FI72534B - Foerfarande foer framstaellning av antibiotika aklacinomycin a och b eller deras blandningar. - Google Patents

Description

725 34

Menetelmä syöpää estävien antibioottien aklasinomysiinien A ja B tai niiden seosten valmistamiseksi - Förfarande för framställning av antibiotika aklacinomycin A och B eller deras blandningar 5 Kyseessä oleva keksintö koskee uutta menetelmää tuumoreita estävien antibioottien aklasinomysiinien A ja B valmistamiseksi. Aklasinomysiinillä on rakennekaava: r COOCK-j 0: 0 OH H jä

Aklasinomysiini A:ssa R on tö 1 J-r- 1 ' i/CH '\ K(C H,)., IV/i I n i j

0M

Aklasinomysiini B:ssä R on (¾ i—n 0 I 1

Ah3\ N(CH3)2 0 I o .a v o 1 '2‘ 72534

Aklasinomysiinit A ja B kuuluvat antrasyklliniantlbioottiryhmään ja ovat tehokkaita erilaisia grampositiivisia bakteereja vastaan sekä estävät kasvainten kasvua eläimissä. Aklaslnomysllnlt A ja B sekä niiden valmistusmenetelmät kuvattiin ensimmäisen kerran 5 JP-patentissa 864851, jonka hakemispäivä on 27.7.1974. JP-patenttia vastaavat esimerkiksi GB-patentti 1491266 ja US-patentit 3988315 ja 4071411.

Yllä mainituissa patenteissa käytetään aklaslnomysllniä tuottavana kantana Streptomyces galllaeus MA 144 Ml, joka on talletet-10 tu amerikkalaisessa kantakokoelmassa American Type Culture Collectionrssa merkinnällä A.T.C.C. No. 31133 ja japanilaisessa Fermentation Research Institute:ssa merkinnällä FERM No. 2455.

Mainittu kanta omaa seuraavat tunnusmerkit: heikosti kehittynyt llmarlhmasto kiinteällä agar-kasvatusalustalla, väriltään har-15 maa. Muodostaa spiraalin muotoisia itiörihmastoja, itiöt ovat slleäpintalsla, ovaalin muotoisia, kooltaan 0,4 - 0,8 pm. Pesäkkeet ovat poimullisia ja substraattirihmasto keltaisenrus-kea. Liukeneva pigmentti puuttuu tai on vaaleanruskea. Joillakin agar-kasvatusalustollla syntyy keltaisenvihreä liukeneva 20 pigmentti.

Streptomyces galllaeus viljellään aerobisesti, kasvuoptlmi on 24-30eC, lämpötilassa 50eC ei ole kasvua. Se hydrolysoi liivatteen, peptonol maidon ja hydrolysoi heikosti tärkkelyksen. Melanoidipigmenttejä muodostuu orgaanisilla alustai11a. Se kasvaa 25 Pridheimin ja Gottliebin väliaineella, jossa an D-glukoosia, D-ksyloosia, L-arabinoosia, L-ramnoosia, D-galaktoosia tai ino-sitolia, mutta ei kasva väliaineella, jossa on D-mannitolia.

Kun kanta kasvatetaan ravintoliuoksessa, joka sisältää soijajauhoa, glukoosia, tärkkelystä sekä erilaisia suoloja aerobisissa 30 olosuhteissa, saadaan 36 tunnin kuluttua 46 mg/1 aklasinomysii- nlä A ja 23 mg/1 aklaslnomysllniä B.

Il '3" 72534

Antibiootit ovat" sekä rihmastossa että kasvvliuoksessa. Niiden uuttaminen rihmastosta tapahtuu asetonilla Ja kasvulluoksesta etyyliasetaatilla. Uutteet yhdistetään ja aklasinomysiinit A ja B erotetaan kolonnlkromatografiän avulla. Saadut aklasinomysii-5 nit A ja B sisältävät epäpuhtautena E-pyrromysUniryhmän antibiootteja, jotka poistetaan käsittelemällä kupari-ioneilla.

Yllä mainitun tunnetun menetelmän heikkoutena on mikro-organismin alhainen tuotantokyky. Aklasinomysiinien lisäksi muodostuu eräitä E-pyrromysiiniryhmään kuuluvia antibiootteja, 10 josta syystä kemiallisen puhdistuksen teknologia mutkistuu.

Esillä olevan keksinnön päätavoitteena on ollut löytää uusia , aklasinomysiinejä A ja B tuottavia viljelmiä, joilla on korkeampi aktiivisuus aklasinomysiinln A tuottamisessa verrattuna tunnettuun, ja jotka syntetisoivat näitä antibiootteja pääkompo-15 nentteina.

Etsinnän tuloksena löydettiin maanäytteestä Keski-Aasiassa uusi kanta 12/3-A, joka kuuluu Streptomyces lavendofoliae lajiin, ja joka muodostaa aklasinomysiiniä A pääkomponenttina.

Kanta Streptomyces lavendofoliae on talletettu kantakokoelmassa 20 Antibiootti—instituutissa merkinnällä VNIIA No. 1670 20.1.1982.

Tämän instituutin (VNIIA) mikro-organismien kantakokoelma on rekisteröity kantakokoelmlen kansainväliseen liittoon v. 1972, No. 337.

