per la preparazione degli Antibiotici AB-023.
Il processo per la preparazione degli Antibiotici AB-023 consiste nel coltivare lo Streptomyces sp. NCIMB 40212, o un suo variante o mutante spontaneo od artificiale, in condizioni di fermentazione aerobica controllata, in un mezzo nutriente acquoso e nel separare detti Antibiotici AB-023 con metodi di per se noti.
Possono essere utilizzati come mezzi nutrienti di coltura quelli comunemente impiegati per la produzione di antibiotici, tuttavia certi mezzi nutrienti di coltura risultano preferiti.
Detti mezzi di coltura devono contenere fonti di carbonio assimilabili e di azoto assimilabili dai microorganismi del genere Streptomyces, ed inoltre basse concentrazioni di sali inorganici e tracce di quei metalli necessari per la crescita e lo sviluppo dei microorganismi e per la produzione degli antibiotici. Dette tracce di metalli possono essere già presenti come impurità nelle fonti di carbonio ed azoto organico incluse nei mezzi di coltura per la crescita batterica, oppure, se necessario, possono essere aggiunte ai mezzi di coltura stessi.
Generalmente possono essere impiegati, come fonte di carbonio assimilabile, i carboidrati, in particolare i saccaridi come, ad esempio, destrosio, maltosio, lattosio oppure, in alternativa o come complemento, gli amidi ed i prodotti industriali assimilabili chimicamente agli amidi come, ad esempio, destrina o amido solubile, o anche polialcoli come, ad esempio, il glicerolo. Detti composti possono essere utilizzati singolarmente o in combinazione in proporzioni variabili.
La concentrazione ed il tipo di fonte di carbonio presenti nel mezzo di coltura dipende in genere dal tipo e dalla quantità degli altri componenti del mezzo, tuttavia sono soddisfacenti concentrazioni in peso tra lo 0,5 ed il 5%.
Come fonte di azoto organico possono essere impiegati estratti proteici come, ad esempio, estratto di lievito, estratto di carne e idrolizzato di caseina, oppure farine come, ad eseinpio, farina di soja, oppure prodotti industriali commercializzati a questo scopo come, ad esempio, Proflo, Corn Steep Liquor e Distiìlers Solubles. Questi composti possono essere impiegati singolarmente o in combinazione fra loro in proporzioni variabili. Le concentrazioni nel mezzo di coltura possono variare tra lo 0,2 ed il 6% in peso.
Come sali inorganici possono essere impiegati, ad esempio, sali di sodio, di potassio, di magnesio, di ferro, di ammonio e di calcio come fosfati, solfati, cloruri, carbonati e nitrati.
I metalli presenti in tracce nel mezzo di coltura possono essere, ad esempio, cobalto, ferro, manganese e simili.
Alcuni mezzi di coltura hanno dimostrato una capacità di stimolare la produzione degli Antibiotici AB-023 da parte dello Streptomyces sp. NCIMB 40212 come, ad esempio, le formulazioni acquose che vengono impiegate nei successivi esempi di preparazione:
TERRENO DI COLTURA A (PM8)
(ingredienti) (concentrazione in g/1)
arcido 20
glucosio 10
calcio carbonato 3
caseina idrolizzata 2
Proflo 2
estratto di lievito 2
estratto di carne 2
pH 7,0
TERRENO DI COLTURA B (PGC)
(in i) (concentrazione in g/1)
g1icerolo 30
Proflo 20
CaC03 3
pH
Il microorganismo Streptomyces sp. NCIMB 40212 può essere coltivato e fermentato per la produzione degli Antibiotici AB-023 a temperature da 20°C a 35°C, preferibilmente da 25°C a 30°C.
Le condizioni di pH possono generalmente variare da circa 5 a circa 9.
L'aria sterile insufflata nel mezzo di coltura viene generalmente impiegata in quantità tali da mantenere nel mezzo una concentrazione di ossigeno superiore al 20% della saturazione.
