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PATENTANSPRÜCHE
1. Verfahren zur Herstellung der krebsbekämpfende Wirkung aufweisenden Antibiotica Achlacinomycin A und B oder von Mischungen davon, dadurch gekennzeichnet, dass Streptomyces lavendofoliae des Stammes 12/3-A CBS 261.83 unter aeroben Bedingungen in einem Nährmedium, das kohlenstoff- und stickstoffhaltige Verbindungen sowie Mineralsalze enthält, bei Temperaturen von 20-30"C und einem pH-Wert von 6-8,5 48-96 h kultiviert werden, wonach die gebildeten Achlacinomycine A und B gewonnen werden.
2. Verfahren nach Anspruch 1 zur Herstellung von Achlacinomycin A und B, dadurch gekennzeichnet, dass die gewonnenen Achlacinomycine A und B getrennt und gereinigt werden.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, worin bei einem pH-Wert von 6,9-7,9 kultiviert wird.
4. Streptomyces lavendofoliae, Stamm 12/3-A CBS 261.83 als Mittel zur Durchführung des Verfahrens gemäss Anspruch 1.
Die Erfindung betrifft ein neues Verfahren für die Hentel- lung der Antibiotica-Verbindungen Achlacinomycin A und B mit antitumoröser Wirkung.
Die Erfindung betrifft auch einen neuen Stamm von Mikroorganismen der bei diesem Verfahren verwendbar ist.
Achlacinomycin hat die allgemeine Formel:
EMI1.1
In Achlacinomycin A bedeutet R
EMI1.2
In Achlacinomycin B bedeutet R
EMI1.3
Die Achlacinomycine A und B gehören zu der Gruppe der Anthracyclinen Antibiotica. Sie sind im Zusammenhang mit verschiedenen gram-positiven Bakterien wirksam und verhindern das Wachstum von Tumoren in Tieren. Die Achlacinomycine A und B und Verfahren zu ihrer Herstellung wurden erstmalig in der JA-PS 864851, Anmeldungstag 27. Juli 1974, beschrieben. Äquivalente zu der genannten JA-PS sind die GB-PS 1 491 266 und die US-PS 3 988315 und 4071411.
Im genannten Patent wird als der das Achlacinomycin erzeugende Stamm Streptomyces galilaeus MA 144 M1 verwendet, der in der American Type Cultuire Collection unter A.T.C.C. No. 31133 und im Japanese Fermentation Research Institute unter FERM No. 2455 hinterlegt ist.
Der genante Stamm von Mikroorganismen weist folgende Charakteristika auf: schwach entwickeltes Luftmyzel auf festem Nährboden, Farbe: Grau. Bildet spiralige Sporenträger, die Sporen sind oval mit glatter Oberfläche, die Sporengrösse beträgt 0,4 bis 0,8 m. Die Kolonien sind faltenartig und das Trägermyzel ist gelb-braun. Lösbares Pigment fehlt oder ist hellbraun. Auf manchen Nährböden wird ein gelblich grünes Pigment gebildet.
Streptomyces galilaeus wird unter aeroben Bedingungen kultiviert. Das optimale Wachstum tritt zwischen 24 und 30"C auf; bei 50"C findet kein Wachstum statt. Es hydrolisiert Gelatine, peptonisiert Milch und hydrolisiert Stärke geringfügig. Melanoid-Pigmente werden auf organischen Nährböden gebildet. Es gedeiht auf dem Priedheim- und Gottlied-Nährboden, der D-Glukose, D-Xylose, L-Arabinose, L-Rhamnose, D-Galaktose und Inosit enthält, wächst aber nicht auf einem Substrat, das D-Mannit enthält.
Wird der Stamm auf einem Nährmedium, das Sojamehl, Glukose, Stärke und verschiedene Salze enthält, unter aeroben Bedingungen kultiviert, dann bildet er nach 36 Stunden 46 mg/l Achlacinomycin A und 23 mg/l Achlacinomycin B.
Die Antibiotica sind sowohl im Myzel als auch im Nährmedium enthalten. Sie werden aus dem Myzel mit Azeton und aus der Kulturflüssigkeit mit Äthylacetat extrahiert.