Lisäksi Streptomyces lavendofoliae kanta 12/3-A on talletettu 25 kantakokoelmassa Centraalbureau voor Schirrmelcultures (CBS) 31 maaliskuuta 1983, noilla CBS 261.83 . · - 4 - 72534

Streptomycee lavendofoliae kanta 12/3-A omaa aeuraavat morfologiset, fysiologiset ja antagonistiset ominaisuudet.

MORFOLOGISET TUNNUSMERKIT

Streptomyces lavendofoliae kanta 12/3-A muodostaa runsaan lilan-vaa-5 leanpunaisen ( Ä 3) ilmarlhmaston. Itiörihmat ovat spiraalin muotoisia, ltltJt slleäpintalsla, kooltaan 0,7-1,4 ym. Subs-traattirlhmasto on belge-vaaleanpunaista, jopa likaisen Illan väriin aetl (K1+M2). Kasvualustaan erittyvä pigmentti on tumaan ruskea, jop&ruskeanvaaleanpunaisen-violettiväriin asti (K1+ 10 Γ2+Η2). värit on määritelty Bondarzevin väriskaalan mukaan, SNTL Tiedeakatemian julkaisu vuodelta 1954.

Viljelmin kasvu tapahtuu 28°C:n lämpötilassa 28 vrk:n ajan.

Taulukko 1

Kasvualusta_Kuvattava_Ominaisuudet_ 1_2_3_

Teapekan agar ilmarihmasto hyvin kehittynyt, lilan- vaaleanpunainen ( *3) substraatti- belge-vaaleanpunaisen-lilan rihmasto värinen (K1+K2) liukeneva ruskean-vaaleanpunainen pigmentti (Kl)

Gause I agar ilmarihmasto runsaskasvulnen, vaa leanpunaisen värinen ( K3+A3) substraattlrih- harmaan-1Ikäisen vlole- masto tin värinen (Γ2+Η2) liukeneva ruskean-vaaleanpunaisen värinen pigmentti (Kl) / li 1_2_3__ - 5 - 72534

Krasiljnikovin llmarlhmasto runsaskasvuinen,lila- vaalean- kasvualusta 1 punainen ( 13) substraatti- beige-likaisen violetti rihmasto (K1+H2) liukeneva ruskea-vaaleanpunaisen pigmentti violetti (Κ1+Γ2+Η2) Tärkkelys-agar ilmarihmasto kasvu kohtalainen, vaaleanpunainen ( W3) substraattirih- beige-vaalean- (Kl) masto punainen liukeneva beige-vaalean- (Kl) pigmentti punainen

Glukoosi- ilmarihmasto kasvu runsas, vaalean- asparagiini harmaa (K 6) substraatti- hiekanruskeasta rihmasto ruskeaan (J17-K7) liukeneva hiekanruskea pigmentti (J17-+K7)

Waxmanin agar ilmarihmasto kasvu runsas, punerta van harmaa (A3) substraatti- ruskearn kastanjan rihmasto ruskean väristä aina likaiseen violetti-väriin asti (B2-H2) liukeneva ruskeertuimanruskea pigmentti (B2) r - 6 - 72534 1_2_3 _

Hiivan ja liukenevan ilmarihmasto kasvu runsas, punerta- tärkkelyksen-agar van harmaa (A3) substraatti- ruskea (B 7) rihmasto liukeneva hiekanruskeasta pigmentti ruskeaan väriin asti (B7-K7)

Glukoosi-hiiva- ilmarihmasto kasvu runsas, vaaleahko agar (Dl) substraatti- tummanruskea (JI5) rihmasto liukeneva ruskea (K 7) pigmentti

Kaura-agar ilmarihmasto kasvu hyvä, punertavan harmaa (A3) substraatti- turtmanruskea-ruskea (®2) rihmasto liukeneva vaaleanruskea (B7) pigmentti

Mallas-agar Ilmarihmasto kasvu runsas, punerta van harmaa (A3) substraatti- ruskea-kastanjanruskean rihmasto värinen (K7+K4) liukeneva tummanruskea- (B2-H<7) pigmentti ruskea t li 1_2_3_ - 7 - 72534

Gauee 2 agar ilmarlhmaeto kasvu tyydyttävä, vaaleanharmaa (A6) substraatti- ruskea (K 7) rihmasto liukeneva ruskea (K 7) pigmentti MPA ilmarihmasto kasvu heikko substraatti- beige-hiekan värinen rihmasto (5 6) liukeneva puuttuu pigmentti

Tyrosiini-agar ilmarihmasto kasvu runsas, lila-vaalean punainen ( )K3) substraatti- luumunmusta (01) rihmasto liukeneva umbra-värinen (07) pigmentti

Tresnerin-agar ilmarihmasto kasvu hyvä, lila-vaalean- rautasitraatti- punainen ( K 3) liuoksella substraatti- tumman umbravärinen rihmasto (Π2) liukeneva tumman umbravärinen pigmentti (Π2) - 8 - 72534 1_2_3_

Perunavllpaleet ilmarihmasto kasvu hyvä, valkoisesta vaaleanpunaisen väriseen asti (D3- K3) substraatti— tuiunanruskea rihmasto (Kl-Bl) liukeneva turmanruskea pigmentti (Kl-Bl)

FYSIOLOGISET TUNNUSMERKIT

Aerobi, kasvun optimilämpötila on 24-30“C. Lämpötilassa 50eC ei ole kasvua. Liuottaa liivatteen kohtalaisesti, peptonoi maidon, joka tummenee, hydrolysoi tärkkelyksen kohtalaisesti. Synnyttää 5 melanoideja (Tresnerin kasvualusta rautasitraatin kanssa, (ty- rosiini-agar).