La produzione degli Antibiotici AB-023, durante la fermentazione, può essere seguita mediante saggi di attività biologica effettuati su campioni del brodo, utilizzando le specie fungine sensibili agli Antibiotici stessi.
La fermentazione ha una durata tale da ottenere una sostanziale attività antibiotica: tempi compresi tra le 24 e le 150 ore sono in genere sufficienti.
Separazione e purificazione del complesso Antibiotico AB-023 e dei suoi componenti Antibiotico AB-023a e AB-023b.
Dopo la coltivazione nelle condizioni di fermentazione suddescritte, il complesso Antibiotico AB-023 può essere separato dal brodo di cultura e successivamente purificato con metodi convenzionali nell'arte della fermentazione.
Tali metodi includono ad esempio l'estrazione con solventi, la precipitazione con non-solventi, l'ultrafiltrazione, la cromatografia su colonna in fase diretta o inversa, la cromatografia su resine macroporose non ioniche o ioniche, e simili.
Gli antibiotici prodotti nella fermentazione si trovano nella massa di micelio.
Un metodo preferito per recuperare il complesso Antibiotico AB-023 consiste nel separare per centrifugazione il brodo dalla massa di micelio, nell'estrarre il micelio così separato con etanolo o metanolo acquoso, nel separare il micelio esausto dall'estratto alcolico per filtrazione su carta concentrando l'estratto a secchezza sotto vuoto a dare un grezzo.
Π complesso Antibiotico AB-023 viene poi isolato dal grezzo mediante adsorbimento su resina polistirenica non ionica, ad esempio del tipo XAD-4 (Rohm and Haas Co.). La resina viene lavata con 2 volumi, riferiti al suo letto, di acqua e quindi eluita con 3 volumi, riferiti al suo letto, di un sistema eluente formato da un eluente A costituito da acqua ed un eluente B costituito da Metanolo/Acetonitrile (50:50, V:V), con un gradiente dal 20% all'80% dell'eluente B.
Le frazioni contenenti il complesso di antibiotici AB-023, individuate mediante saggi biologici di attività su Botrytis, sono cromatografate impiegando una colonna riempita con silice in fase inversa tipo MATREX Silice C18 (Amicon Europe, Lausanne, CH), con un sistema eluente formato da un eluente A costituito da acqua e da un eluente B costituito da acetonitri1e, impiegando un gradiente lineare dal 20% all'80% dell'eluente B nell'eluente A.
Le frazioni contenenti il complesso Antibiotico AB-023 vengono riunite e concentrate sotto vuoto fino a scomparsa totale del1lacetonitrile. Dalla sospensione acquosa così ottenuta precipita a freddo il complesso Antibiotico AB-023 sotto forma di un solido giallo.
Dopo separazione per centrifugazione del surnatante acquoso, ed essiccamento del precipitato alla pompa rotativa, si ottiene il complesso di Antibiotici denominato AB-023, composto prevalentemente degli antibiotici AB-023a e AB-023b in rapporto circa 1:1.
I singoli antibiotici AB-023a ed AB-023b possono essere separati fra loro cromatografando ulteriorrnente il complesso Antibiotico AB-023 su una colonna di silice in fase inversa tipo MATREX Silica C18 (Arnicon Europe, Lausanne, CH), con un sistema eluente formato da un eluente A costituito da acqua e da un eluente B costituito da acetonitrile, impiegando un gradiente lineare dal 20% all'80% dell'eluente B nell'eluente A.
ATTIVITÀ' BIOLOGICA
II complesso Antibiotico AB-023 ed i suoi componenti Antibiotico AB-023a ed Antibiotico AB-023b sono dotati di attività antifungina nei confronti dei funghi patogeni delle colture agricole dei cereali, degli alberi da frutto e delle colture orticole, nonché nei confronti di funghi patogeni dell'uomo.
Le attività antifungine in vitro degli Antibiotici AB-023 sono state determinate con i metodi qui di seguito descritti. Saggio di attività fungicida "in vitro".