Die Extrakte werden kombiniert, und die Achlacinomycine A und B werden unter Verwendung der Säulenchromatographie abgetrennt. Die erhaltenen Achlacinomycine A und B enthalten als Verunreinigungen Antibiotica der E-Pyrromycin-Gruppe, die durch Behandlung mit Kupferionen eliminiert werden.
Ein Nachteil des oben erwähnten bekannten Verfahrens ist
die geringe Produktionsaktivität des Mikroorganismus.
Neben den Achlacinomycinen werden verschiedene Antibiotica der E-Pyrromycin-Gruppe gebildet, so dass die Technik der chemischen Reinigung komplizierter wird.
Die Hauptaufgabe der vorliegenden Erfindung bestand darin, neue, Achlacinomycin A und B erzeugende Kulturen vorzusehen, die eine grössere Aktivität bei der Erzeugung von Achlacinomycin A im Vergleich zu den bekannten Kulturen entwickeln und die diese Antibiotika als Hauptkomponenten erzeugen.
Als Ergebnis dieser Nachforschungen wurde aus einer Probe von Erde aus Mittelasien ein neuer Stamm 12/3-A gefunden, der den Spezies Streptomyces lavendofoliae zuzuordnen ist und der hauptsächlich Achlacinomycin A bildet.
Der Streptomyces lavendofoliae-Stamm wurde am 20. Jänner 1982 in der Sammlung von Kulturen der VNIIA unter No. 1670 hinterlegt. Die Sammlung von Mikroorganismen-Stämmen des Institutes VNIIA ist im Register der International Federation of Collections unter der No. 337 (1972) registriert.
Der Streptomyces lavendofoliae-Stamm 12/3-A wurde auch hinterlegt beim Hinterlegungsinstitut des Centraalbureau voor Schimmelcultures (CBS), Osteerstraat 1, Baarn, Niederlande, und zwar am 31. März 1983 unter No. CBS 261.83.
Streptomyces lavendofoliae, Stamm 12/3-A zeigt folgende morphologische, physiologische und antagonistische Eigenschaften.
Morphologische Eigenschaften:
Streptomyces lavendofoliae bildet ein ausgebreitetes Luftmyzel von lila-rosa Farbe ()K 3). Die Sporenträger sind spiralförmig, die Sporen haben eine glatte Oberfläche und eine Grösse von 0,7 bis 1,4 Film. Das Trägermyzel ist beige-rosa bis schmutzig-lila färbig (K1 + M2). Das im Trägermedium entwickelte Pigment ist dunkelbraun bis braun-rosa-violett + r 2+ H2). Die Farben werden nach der Bondarzev Farbskala der USSR Akademie der Wissenschaften, 1954, bestimmt.
Die Kultur findet bei einer Temperatur von 28 C während 28 Tagen statt.
Tabelle 1 Nährboden Parameter Charakteristika 2 2 3 Czapeck's Nährboden Luftmyzel gut entwickelt, lilarosa ()K 3)
Trägermyzel beige-rosa-lila (K + K2) lösliches Pigment braun-blass-rosa (Kl) Gauze I Nährboden Luftmyzel reichlicher Wuchs, fahl blassrosa (#3+D3)
Trägermyzel braun-schmutzig violett(#2+H2) lösliches Pigment braun-blassrosa (Kl) Krasiljnikov's Luftmyzel reichlicher Wuchs, lila-blassrosa ()K3) Medium I Trägermyzel beige-schmutzig violett(Kl +H2) lösliches Pigment braun-blassrosa-violett (K +F2+H2) Stärke Nährboden Luftmyzel mässiger Wuchs,
blassrosa ()IC3)
Trägermyzel beige-rosa (Kl) lösliches Pigment beige-rosa (Kl) Glukose-Aspargin Luftmyzel extensiver Wuchs, hellgrau (K6)
Trägermyzel sandig bräunlich bis braun (Jl 7-K7) lösliches Pigment sandig braun (JI7+K7) Waxman's Nährboden Luftmyzel extensiver Wuchs, blassrosa-grau (A3)
Trägermyzel braun-haselnussbraun bis schmutzig violett (B2-H2) lösliches Pigment braun-dunkelbraun (B2) Hefe-Nährboden mit Luftmyzel extensiver Wuchs, rosa-grau (A3) löslicher Stärke Trägermyzel braun (B7) lösliches Pigment sandbraun bis braun (B7-K7) Glukose Hefe-Nährboden Luftmyzel extensiver Wuchs, weisslich (Dl)
Trägermyzel dunkelbraun (JI 5) lösliches Pigment braun (K7) Hafer-Nährboden Luftmyzel guter Wuchs,
rosa-grau (A3)
Trägermyzel dunkelbraun-braun (B2) lösliches Pigment hellbraun (B7) Malz-Nährboden Luftmyzel extensiver Wuchs, rosa-grau (A3)
Trägermyzel braun-haselnussbraun (B2+ K7) lösliches Pigment dunkelbraun-braun (B2+K7) Gauze 2 Nährboden Luftmyzel mässiger Wuchs, hellgrau (A6)
Trägermyzel braun (K7) lösliches Pigment braun (K7) MPA Luftmyzel schwacher Wuchs
Trägermyzel beige-sandfarben (B6) lösliches Pigment fehlt
Tabelle 1 (Fortsetzung) Nährboden Parameter Charakterislika 2 .