Streptomyces lavendofoliae kanta 12/3-A käyttää hyvin seuraavat hiililähteet: D-glukoosi, D-ksyloosi, L-arabinoosi, D-fruktoosi, D-galaktoosi, inositoli. Se käyttää heikosti tai ei lainkaan 10 seuraavia aineita: L-ramnoosi, sakkaroosi, raffinoosi ja D-manni-toli. Streptomyces lavendofoliae kanta 12/3-A säilyy agar vino-pinnalla vaselilnlöljykerroksen alla lämpötilassa +5°C kuuden kuukauden ajan.

ANTAGONISTISET TUNNUSMERKIT

15 Streptomyces lavendofoliae 12/3-A viljellään nestemäisessä ravintoalustassa ravisteluastiassa. Kolmen vuorokauden kuluttua syntyy aklaslnomysilnlä A noin 56-60 mg/1, jolla on seuraava antlmlkroblnen vaikutus, sytotoksinen aktiivisuus ja kasvaimia estävä vaikutus tutkittuna koe-eläinten avulla (taulukot 2-4)· f li 72534 - 9 -

Taulukko 2

Streptomyces lavendofoliae 12/3-A:n tuottaman aklaslnoroyellnl A:n ja vertailuaineen antlmlkrobiepektrlt.

KOEORGANISMIT _MIC pg/ml 1)_ S tr. lavendofoliae Japanilaisen (Tokio) 12/3-A:n tuottama Zaidanhojin Bisei- aklasinomysiini A but su Kagaku Kenkyu- kai'n valmistama

__ '_aklasinomysllnl A

_1_2_3_

Staphylococcus aureus 209P 15,56 7,8

Staph, aureus 209P, resistentti streptomysiinille 15,56 15,56 res. penisilliinille 15,56 15,56 res. gentamysiinille 15,56 15,56 res. kanamysUnille 11,6 11,6 res. oleandomyslinille 15,56 11,6 res. llnkomysiinille 15,56 23,3 res. violariinille 23,3 19,0 res. erytromysiinille 31,2 23,2 res. daktinomysiinille 31,2 70,0 res. novobiosiinille > 250,0 >250,0 res. rifampisiinille 125,0 125,0 res. vankomysilnllle 125,0 125,0 E.coli 675 > 250,0 >250,0

Pseudomonas aeruginosa >250,0 ^250,0

Klebsiella pneumoniae 444 >250,0 ^250,0

Providencia stuartil ATCC 7240 >250,0 -^250,0

Candida albicans >250,0 ^250,0

) MIC, pienin kasvua estävä lääkeainepitoisuus määritetään kasvattamalla kahtena rlnnakkaiskokeena mikrobin standardisiirrosta 10^ kpl/ml kasvavan lääkeainepitoisuuden sisältävässä peptoni-lihaliemi elatusaineputkisarjassa 20 tuntia lämpötilassa 37eC

ja pH-arvossa 7,0.

- 10 - τ . , 72534

Taulukko 3

Akia sinomys Unin A kasvaimia estSvB vaikutus eläinkokeissa.

Kanta Käyttttaika Optimlannos Eliniän kes- Kasvaimen eläin (vrk) (mg/kg) kimaMrainen kasvun hi- __pidentyminen (Z) dastus (%)

La CB^ 1-*9 2,5 92

LLC

CBF1 1->9 5 67 S-37 jalostamat- 1-^5 2,5 80 tomat hiiret

Taulukko A

Aklasinomyslinin A ja sen DNA-kompleksin sytostaattinen vaikutus kasvainsolulhln P-388 suspendoidussa viljelmässä.

x)

Preparaatti ED50 * Pg/®1

Aklasinomysilnl A 0,01

Aklaslnomysiini A- DNA-kompleksi 0,01 x) Annos, joka hidastuttaa nukleiinihappojen tuottamista (DNA + RNA) 50 Z.

Tulokset keksinnttnmukaisen kannan 12/3-A tunnusmerkkien vertailusta aklaslnomysllnlen A ja B tunnettua tuottajaa Streptomyces galilaeus MA 144M1 kuvaavien timnusmerkkien kanssa vahvistavat, että niiden viljelmien morfologiset ja fysiologisi ominaisuudet eroavat toisistaan. r

II

72534

Toisaalta keksinnönmukainen kanta vastaa mainituilta tunnusmerkeiltään Streptomyces lavendofollae:n ominaisuuksia Bergeyn määritelmän mukaan (taulukko 5)·

Taulukko 5

KeksinnOnmukaisen kannan 12/3-A viljelmän morfologisten ja fysiologisten ominaisuuksien vertailu prototyypin Str. galilaeus MA 144M1 ja Str. lavendofoliae ominaisuuksiin.

Kuvattava Kanta Str. galilaeue Str. lavendo- 12/3-A MA 144M1 foliae _(prototyyppi)_ 1_2_3_4_

Itiörihmat spiraallmuotolsla spiraallm. splraallm.