L'attività antimicrobica degli Antibiotici AB-023 viene determinata con i metodi usuali supplementando un terreno agarizzato, in grado di sostenere la crescita della specie microbica sensibile, con concentrazioni crescenti dell'antibiotico. Per i funghi fitopatogeni è stata determinata la concentrazione minima espressa in p.p.m. di Antibiotici AB-023 che, in queste condizioni, inibisce completamente la crescita (MIC). Nella tabella D vengono riportati i dati di attività biologica ottenuti in vitro con i metodi descritti.
Risultati di attività antifungina strettamente analoghi vengono ottenuti impiegando i singoli Antibiotico AB-023a ed Antibiotico AB-023b.
Ai fini del loro impiego pratico, sia in agricoltura che in altri settori d'impiego, è utile usare gli antibiotici della presente invenzione sotto forma di opportune composizioni.
Queste composizioni contengono come principio attivo, oltre all'antibiotico secondo l'invenzione, veicolanti inerti solidi (ad esempio caolino, silice, talco, attapulgite, terra di diatomee etc.) o liquidi (ad esempio solventi organici, olii vegetali o minerali, acqua e loro miscele) ed eventualmente altri additivi di normale impiego in campo formulativo quali agenti tensioattivi, sospensivanti, disperdenti e bagnanti.
Per particolari esigenze applicative o per ampliare lo spettro d'azione delle composizioni, è possibile aggiungere alle coinposizioni sopra descritte altri ingredienti attivi quali, ad esempio, insetticidi, erbicidi e fungicidi.
Le dosi applicative variano in dipendenza di diversi fattori quali il tipo ed il grado d'infestazione, il tipo di composizione impiegata, fattori climatici ed ambientali.
Per impieghi pratici in agricoltura dosi di Antibiotici AB-023 comprese tra 10 e 500 g/ha forniscono soddisfacenti risultati.
Seguono alcuni esempi a scopo illustrativo ma non limitativo dell'invenzione.
Esempio Ί Una coltura dello Streptomyces sp. NCIMB 40212, cresciuta su sìant di terreno A (PM8) agarizzato, viene risospesa in 5 mi di acqua distillata sterile. Con tale sospensione viene inoculata una beuta contenente 100 mi di terreno A (PM8) che viene successivamente mantenuta in agitazione a 180 giri/min., a 28°C per 55 ore. Tale coltura viene utilizzata per inoculare un matraccio contenente 1 litro di terreno A (PM8) che viene successivamente mantenuto in agitazione a 150 giri/min., a 28°C per 40 ore. Con tale coltura viene quindi inoculato un fermentatore del volume nominale di 40 litri contenente 28 litri di terreno B (PGC). Mantenendo la temperatura a 28°C e la concentrazione dell'ossigeno disciolto superiore al 20% della saturazione, la fermentazione viene condotta per 74 ore.
Esempio 2
Una coltura dello Streptomyces sp. NCIM8 40212, cresciuta su slant di terreno A (PM8) agarizzato, viene risospesa in 6 mi di acqua distillata sterile. Con tale sospensione vengono inoculate 3 beute contenenti 100 mi ciascuna di terreno A (PM8) che vengono successivamente mantenute in agitazione a 180 giri/min., a 28°C per 48 ore. Tale coltura viene utilizzata per inoculare 50 beute contenenti 100 mi ciascuna di terreno B (PGC), con un inoculo pari al 5% del volume. Le beute vengono mantenute in agitazione a 180 giri/min., a 28°C per 72 ore. Il brodo così ottenuto viene quindi raccolto e separato dal micelio mediante centrifugazione a 6000 giri/min. per 20 minuti. Isolamento del complesso Antibiotico AB-0Z3.