3 Agar mit Tyrosin Luftmyzel reichlicher Wuchs, lila-rosa ()K3)
Trägermyzel pflaumenblau-schwarz.(O 1) lösliches Pigment umbra (07) Tresner's Nährboden mit Luftmyzel guter Wuchs, lila-rosa ()K3) Eisenzitrat Kartoffelschnitzel Trägermyzel dunkelumbra (fl 2) lösliches Pigment dunkelumbra (#2)
Luftmyzel guter Wuchs, weiss bis rosa (03-X(3)
Trägermyzel dunkelbraun (Kl +Bl) lösliches Pigment dunkelbraun (K 1 +Bl)
Physiologische Eigenschaften:
Aerob, optimales Wachstum bei 24 bis 30 C. Kein
Wachstum bei 50 C. Es wirkt mässig verflüssigend auf Gela tine, peptonisiert Milch unter Bräunung und wirkt mässig hydrolisierend auf Stärke. Es formt Melanoide (Tresner's
Medium mit Eisenzitrat und Agar mit Tyrosin).
Streptomyces lavendofoliae, Stamm 12/3-A assimiliert gut die folgenden Kohlenstoffquellen: D-Glukose, D-Xylose,
L-Arabinose, D-Fruktose, D-Galaktose, Inositol. Es assimi liert schlecht oder überhaupt nicht: L-Rhamnose, Saccha rose, Rafinose und D-Mannitol. Streptomyces lavendofoliae,
Stamm 12/3-A kann auf einem passenden Nährmedium unter einer Schicht von Vaselinöl 6 Monate bei einer Tempe ratur von +5 C gelagert werden.
Antagonistische Eigenschaften:
Streptomyces lavendofoliae 12/3-A wird in einem flüssigen Nährmedium auf einem Schüttelbehälter kultiviert.
Nach 3 Tagen hat sich eine Menge von etwa 56 bis 60 mg/ml Achlacinomycin A gebildet, das die nachstehende antimi krobe Wirkung, zytotoxische Aktivität und antitumoröse Wirkung auf Versuchstiere aufweist (Tabellen 2 bis 4).
Tabelle 2 Antimikrobes Spektrum von Achlacinomycin A, das aus einer Kultur von Streptomyces lavendofoliae Stamm 12/3-A erhalten wurde, und von einem Vergleichspräparat.
Testorganismus MîC,ug/mlt
Achlacinomycin A Achlacinomycin A isoliert aus erhältlich von
Str. lavendofoliae Zaideanhojin
Biseibutsu Kagaku
Kenkyukai, Tokio,
Japan 1. 2. 3.