ItiOt sileät, ovaalin sileät, ovaalin sileät, muotoiset muotoiset ovaalin m.

Synteettiset kasvualustat:

Ilmarihmasto kasvu hyvä, jopa kasvu kohtalai- kasvu hyvä, runsas, sinipuner- nen, vaalean- lila-vaalean-tava (M3) harmaasta har- punainen maaseen väriin

Substraatti- belgepunertavasta keltaisenruskea keltalsen- rihmasto likaisen lilan joissakin kasvu- ruskeasta väriin (Π 7-M2) alustoissa kel- tunrran- talsenvlhreä ruskeaan

Liukeneva tvjliiienruskeasta puuttuu tai keltaisen- pigmentti turnrianruskeanpu- ruskea ruskea tai nertavan violettiin tunmanruskea (Κ1+Γ2+Η2) 1_2___3_A_ - 12 - 72534

Orgaaniset kasvualustat:

Ilmarihmasto kasvu hyvä, puner- kasvu kohtalai- kasvu hyvä, tavan harmaa (A3) nen, vaalean- lila-vaaleanharmaa punaisesta vio lettiin

Substraatti- hlekanruskeasta keltaieenruskea tummanruskea tai rihmasto ruskeaan (J17-H37-K7) erittäin tumnan- ruskea

Liukeneva tunmanruskea ruskea tunmanruskea tai pigmentti (J17-B2-H<7) erittäin tunman ruskea

Perunan viipaleet:

Ilmarihmasto kasvu hyvä, valkoi- kasvu hyvä, vaa- kasvu hyvS, sesta punertavaan lean harmaa tummanruskea- (D3- Ä 3) punertava

Substraatti- tunman-(K 1+81) ruskeankeltai- tunmanruskea rihmasto ruskea nen

Liukeneva turnnan-^i+gi) kastanjan tunmanruskea pigmentti ruskea ruskea

Melanoldlt muodostuvat muodostuvat muodostuvat

Kasvu selluloosassa hyvä kohtalainen hyvB

Maito peptonoltuu peptonoituu peptonoltuu ruskeaksi kohtalaisesti ruskeaksi Tärkkelyksen hydrolysoi hydrolysoi hydrolysoi hydrolyysi kohtalaisesti heikosti kohtalaises ti

Gelatiinin kohtalainen heikko kohtalainen hydrolyysi 1_2_3_4_ - 13 - 72534

Ruokosokeri -+ - D-glukooei + + + D-ksyloosi + + + L-arabinoosi + + + L-ramnoosi - + - D-fruktoosi + + - D-galaktoosi + + +

Raffinoosi - + - D-mannitoli - - -

Inositoli - + - +

Viljelmän 12/3-A taksonominen määrittely suoritettiin kirjallisuuden perusteella: Krasiljnikov H.A. "Sädesienet", julkaisu "Nauka" v. 1970, sivut 172, 328; Bergey’s Manual of Determinative Bacteriology, Editors: Buchanan R.E., Gibbons N.E.

5 et.al., s. 808-810.

Ravintoalustana voi olla mikä tahansa Str. lavendofoliae-lajlin kuuluvan aklasinomysliniä tuottavan kannan käyttämä alusta.

Ravintoalustan hillllähteiksl suositellaan fruktoosia, glukoosia, arablnoosia, ksyloosla, galaktoosia, tärkkelystä ym.

10 Typen lähteenä voi olla lihaeketrakti, peptoni, malesi-ekstraktl, hiiva-ekstrakti, kaseiinihydrolysaatti, maissijauho, soijajauho, puuvlllajauho ym., sekä vielä typpiyhdisteitä sisältävät orgaaniset ja epäorgaaniset yhdisteet, kuten ammoniumsuo-lat (nitraatit, sulfaatit, fosfaatit ym.), urea ja muut.

15 Kasvualustaan voidaan lisätä mineraalisuoloja, kuten kalsiumkar- bonaattla, natrium- ja kaliumfosfaatteja, natrium- tai kalium-kloridia, magnesiumsuolaa, kuparia ym.

S

- 14 - 72534 ^ AklasinomysUnien A Ja B suurempien määrien valmistamiseksi vil jely suoritetaan kaksivaiheisena ilmastettuna syväviljelmänä. Fermentorlen inokulolmiseksi käytetään vegetatiivista rihmastoa. Vegetatiiviata rihmastoa kasvattava alusta voi olla saman-5 lainen, jota käytetään aklasinomysiinien A ja 6 biosynteesissä, mutta voi olla myös toisenlainen.

Kasvualustojen tarkistetuista vaihtoehdoista todettiin, että kasvualustat B-2 ja B-3 olivat edullisimpia:

Raaka-aine _Kasvualustat_ _________B-2 (Z)_B-3 (Z) 1. Anmoniumsulfaatti 0,1 1,5 2. Soijajauho 1,1 1,5 3. Perunatärkkelys 2,6 3,0 4. Kalslumkarbonaatti 0,8 1,4 5. Natriumkloridi 0,3 0,3 6. Kuparisulfaatti 0,007 0,007 7. Vaahdonestoaine AC-60 0,5 0,5

Kasvualustat steriloidaan lämpötilassa 124-126°C 30-40 min.

10 ajan, jonka jälkeen alustan pH on neutraali.