10 litri di brodo di fermentazione vengono separati per centrifugazione dal micelio. Il micelio separato viene estratto con etanolo acquoso, quindi l'estratto etanolico del micelio viene concentrato sotto vuoto a piccolo volume e fatto percolare su una colonna poiistirenica non ionica, del tipo XAD-4 (Rohm and Haas Co.). La resina viene lavata con 2 volumi, riferiti al suo letto, di acqua e quindi eluita con 3 volumi, riferiti al suo letto, di un sistema eluente formato da un eluente A costituito da acqua ed un eluente 3 costituito da Metanolo:Acetonitrile (50:50, V:V), con un gradiente dal 20% all'80% dell'eluente B. Le frazioni contenenti il complesso Antibiotico AB-023 sono riunite e portate a secchezza a dare un grezzo. Il grezzo viene ripreso con 50 mi di una miscela di acetonitrile e acqua (20:80, V/V), con la quale è stata condizionata una colonna di silice in fase inversa tipo MATREX Silica C-18 (Amicon Europe, Lausanne, CH) (diametro della colonna 33 mm, altezza del letto di silice 30 cm). Il complesso Antibiotico AB-023 viene quindi eluito dalla suddescritta colonna cromatografica con un sistema eluente formato da acetonitrile e acqua in gradiente dal 20% all'80% di acetonitrile con volumi di 300 mi. Le frazioni contenenti il complesso Antibiotico AB-023, rilevate attraverso il saggio biologico su Botrytis, vengono riunite e concentrate sotto vuoto fino a scomparsa dell'acetonitrile. Dalla sospensione acquosa ottenuta precipita a freddo il complesso di antibiotici denominato AB-023 sotto forma di un solido giallo. Dopo centrifugazione ed essiccamento si ottengono 300 mg di complesso Antibiotico AB-023, formato prevalentemente dagli Antibiotici AB-023a e AB-023b in rapporto circa 1:1.
Isolamento dell'Antibiotico AB-023a e dell'Antibiotico AB-023b.
Gli Antibiotici AB-023a e AB-023b vengono isolati dal complesso AB-023 ripetendo una cromatografia su colonna di silice in fase inversa tipo MATREX Silice C18 (Amicon Europe, Lausanne, CH), (diametro della colonna 22 mrn, altezza del letto di silice 50 cm), con un sistema eluente formato da un eluente A costituito da acqua e da un eluente B costituito da acetonitrile, impiegando un gradiente lineare dal 20% all'80% delì'eìuente 8 nell'eluente A.
Si ottengono alcune frazioni contenenti l'Antibiotico AB-023a puro e alcune frazioni contenenti l'Antibiotico AB-023b puro, oltre ad alcune frazioni contenenti la miscela dei due come complesso AB-023. Portando a secchezza sotto vuoto le frazioni contenenti gli Antibiotici AB-023a e AB-Q23b puri, si ottengono 50 mg di Antibiotico AB-023a e 15 mg. di Antibiotico AB-Q23b sotto forma di un solido giallo.
Le caratteristiche chimico-fisiche del prodotto sono state riportate precedentemente.