Staphylococus aureus 15,56 7,8 209P Staph. aureus 209P
Streptomycin-resistent 15,56 15,56
Penicillin-resistent 15,56 15,56
Gentamycin-resistent 15,56 15,56
Kanamycin-resistent 11,6 11,6
Oelandomycin-resist. 15,56 11,6
Linkomycin-resistent 15,56 23,3
Violarin-resistent 23,3 19,0
Erythromycin-resist. 31,2 23,2
Dactinomycin-resist. 31,2 70,0
Novobiocin-resist. > 250,0 > 250,0
Rimfampicin-resist. 125,0 125,0
Tabelle (Fortsetzung)
Vankomycin-resist. 125,0 125,0 E.
coli 675 > 250,0 > 250,0 Pseudomanas aeruginosa > 250,0 250,0 Klebsiella pneumoniae > 250,0 > 250,0 Providencia stuartii
ATCC 7240 > 250,0 > 250,0 Candida albicans > 250,0 > 250,0 * MIC, die minimale, wachstumsllemmende pharmazeutische Konzentration wird dadurch bestimmt, dass in zwei parallellautenden Testprogrammen eine Mikroben-Standardladung von 105/ml in einer Reihe von Teströhr chen. die Peptonbrühe als Nährmedium und einen zunehmenden Anteil des pharmazeutiscllen Mittels enthalten. 20 Stunden lang bei einer Temperatur von 37"C und einem pH-Wert 7 kultiviert wird.
Tabelle 3 Antitumoröse Wirkung von Achlacinomycin A auf Versuchstiere.
EMI3.1
<tb>
Tierrasse <SEP> Anwendungs- <SEP> Optimale <SEP> Lebenszeit- <SEP> Tumor
<tb> <SEP> zeit <SEP> (Tage) <SEP> Dosierung <SEP> verl. <SEP> (%) <SEP> Wachstumsver
<tb> <SEP> (mg/kg) <SEP> zög. <SEP> (0MO) <SEP>
<tb> La
<tb> CBFI <SEP> 1#9 <SEP> <SEP> 2,5 <SEP> 92
<tb> LLC
<tb> CBF <SEP> 1--+9 <SEP> 5 <SEP> 67
<tb> S-37
<tb> Bastard- <SEP> 1#5 <SEP> <SEP> 2,5 <SEP> 80
<tb> Mäuse
<tb>
Tabelle 4 Zytostatische Wirkung von Achlacinomycin A und seiner Komplexe mit DNA auf eine suspendierte Kultur von Tumorzellen P-388 Präparat EDso, psxml* Achlacinomycin A 0,01 Achlacinomycin A -DNA Komplex 0,01 * Die Dosis, die zu einer Verringerung des Wachstums der Nukleinsäuren (DNA + RNA) um 50% führt.
Ein Vergleich der morphologischen und physiologischen Eigenschaften des Stammes 12/3-A nach der Erfindung mit jenem des bekannten Produzenten von Achlacinomycin A und B, Streptomyces galilaeus bestätigt die Unterschiede zwischen den betreffenden Kulturen.
Anderseits entspricht der Mikrobenstamm nach der vorliegenden Erfindung, wie sich aus den obigen Grundzügen ergibt, den Eigenschaften von Streptomyces lavendofoliae entsprechend der Definition von Bergey (Tabelle 5).
Tabelle 5 Vergleich der morphologischen und physiologischen Eigenschaften einer Kultur des Stammes 12/3-A nach der Erfindung, mit den Eigenschaften des Prototyps Streptomyces galilaeus MA 144und Streptomyces lavendofoliae.
Parameter Stamm 12/3-A Str. galilaeus Str. lavendofoliae
MA 144M1 (Prototyp) 2. 2. 3. 4.