Str. lavendofollae, kanta 12/3-A kasvatettaessa Ilmastetuissa olosuhteissa 1 1 ilmaa/1 1 kasvualustaa minuutissa lämpötilan ollessa 20-30eC, pH:n ollessa n. 6-8,5, edullisesti 6,9-7,9, antaa 48-96 tunnin kuluttua aklasinomysiiniä A noin 60 mg/1 asti 15 ja aklasinomysiiniä B 4-10 mg/1.

Taulukko 6

Str. galilaeue (firman Zaidanhojln Biseibutsu Kagaku Kenkyukai, Tokio, Japani antibiootti) ja Str. lavendofollae :sta saadun aklasinomysiinin A fysikaalis-kemiallisten ominaisuuksien ver- 20 tailu.

li 72534 - 15 - _Antibiootteja tuottava kanta_ _Str. galllaeus MA144M1 Str. lavendofollae_ 1_2_3_ UV-spektrl x) N 1% X nm/E / 'v 1 cm max 90 % MeOH 431,5/146,1/290/112,1/ 431,5/148,6/,289/137,4/, 257/285,3/, 228/485,7/; 257/302,9/,228/502/: 0,1 N HC1 431,5/146,1/,257/285,3/, 431,5/151,4/,289/137,4/, 290/112,1/,228/485,7/; 257/302,9/228/499,2/; 0,1 N NaOH 521,3/118,9/,317,3/64,5/, 521,3/130/,318,3/78,5/, 285/101,9/,236/424,6/. 284/126,2/,236/440,3/.

xx) IR-spektrl ^ cm"1 3450, 2980, 2945, 2820, 3480, 2980, 2950, 2825, max 2760, 1735, 1675, 1620, 2775, 1735, 1680, 1625, 1600, 1010. 1600, 1010.

xxx) PMR-spektri S ppm 12,55, 1H, s.; 12,7, 1H, s.; 12,0, 1H, 12,0, 1H, s.; s.; 7,83, 1H, Jl-1,8 Hz, 7,15-7,85, 4H, m.; J2“7,8 Hz; 7*68» 1H» 5,58, 1H, s., J**7,8 Hz; 7,68, 1H, s.; 7,30, 5,31, 1H, s.; 1H, Jj-1,8 Hz, J2“7,8 Hz;

4,95-5,20, 2H, m.; 5,52, 1H, m.; 5,28, 1H

4,35-4,65, 2H, m.; m.; 4,95-5,20, 2H, m.; 4,11, 1H, B·; 4,40-4,70, 2H, m.; 4,11, 1H, s.; 3,68, 3H, s.; 3,70, 3H, s.; 2,3-2,7, 5H, m.; 2,25-2,65, 5H, m.; 2,23, 6H, 8.; 1,40-2,15, 2,20, 6H, s.; 8H, m.; 1,32, 3H, d., , J~6,6 Hz; 72534 - 16 - 1_2_3_ 1,45-2,15, 8H, m.; 1,29, 3H, d., J-6,4 Hz; 1,00-1,36, 12H, m.. 1,17, 3H, d., J-6,2 Hz; 1,08, 3H, t, J-7 Hz.

xxxx)

Massa-spektri o/z 376/100 %/, 114/2,6 Z/, 377/50 %/, 376/100 Z/, 794/15 Z/, 377/42,8 Z/, 812/30 Z/, 394/5,1 Z/, 416/1,5 Z/, 794/10,2 Z/, 812/28,8 Z/.

x) - UV-spektrit kuvattiin laitteella Pye Unleam SP-8-100, laite kalibroitu standardieuodattlmlen HO-720540 ja Di-720538 Pye Unicam:in avulla.

xx) - IR-spektrit kuvattiin laitteella UR-20 KBr-tabletieta. xxx) - PMR-spektrit kuvattiin 90 M Hz:n "Bruker-WH-90"-laitteella CDCl^:saa, TMS referenssinä, xxxx) - Kenttädesorbtion massaspektrit kuvattiin laitteella Varian Mat 311-A, kalibrointi PFK:lla. Virta emitte-rissä 5-20 mA.

Taulukko 7

Str. galilaeus:sta ja Str. lavendofollaersta saadun aklaslnomy-eilnin B fyslkaalle-kemialllsten ominaisuuksien vertailu.

_Antibiootteja tuottava kanta_ _Str. galilaeus MA144M1 Str. lavendofollae_ 1_2_3_

UV-epektri 1 Z

X nm/E / max 1 cm 90 Z MeOH 432/159/,289,5/137/, 431,5/149,2/,290/119/, 259/313/ ,229,5/498/; 257/296/ ,228/508/; 72534 - 17 - 1_2_3_

Ofl N HC1 431/162/,289,5/156/, 431,5/149/,290/119/, 259/355/,229/586/; 257/296/,228/503; 0,1 N NaOH 522/145/,315/101/, 521,3/127/,316,3/77,3/, 284/160/,239/510/. 285/119/,236/453/.

IR-spektri 3450, 2980, 2945, 2820, 3490, 2980, 2950, 2830, ^ cn"1 2760, 1730, 1675, 1620, 2780, 1735, 1680, 1625, max 1600, 1010. 1605, 1015.