Claims (11)
- Rivendicazioni 1. Complesso antibiotico AB-023, il quale è un solido caratterizzato da: (a) buona solubilità in dimetilsolfossido , in metanolo, in etanolo, in miscele di metanolo/acqua (1:1, V/V) e di etanolo/acqua (1:1, V/V); insolubile in acqua, idrocarburi, acetoni tri1e, cloruro di metilene, cloroformio ; (b) analisi elementare approssimata in percentuale: carbonio: 64,06; idrogeno: 8,78; non contiene azoto, fosforo e zolfo; (c) assorbenza massima all'ultravioletto di 304,0 nm, 317,2 nm, 332,4 nm, 350,4 nm ad una concentrazione di 0,022 mg/mi in etanolo: acqua (50:50, V:V); (d) massimi di assorbimento all'infrarosso (cm ^): 3402, 3014, 2970, 2936, 2879, 2041, 1725, 1636, 1457, 1379, 1311, 1266, 1175, 1109, 1072, 1008, 905, 847, 823, 745, 706, 583, 535, 515, 480; (e) spettro NMR dell' 1H, avente i principali picchi: (ppm): 6,43-6,24 (in, 12H); 6,24-6,07 (m, 4H); 5,96 s(fi), 2H); 5,62 (m, 2H); 5,33 (bs, IH); 5,19 (bs, IH); 5,03 (bs, IH); 4,96 (bs, 2H); 4,93 (bs, IH); 4,86 (m, 4H); 4,70 (m, 2H); 4,42 (bs, 2H); 3,94-3,36 (m, 12H); 2,41 (m, 2H); 2,32 (m, IH); 2,20 (m, IH); 1,92-1,45 (m, 6H); 1,45-1,09 (m, 42H); 1,25 (d, 6H); 1,11 (d, 3H); 1,07 (d, 6H); 0,95 (d, 6H); 0,88 (t, 3H); (f) spettro NMR del 13C, avente i principali picchi: (ppm): 173,7 {s); 173.1 (s); 136.5 (d); 136.5 (d) 136.5 (d); 136,3 (d); 133,1 (d); 133,1 (d) 132,9 (d); 132.9 (d); 132.7 (d); 132.5 (d) 132.1 (d); 131.9 (d); 131.6 (d); 131,4 (d) 131.2 (d); 131.1 (d); 130.6 (d); 130,3 (d) 129.5 (d); 129.2 (d); 74.7 (d); 74,4 (d) 74,1 (d); 73,6 (d); 72,0 (d); 71,9 (d); 71,5 (d); 71,4 (d); 71,4 (d); 71,2 (d); 69,7 (d); 69.6 (d); 67,7 (d); 67,3 (d); 54,1 (d); 46,1 (d); 45,5 (d); 45,4 (d); 43,4 (t); 42,9 (t); 41.7 (t); 41,5 (t); 40,1 (d); 39,5 (d); 38,9 (t); 38,9 (t); 38,8 (t); 38,7 (t); 38,2 {t); 38,1 (t); 22,5 (t); 22,4 (t); 22,1 (t); 19,0 (q); 18,7 (q); 15,9 (q>; 15,6 (q); 13,2 (q); 11,3 (q); 10,4 {q); 10,2 (q); (g) tempo di ritenzione (Rt) di 3,65 minuti mediante HPLC in fase inversa su colonna Lichrosorb Merck RP-18, mm 250 x 4, precolonna Merck C18, eluendo con metanolo: H2O (86:14 V:V), con un flusso di 1 ml/min alla temperatura di 35°C, ottenibile mediante coltivazione aerobica controllata dallo Streptomyces sp. NCIMB 40212.
- 2. Antibiotico AB-023a, componente del complesso Antibiotico AB-023, il quale è un solido caratterizzato da: (a) buona solubilità in dimetilsolfossido, in metanolo, in etanolo, in miscele di metanolo/acqua (1:1, V/V) e di etanolo/acqua (1:1, V/V); insolubile in acqua, idrocarburi, acetonitrile, cloruro di metilene, cloroformio; (b) analisi elementare approssimata in percentuale: carbonio: 63,88; idrogeno: 8,64; non contiene azoto, fosforo e zolfo; (c) peso molecolare di 550 Da; (d) assorbanza massima all'ultravioletto di 303,0 nm ( =22078), 316,6 nm ( =44979), 331,6 nm ( =71198), 349.8 nin ( =71952) ad una concentrazione di 0,0073 mg/vnl in etanolo; (e) massimi di assorbimento all'infrarosso (cm 3402, 3014, 2970, 2936, 2879, 2041, 1725, 1636, 1457, 1379, 1311, 1266, 1175, 