Sporenträger spiralförmig spiralförmig spiralförmig Sporen glatt, oval glatt, oval glatt, oval Synthetisches Mediums: Luftmyzel Wachstum mässiges gutes von gut bis Wachstum, Wachstum reichlich, hellgrau bis lila-rosa bläulich-rosa grau ()K3) Trägermyzel beige-rosa bis gelb-braun, gelb-braun schmutzig lila auf manchen bis (Jl 7-M2) Medien dunkelbraun gelblich grün lösliches dunkelbraun keine oder gelblich Pigment bis braun braun oder dunkelbraun- dunkelbraun rosa-violett (Kl+r2+H2) Organische Medien:
: Luftmyzel guter Wuchs mässiger guter Wuchs rosa-grau(A3) Wuchs lila-blassrosa hellgrau bis schmutzig violett Trägermyzel sandbraun bis gelbbraun dunkelbraun braun bis tief (X(7+B7- dunkelbraun
K7) lösliches dunkelbraun braun dunkelbraun Pigment (x7-B2+K7) oder tief dunkelbraun UCartoffelschnitzel: Luftmyzel guter Wuchs guter Wuchs guter Wuchs weiss bis rosa hellgrau dunkelbraun (D3-)K3) bis rosa Trägermyzel dunkelbraun braun-gelb dunkelbraun (Kl+Bl) lösliches dunkelbraun haselnuss- dunkelbraun Pigment (Kl+Bl) braun Melanoide: gebildet gebildet gebildet Wachstum auf Zellulose gut gemässigt gut Milch:
unter gemässigt unter
Bräunung peptonisiert Bräunung peptonisiert peptonisiert Hydrolyse von Strärke gemässigt schwach gemässigt
Tabelle (Fortsetzung) Verflüssigung von Gelatine gemässigt schwach gemässigt Saccharose - + D-Glukose + + + D-Xylose + + + L-Arabinose + + + L-Rhamnose - + - D-Fruktose + + D-Galaktose + + + Raffinose - + D-Mannitol Inositol - + +
Bei der taxonometrischen Bestimmung der Kultur 12/3-A wurden folgende Literaturstellen verwendet: Krasiljnikov, N.V. Radiant fungi , Nauka Publishers, 1970, Seiten 172, 238; Bergey's Manual of Determinative Bacteriology, Editors: Buchanan R.E., Gibbons, N.E. et al., Seiten 808 bis 810.
Als Nährmedium kann jedes Substrat verwendet werden, das vom Achlacinomycin produzierenden Stamm der Spezies Streptomyces lavendofoliae assimiliert werden kann.
Als Kohlenstoffquelle (Kohlenhydratquelle) im Nährmedium werden vorzugsweise Fruktose, Glukose, Arabinose, Xylose, Galaktose, Stärke usw. verwendet.
Als Stickstoffquelle können Fleischextrakl, Peplon, Maisextrakt, Hefeextrakt, Kasein, Hydrolysat, Maismehl, Sojamehl, Baumwollsamenmehl usw. ebenso wie stickstoffhaltige organische und anorganische Verbindungen, wie Ammoniumsalze (Nitrate, Sulfate, Phosphate u.a.), Harnstoff usw.
verwendet werden.
Dem Medium können noch Mineralsalze wie Calziumkarbonat, Natrium und Kaliumphosphat, Natrium und Kaliumchlorid, Magnesiumsalze, Kupfer und andere Mineralsalze zugefügt werden.
Grössere Mengen von Achlacinomycin A und B werden unter Verwendung einer belüfteten Tiefkultur in zwei Stufen erzeugt. Die Inokulation des Fermenters erfolgt mit vegetativem Myzel. Das Substrat, das für die Kultur des vegetativen Myzels Verwendung findet, kann das gleiche sein, das auch bei der Biosynthese von Achlacinomycin A und B Verwendung findet, kann aber auch verschieden sein.
Ein Test verschiedener möglicher Medien zeigte. dass die Nährmedien B-2 und B-3 am günstigsten erscheinen: Bestandteil Nährmedium B-2 (%) B-3 (%)
1. Ammoniumsulfat 0,1 1,5 2. Sojamehl 1,1 1,5 3. Kartoffelstärke 2,6 3,0 4. Calziumkarbonat 0,8 1,4 5. Natriumchlorid 0,3 0,3 6. Kupfersulfat 0,007 0,007 7. Anti-Schäummittel AC-60 0,5 0,5
Das Medium wird bei einer Temperatur von 124 bis 126dz 30 bis 40 Minuten lang sterilisert, wonach der pH-Wert des Mediums neutral ist.
Streptomyces lavendofoliae, Stamm 12/3-A erzeugt bei der Kultur und bei einer Belüftung im Ausmass von 11/1 Medium/min. (ein Liter Luft pro Liter Medium und Minute), bei einer Temperatur von 20 bis 30"C und einem pH-Wert von etwa 6-8,5, vorzugsweise 6,9-7,9, nach 48 bis 96 Stunden Achlacinomycin A in einer Menge bis zu 60 mg/l und Achlacinomycin Bin einer Menge von 4-10 mg/l.
Tabelle 6 Vergleich der physico-chemischen Eigenschaften von Achlacinomycin A vom Str. galilaeus (Antibioticum von der Firma Zaidanhojin Biseibutsu Kagaku, Kenkyukai, Tokio, Japan) und vom Str. lavendofoliae.