PMR-spektri 12,2, 1H, s.:, 12,68, 1H, a.:, ^ppm 11,5, 1H, s.; 12,02, 1H, 8.; 7.2- 7,9, 4H, m.; 7,24-7,89, 4H, m.; 5.5, 1H, 8.; 5,48, 1H, s.; 5.1- 5,3, 3H, m.; 5,09-5,27, 3H, m.; 4,6-4,9, 2H, m.; 4,62-4,90, 2H, m.; 4.5, 1H, 8.; 4,53, 1H, s.; 4.3- 4,4, 1H, m.; 4,36, 1H, q.; 4,15, 1H, 8.; 4,11, 1H, 8.; 3,8-4,0, 2H, m.; 3,90-4,03, 2H, m.; 3,7, 3H, e.; 3,75, 1H, 8.; 2.2- 2,7, 4H, m.; 3,69, 3H, 8.; 2,2, 6H, s.; 2,58, 2R, d.; 1.4- 2,0, 8H, m.; 2,46, 1H, d.; 2,35, 1H, s.; 0,9-1,4, 12H, m.. 2,15, 6H, e.; 1,45-2,01, 8H, m.; 0,89-1,45, 12H, o..

Aklasinomysiinien A ja B UV-, IR- ja PMR-spektrit esitetHSn kuvissa 1-6 (FIG 1-6).

FIG 1 esittää aklasinorayslini A hydrokloridln UV-spektri 90 X metanollssa, FIG 2 eslttSM aklasinomysllni B hydrokloridln UV-spektri 90 % metanollssa, FIG 3 esittää aklasinomyslini A

/ - 18 - 72534 hydrokloridln IR-spektri KBr-tabletista, FIG 4 esittää aklaeino-mysilnl B hydrokloridln IR-epektri KBr-tabletieta, FIG 5 esittää aklaslnomysllnl A hydrokloridln PMR-epektri (CDCl-j'TMS; T»303°C) ja FIG 6 aklaslnomyellni B hydrokloridln PMR-epektri (CDClyTMS; 5 T-303°C).

Aklaslnomysilnit A ja B ovat rihmastossa ja kasvatusalustassa. Fermentaatlon päätyttyä kasvatusalusta suodatetaan pH:n ollessa 4,5-6,0. Kasvatusalustasta antibiootit uutetaan etyyliasetaatilla (10 tllavuusmittaa kasvatusalustaa kohden otetaan 1 tila-10 vuuemitta etyyliasetaattia).

Antibiootteja sisältävä orgaaninen kerros erotetaan rihmastosta. Liuottimien poistamisen jälkeen vesijäännökset yhdistetään ja neutraloidaan ρΉ 6,9:ään. Tämän jälkeen antibiootit uutetaan tolueenllla ja kaksinkertaisella tilavuusmltalla0,01 N HC1-15 liuosta. Vesiliuoksesta antibiootit uutetaan kloroformilla, joka kuivataan vedettömällä Na2S0^:lla. Kloroformiuute väkevöi-dään pyöröhaihduttlmessa 0,1 tilavuuteen ja jäännökseen lisätään 10-12 tilavuusosaa kuivaa heksaanla. Sakassa olevat antibiootit erotetaan ja kuivataan. Antibioottien puhdistus ja erottelu 20 suoritetaan kromatografiseetl vesipitoisella pilhapolla liuotin- systeemiesä, joka muodostuu hiilltetrakloridlsta ja isopropano-lista.

Taulukoissa 6 ja 7 esitetään aklasinomysUnien A ja B vertailu-tulokset, jotka on saatu UV-, IR-, PMR- ja massa-spektrometril-25 lä, todistaen näiden antibioottien yhtenevyyttä, jotka on saatu aikaan keksinnön mukaisten ja jo tunnettujen kantojen avulla.

Täten Str. lavendofollae kannan 12/3-A synnyttämät antibiootit aklasinomysllnlt A ja B ovat identtisiä antibioottien kanssa, jotka saadaan viljelmästä Str. galllaeus MA144M1. Aikaisemmin 30 el tunnettu Str. lavendofollaen tuotantokykyä saada aikaan akla- sinomysiinejä A ja B. Keksinnön mukaista valmistusmenetelmää voidaan havainnollisesti esittää seuraavien esimerkkien avulla.

Il % - 19 -

Esimerkki 1 7 2 5 3 4

Streptomycee lavendofollae 12/3-A kantaa kasvatetaan kiinteellä kaura-agar kasvatusalustalla lämpötilassa 28°C 12 vuorokautta runsaan llmarihmaston kehittymiseen saakka. Kasvusto siirretään 5 750 ml:n erlenmeyerpulloon B-2 kasvatusalustaan, joka el sisällä kuparlsulfaattla tai vaahdonestoainetta. Pulloa sekoitetaan ravistelemalla nopeudella 250 rpm lämpötilassa 28°C 2 vuorokauden ajan. Erlenmeyerpullossa kasvanutta viljelmää siirretään 5%:n määränä 10 l:n sllrrosfermentoriln B-2 kasvatusalustaan, joka ei sisällä 10 kuparlsulfaattla. Fermentoria sekoitetaan nopeudella 200 rpm ja ilmastetaan 10 1/mln lämpötilassa 28°C 1 vuorokauden ajan.

3 litraa siirrosfermentorissa kasvanutta viljelmää siirretään 100 1 fermentoriln 60 l:aan B-2 kasvatusalustaa. Fermentoria sekoitetaan nopeudella 200 rpm ja ilmastetaan 60 1/mln lämpöti-15 lassa 27eC 3 vuorokauden ajan.