1109, 1072, 1008, 905, 847, 823, 745, 706, 583, 535, 515, 480; (f) spettro NMR dell’ avente i principali picchi: (ppm): 6,32 (IH, 6H); 6,17 (m, IH); 6,16 (m, IH); 5,93 (dd, IH); 5,64 (dd, IH); 5,18 (d, IH); 4,96 (d, IH); 4,87-4,85 (ni, 3H); 4,70 (m, IH); 4,43 (d, IH); 3,86 (rn,. IH); 3,77 (m, IH); 3,68 (m, IH); 3,57 (m, IH); 3,51 (m, IH); 3,48 (m, IH); 2,40 (m, IH); 2,32 (m, IH); 1,68 (m, IH); 1,46-1,09 (m, 14H); 1,24 (d, 3H); 1,11 (d, 3H); 1,07 (d, 3H); 0,93 (d, 3H); (g) spettro NMR del C, avente i principali picchi: (ppm): 173,7 (s); 136,5 (d); 136,3 (d); 132,9 (d); 132.9 (d); 132,5 (d); 132,1 (d); 131,6 (d); 131,2 (d); 130,3 (d); 129,5 (d); 74,4 (d); 73,6 (d); 72,0 (d); 71,4 (d); 71,2 (d); 69,6 (d); 67,7 (d); 46,1 (d); 45,4 (d); 43,4 (t); 41,5 (t); DMSO*; DMSO*; DMSO*; 38,2 (t); 22,4 (t); 18,7 (q); 15,9 (q); 13,2 (q); 10,4 (q); (h) coefficienti di ritenzione mediante cromatografia su strato sottile su lastra di silice in fase inversa RP-13 F 254 Merck-Schuchardt (a) e di silice in fase inversa RP-8 F 254 Merck-Schuchardt (b) rispettivamente: (a) 0,16 in acqua: acetonitrile 50:50 V/V; 0,00 in metanolo: soluzione acquosa contenente 10 mM di portata a pH = 3 con70:30 V/V; (b) 0,30 in acqua:acetonitri1e 50:50 V/V; 0,14 in metanolo:soluzione acquosa contenente IO mM di portata a pH = 3 con70:30 V/V; (i) tempo di ritenzione di 6,18 minuti mediante HPLC in fase inversa su colonna Lichrosorb Merck RP-18, min 250 x 4, precolonna Merck C18, eluendo con acetonitrile: (52:48 V:V), con un flusso di 1 mi/min , alla temperatura di 35°C.
- 3 Antibiotico AB-023b, componente del complesso Antibiotico AB-023, il quale è un solido caratterizzato da: (a) buona solubilità in dimetilsolfossido, in metanolo, in etanolo, in miscele di metanolo/acqua (1:1, V/V) e di etanolo/acqua (1:1, V/V); insolubile in acqua, idrocarburi, acetonitri1e, cloruro di metilene, cloroformio; (b) analisi elementare approssimata in percentuale: carbonio: 65,18; idrogeno: 8,87; non contiene azoto, fosforo e zolfo; (c) peso molecolare di 564 Da; (d) assorbenza massima all'ultravioletto di 303,3 nm { =27536), 317,0 nm { =72192), 332,0 nm ( =90562), 348,5 nm ( =86534) ad una concentrazione di 0,0070 mg/ml in etanolo; (e) massimi di assorbimento all'infrarosso (cm 1): 3402, 3014, 2970, 2936, 2879, 2041, 1725, 1636, 1457, 1379, 1311, 1266, 1175, 1109, 1072, 1008, 905, 847, 823, 745, 706, 583, 535, 515, 480; (f) spettro NMR dell' avente i principali picchi: (ppm): 6,43-6,22 (m, 6H); 6,22-6,10 (m, 2H); 5,97 (dd, IH); 5,60 (dd, IH); 5,33 (bs, IH); 5,03 (bs, IH); 4,96 (bs, IH); 4,92 (bs, IH); 4,85 (m, IH); 4,70 (m, IH); 4,42 (bs, IH); 3,94-3,36 (m, 6H); 2,41 (m, IH); 2,32 (m, IH); 2,20 (m, IH); 1,92-1,45 (m, 6H); 1,45-1,09 (m, 8H); 1,25 (d, 3H); 1,07 (d, 3H); 0,95 (d, 3H); 0,88 (t, 3H); 13 (g) spettro NMR del C avente i principali picchi: (ppm): 173,3 (d); 136,7 (d); 136,7 (d); 133,2 (d); 133.2 (d); 132,7 (d); 132,0 (d); 131,6 (d); 131.3 (d); 130,7 (d); 129,4 (d); 74,8 (d); 74,3 (d); 72,1 (d); .71,6 (d) 71,5 (d); 69,9 (d); 