Antibiotica erzeugender Stamm
Str. galilaeus MA 144 Ml Str. lavendofoliae
2. 3.
UV-Spektrum*
1% Xnm/E max 1 cm 90%MeOH 431,5/146,1/290/ 431,5/148,6/,289/ 112,1/ 137,4/257/302,9/
257/285,3/,228/ ,228/502/;
485,7/; 0,1N HCl 431,5/146,1/,257/ 431,5/151,4/,289/
285,3/ 137,4/ ,290/112,1/,228/ ,257/302,9/,228/
485,7/; 499,2/; 0,1N NaOH 521,3/118,9/,317,3/ 521,3/130/,318,3/
64,5/285/101,9/,236/ 78,5/,284/126,2/
424,6 ,236/440,3/.
IR-Spektrum** Wmax cm- 3450,2980,2945,2820, 3480,2980,2950,2825,
2760,1735,1675,1620, 2775,1735,1680,1625,
1600,1010. 1600,1010.
PMR-Spektrum*** #ppm 12,55, lH,s.; 12,7, 1H,s.;
12,0, lH,s.; 12,0, 1H,s.;
7,15-7,85,4H,m.; 7,83 1H,J1 = 1,8 Hz
5,58 1H,s.; J2 = 7,8 Hz; 7,68, lH,t.
J = 7,8 Hz;
7,68, 1H,s.; 7,30,
5,31 1H,s.; 1H,J1 = 1,8 Hz,J2=
4,95-5,20, 2H, m.; 7,8 Hz
4,35-4,65,2H,m.; 5,52 1H,m.;5,28,1H,
4,11,1H,s.; m.;4,95-5,20,2H,m;
4,40-4,70, 2H, m.;
4,11 1H,s.;
3,68, 3H, s.; 3,70, 3H, s;
2,3-2,7 5H, m.;
2,25-2,65, 5H, m.; 2,23, 6H, s.; 1,40-2,15,
2,20,6H,s.; 8H,m.;1,32,3H,d.;
J = 6,6 Hz.; 1,45-2,15, 8H, m.; 1,29, 3H, d.,
J = 6,4 Hz;
1,00-1,36 12H,m.; 1,17,3H,d.,
J = 6,2 Hz;
1,08,3H,t.,J = 7 Hz.
Massespektrum**** m/z 376/100%/; 114,/2,6%/,
377/50%/, 376/100%/, 795/15%/, 377/42,8%/,
812,30%/, 394,/5,1%/,
416/1,5%/,
794/10,2%/,
812/28,8%/.
* Die UV-Spektren wurden aufeinem Pye Unicam SP-8-100-Instrument aufgenommen, das mit den Standardfiltern HO-720540 und Di-720538
Pye Unicam kalibriert war.
** Die lR-Spektren wurden auf einem UR-20-Instrument in einer Tablette mit KBr aufgenommen.
*** Die PMR-Spektren wurden auf einem Bruker-WH-90-Instrument,
90 MHz mit CDCl3, TMS als Bezug aufgenommen.
**** Die Massespektren der Felddesorption wurden auf einem Varian Mat 31 l-A-lnstrument aufgenommen. Die Kalibrierung erfolgte mit PFK.
Der Emitterstrom betrug 5 bis 20 mA.
Tabelle 7 Vergleich der physikalisch-chemischen Eigenschaften von Achlacinomycin B aus Str. galilaeus und Str. lavendofoliae.
Antibiotica erzeugender Stamm
Str. galilaeus MA 144 Ml Str. lavendofoliae 1. 2. 3.
UV-Spektrum 1% Xnm/E/ max Icm 90% MeOh 432/159/,298,5/137/ 431,5/149,2/,290/ ,259/313/,229,5/498; 119/,257/296/,228/
508/; 0,1N HCl 431/162/,289,5/156/ 431,5/149/,290/119/ ,259/355/,229/586/; ,257/296/,228/503; 0,1N NaOH 522/145/,315/101/ 521,3/127/,316,3/ ,284/160/,239/510. 77,3/,285/119/,236/
453/.
IR-Spektrum vcm-1 3540,2980,2945,2820, 3490,2980,2950,2830, max 2760,1730,1675,1620, 2780,1735,1680,1625,
1600,1010. 1605,1015.