Kasvatusalustassa olevan aklaslnomysiinin A ja B pitoisuus määritetään seuraavan menetelmän mukaan: 1. Rihmastossa olevan aklaslnomysiinin A ja B pitoisuuden määritys 20 Fermentaation päättyessä erotetaan rihmasto 5 ml:sta kasvatus-alustaa linkoamalla 2000 rpm 10 min ajan. Saadusta rihmastosta antibiootit uutetaan 2 tunnin ajan A ml:11a asetonia, seos sekoitetaan 15-20 min väliajoin. Asetoni haihdutetaan 1,0 ml:sta uutetta vakuumissa, lämpötilan ollessa alle 40°C ja jäännös uu-25 tetaan 1,0 ml:11a kloroformia. Konsentroitu kloroformiuute käytetään antibioottikompleksln kromatografiseen erottamiseen.

Tähän tarkoitukseen otetaan levy, jolle on levitetty adsorbent-tikerroe, ja jonka vasen sivu ja alareuna jätetään vapaaksi 2 cm matkan. Levylle levitetään kapillaarilla koko kloroformiuute 30 1-1,5 cm leveäksi viivaksi. Samalle levylle levitetään aklasl- nomyelinlen A ja B standardllluos. Levy asetetaan kromatogra-fiakammloon, jossa on kloroformi-etyyliasetaatti-metanoli-seosta suhteessa 7:2:1. Kun nesterintama on edennyt levyn reunalle asti, levy otetaan ulos ja kuivataan ilmassa 20 min.

- 20 - 725 34

Keltaiset vyöhykkeet, jotka vastaavat liikkuneita eklasinomysll-ne ja A ja B, eluoIdaan erikseen 4 ml :11a metanolla (pH-6) ja mitataan spektrofotometrlsestl aaltopituudella 430 nm. Akiae1-nomysllnlen määrät (mg/1 viljelmjin^stettä) lasketaan 5 niiden ekstinktioarvojen perusteella (E 1 cm aklaelnomyslinllia A Ja B on 161 ja 159, J. Antibiotics, 1979 32^, nro 8, slv. 781-800) seuraavan kaavan mukaan:

aklasinomysiini A Cmg/1 199 D

aklasinomysiini B Cmg/1 * 201 D

10 2. Aklasinomysiinin A ja B pitoisuuden määritys kasvatusalus tasta 5 ml:sta kasvatusalustaa erotetaan rlhmaeto linkoamalla. Uutetaan etyyliasetaatilla pH:ssa 6 suhteen ollessa 5 ml alustaa ja 5 ml etyyliasetaattia. 2 ml etyyllasetaattluutetta haihdutetaan 15 vakuumlssa ja jäännös uutetaan 2 ml:11a kloroformia. Jatkotoimenpiteet ovat kuin kohdassa 1.

AklasinomysUnien A ja B määrät lasketaan antibioottien ekstlnk-tloarvojen perusteella seuraavan kaavan mukaan:

aklasinomysiini A C mg/1 * 124,2 D 20 aklasinomysiini B C mg/1 · 125,8 D

3 vuorokauden fermentaation jälkeen kasvualustassa B-2 tuottaa viljelmä 12/3-A aklasinomysliniä A noin 56 mg/1 ja aklasinomy-silniä B noin 4-8 mg/1.

Aklasinomyeiinien A ja B erottamiseksi kasvatusalustasta 60 1 25 suodatetaan lmusuodattimella pH:n ollessa 4,5-5,0. Kasvatus- alustassa olevat antibiootit uutetaan etyyliasetaatilla suhteessa 10:1. Orgaaninen kerros erotetaan ja haihdutetaan vakuumissa pyöröhaihduttimesea lämpötilan ollessa korkeintaan 40°C kunnes jäännös on vesiliuos. Kostea rihmasto (5 kg) uutetaan kahdesti 30 10 1:11a asetonia. Rihmasto erotetaan suodattamalla ja heite tään pois. Asetoniuutteet yhdistetään Ja haihdutetaan. Etyyliasetaatti- ja asetonihalhdutusten vesijäännökset yhdistetään ja näin saatu konsentraattl (5 1) neutraloidaan pH arvoon 6,8 10 Z NaOH-liuoksella ja antibiootit uutetaan 3 x 10 1:11a tolueenla.

li - 21 - 72534

Tolueenluutteet yhdistetään ja vesikerros heitetään pois. Tolu-eeniuute (30 1) haidutetaan vakuumlesa lämpötilan ollessa korkeintaan A0°C kunnes jäännös on 3 1. Antibiootit uutetaan tästä tiivisteestä 0,5 kertaiselle tllavuusmäärällä 0,01 N HC1. Uut-5 tovaiheeeea muodostunut emulsio hajoitetaan sentrifuugissa.

Vesiliuoksessa olevat antibiootit uutetaan 0,5-kertaisella tila-vuusmäärällä kloroformia. Uuttoaika on 20-30 min seosta koko ajan sekoittaen.