67,5 (d); 54,3 {d); 45,6 (d); 43,1 {t); 41,9 (t); DMSO; DMSO; DMSO; DMSO; 22,7 (t); 22,2 (t); 19,1 (q); 15,6 (q); 11,5 (q); 10,4 (q); (n) coefficienti di ritenzione mediante cromatografia su strato sottile su lastra di silice in fase inversa RP-18 F 254 Merck-Schuchardt (a) e di silice in fase inversa RP-8 F 254 Merck-Schuchardt (b) rispettivamente: (a) 0,16 in acqua:acetonitrile 50:50 V/V; 0,00 in metanolo:soluzione acquosa contenente 10 mM di portata a pH = 3 con 70:30 V/V; (b) 0,28 in acqua-.acetonitrile 50:50 V/V; 0,12 in metanolo:soluzione acquosa contenente 10 mM di portata a pH = 3 con 70:30 V/V; (i) tempo di ritenzione di 6,76 minuti mediante HPLC in fase inversa su colonna Lichrosorb Merck RP-18, mm 250 x 4, precolonna Merck C18, eluendo con acetonitrile: (52:48 V:V), con un flusso di 1 ml/min, alla temperatura di 35°C.
- 4. Processo per la preparazione del complesso Antibiotico AB-023 comprendente la coltivazione dello Streptomyces sp. NCIMB 40212, o di un suo equivalente mutante, in condizioni di fermentazione aerobica controllata, in un mezzo nutriente acquoso comprendente fonti assimilabili di carbonio, azoto e sali inorganici, fino a che non si è ottenuta una sostanziale attività antibiotica, il successivo recupero di detto complesso antibiotico con metodi di per sè noti e, opzionalmente, la separazione dei principali componenti denominati Antibiotico AB-023a e AB-023b.
- 5. Processo secondo la rivendicazione 4, in cui la fermentazione viene effettuata a temperature comprese tra 20°C e 35°C.
- 6. Processo secondo la rivendicazione 4, in cui la fermentazione viene effettuata a un pH compreso tra 5 e 9.
- 7. Processo secondo la rivendicazione 4, in cui il complesso Antibiotico AB-023 viene isolato dal brodo di fermentazione mediante filtrazione e successivo impiego di tecniche cromatografiche.
- 8. Processo secondo la rivendicazione 4, in cui i componenti Antibiotici AB-023a e AB-023b vengono isolati mediante cromatografia su fase inversa in una colonna d1 gel di silice impiegando nell'eluizione un gradiente lineare dal 20% al 80% di acetonitrile in acqua.
- 9. La coltura biologicamente pura del microorganismo Streptomyces sp. NCIMB 40212, o di un suo equivalente mutante, capace di produrre il complesso Antibiotico AB-023 in quantità isolabiìi mediante fermentazione aerobica controllata in un mezzo nutriente acquoso comprendente fonti assimilabili di carbonio, azoto e sali inorganici.
- 10. Impiego di un composto scelto tra il complesso Antibiotico AB-023, l'Antibiotico A8-023a e l'Antibiotico AB-023b, quale fungicida.
- 11. Composizioni fungicide contenenti come ingrediente attivo un composto scelto tra il complesso Antibiotico AB-023, l'Antibiotico AB-023a e l'Antibiotico A8-023b, accanto a veicolanti inerti solidi o liquidi e opzionalmente ad altri additivi.
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|---|---|---|---|
| 0001 | Granted | ||
| TA | Fee payment date (situation as of event date), data collected since 19931001 |
Effective date: 19970814 |