Syntynyt emulsio hajoitetaan sentrlfuugissa. Kloroformikerros 10 (1,5 1) otetaan talteen ja kuivataan 4 tuntia vedettömällä

Na2S0^:llä (lOg N^SOa/IOO ml uutetta). Na2s°4 suodatetaan ja kloroformi tislataan vakuumlesa pyöröhaihduttimessa 0,1 tilavuuteen asti. Jäännökseen lisätään 10-12 tilavuusosaa kuivaa hek-eaania, jolloin muodostuu sakka, jonka annetaan laskeutua (30 15 min). Sakassa olevat antibiootit suodatetaan lasisuodattlmella nro 4 ja kuivataan. Suodos haihdutetaan kuiviin pyöröhaihduttimessa lämpötilan ollessa korkeintaan 40°C. Jäännös lietetään heksaanlln ja heksaanl erotetaan suodattamalla. Molemmat sakat yhdistetään ja puhdistetaan kromatograflsesti. Saanto raakaa 20 tuotetta on 2,5 g.

Aklasinomysiinien kromatografinen erottaminen

Kolonni (8 x 95 cm) täytetään 5,5 1:11a suspensiota, joka koostuu 1,8 kg:eta vesipitoista pilhappoa (250-400 ym) ja 5,5 l:sta kloroformia, johon on liuotettu 0,5 Z trietyyliamiinia ja etik-25 kahappoa. Täytön jälkeen kolonni huuhdellaan 3 1:11a klorofor mia. Lieätään yllä kuvattua raakatuotetta (10 g) liuotettuna 100ml:aan kloroformia. Antibioottien absorption jälkeen kolonni eluoidaan. Antibioottien erottamiseksi suoritetaan porrastettu gradienttieluolntl. Tämän saavuttamiseksi kolonnin läpi 30 lasketaan: - 22 - 72534 1) 4 1 hiilitetraklori*jia 2) 8 1 lluotinsysteemiä, joka koostuu hiilitetrakloridieta Ja leopropanolleta (25:1) 3) 8,5 1 liuotinsyeteetniM, joka koostuu eduista ja ieopropano- 5 lista (20:1) 4) 20,5 1 lluotinsysteemiä, joka koostuu CCl^stä ja isopropano-lista (10:1)

Aklaslnomysiini B otetaan kolonnista systeemillä CCl^:isopropa-noli (20:1) ja aklaslnomysiini A systeemillä CCl^:isopropanoll 10 (10:1). Eluaatlt (5-7 1), Jotka sisältävät aklasinomyslinia A

ja B, uutetaan erikseen 0,2 kertalsella tilavuusmäärällä 0,01 N HCl-liuosta.

Antibiootit uutetaan veslfaasista 0,2 kertalsella tilavuusmäärällä kloroformia. Aklaslnomysilnlen A Ja B kloroformluutteet 15 kuivataan erikseen vedettömällä Na2S0^illa (2 g/100 ml liuosta), natriumsulfaatti suodatetaan ja suodos haihdutetaan vakuumlsea 40°C:ssa 0,1 tilavuusmäärään asti. Lisätään 10—'kertainen tila- vuusmäärä kuivaa heksaania ja annetaan seistä n. 30 min. Sakka suodatetaan lasisuodattimella nro 4 ja saatu aine kuivataan 20 ilmassa. Näin saadaan 2,5 g:sta raakatuotetta 0,7 g aklasinomy-siinlä A ja 0,1 g aklasinomysiiniä B.

Esimerkki 2

Streptomyces lavendofoliae 12/3-A kantaa kasvatetaan 12 vuorokautta kaura-agarilla. Kasvusto siirretään astiaan, jossa kas-25 vualustana on B-2 ilman kuparisulfaattia. Astiaa ravistellaan nopeudella 250 rpm lämpötilassa 28eC 2 vuorokauden ajan. Viljelmä siirretään erlenmeyerpulloon. Siirros on tyypillisesti 5-10 Z kasvatusalustan tilavuudesta. Kasvualustana on B-3, joka koostuu seuraavista aineista: soijajauhoa 30 -1,5 Z, perunatärkkelystä - 3 Z, kalsiumkarbonaattia - 1,4 Z, natriumkloridia - 0,3 Z, kuparisulfaattia - 0,007 Z. Kasvatusolosuhteet ovat samat kuin esimerkissä 1 ja kasvatusaika on 72 tuntia. Tällöin kasvatusalustan aktiivisuus on 60 mg/1 aklasl-t nomysiiniä A ja 10 mg/1 aklasinomysiiniä B.

11 - 23 - 72534

Aklasinomyslinlen A ja B kemiallinen erottaminen tapahtuu samalla tavalla kuin esimerklesh 1.

Kuten esimerkeistä käy ilmi omaa keksinnön mukainen aklasinomy- eiinien A ja B valmistusmenetelmä verrattuna tunnettuihin mene-5 telmiin seuraavat edut: 1. Korkeampi saanto aklasinomysiiniä A. Prototyyppikanta tuottaa 46 yg/ml ja keksinnön mukainen kanta jopa 60 yg/ml.

2. Sinerubiinia A ja B ei muodostu ja siten vältytään lisäpuh-dlstuksleta. Tunnetussa menetelmässä yllä mainittuja sivu- 10 tuotteita täytyy poistaa metalli-ioni-komplekseina.

3. Aklasinomysiiniä B muodostuu vähemmän. Prototyyppikanta tuottaa 23 yg/ml ja keksinnön mukainen kanta 4-8 yg/ml.

f