PMR-Spektrum #ppm 12,2, lH,s.; 12,68, lH,s.;
11,5,1H,s.; 12,02,1H,s.;
7,2-7,9, 4H, m.; 7,24-7,89, 4H, m.;
5,5, 1H,s.; 5,48, lH,s.;
5,1-5,3, 3H, m.; 5,09-5,27, 3H, m.:
4,6-4,9, 2H, m.; 4,62-4,90, 2H, m;
4,5, 1 H, s.; 4,53, 1 H, s.;
4,3-4,4, 1 H, m.; 4,36, 1 H, q.;
4,15, lH,s.; 4,11, lH,s.;
3,8-4,0, 2H, m.; 3,90-4,03, 2H, m.;
3,7,3H,s.; 3,75,1H,s.;
2,2-2,7,4H,m.; 3,69,3H,s.;
2,2, 6H, s.;
2,58, 2H, d.; 1,4-2,0, 8H, m.; 2,46, 1 H, d.; 0,9-1,4, 12H, m.; 2,35, lH,s.;
2,15,6H,s.;
1,45-2,01, 8H, m.;
0,89-1,45, 12H, m.;
Die UV-IR- und PMR-Spektren von Achlacinomycin A und B sind in den Fig. 1 bis 6 dargestellt.
Fig. 1 zeigt das UV-Spektrum von Achlacinomycin A Hydrochlorid in 90% Methanol, Fig. 2 zeigt das UV-Spektrum von Achlacinomycin B Hydrochlorid in 90% Methanol, Fig. 3 zeigt das IR-Spektrum von Achlacinomycin A Hydrochlorid aus einer KBr Tablette, Fig. 4 zeigt das IR Spektrum von Achlacinomycin B Hydrochlorid aus einer KBr Tablette, Fig. 5 zeigt das PMR-Spektrum von Achlacino mycin A Hydrochlorid (CDCl3 - TMS ; T = 303"C) und Fig. 6 zeigt das PMR-Spektrum von Achlacinomycin B Hydrochlorid(CDCl3-TMS;T = 303 C).
Die Achlacinomycine A und B sind im Myzel und im (Nähr-)Medium enthalten. Nach der Fermentation wird das Medium bei einem pH-Wert von 4,5 - 6,0 gefiltert. Die Antibiotica werden aus dem Medium mit Äthylacetat extrahiert (für 10 Volumsteile des Mediums wird ein Volumsteil Äthylacetat verwendet).
Die antibioticahältige organische Schicht wird vom Myzel getrennt. Nach Entfernung der Lösungsmittel werden die wässrigen Rückstände kombiniert und auf einen pH-Wert 6,9 neutralisiert. Danach werden die Antibiotica mit Toluol und dem doppelten Volumen einer 0,01 N-HCL-Lösung extrahiert. Die Antibiotica werden mit Chloroform aus der wässrigen Lösung extrahiert, das auf Na2SO4-Anhydrid getrocknet wird.
Das Chloroform-Extrakt wird in einem Drehverdampfer auf das 0, I-fache Volumen konzentriert und der Rückstand wird 10 bis 12 Volumsteilen trockenem Hexan zugesetzt. Die ausgefällten Antibiotica werden abgetrennt und getrocknet.
Die Reinigung und Abtrennung der Antibiotica erfolgt chromatographisch auf wässriger Kieselsäure in einem Lösungsmittelsystem, das aus Kohlenstoff-Tetrachlorid und Isopropanol besteht.
Die Tabellen 6 und 7 zeigen die Ergebnisse eines Vergleiches von Achlacinomycin A und B, welche Ergebnisse mit UV-IR-PMR- und Massenspektrographie erhalten wurden und welche die Ähnlichkeiten zwischen den Antibiotica, die mit dem erfindungsgemässen Stamm und den früher bekannten Stämmen erhalten werden, bestätigen.
Die Antibiotica Achlacinomycin A und B, die mit dem Stamm 1 2/3-A von Str. lavendofoliae erzeugt werden, sind somit ident mit den Antibiotica, die durch die Kultur von Str.
galilaeus MA144 M1 erhalten werden. Es war bisher nicht bekant, dass Str. lavendofoliae in der Lage ist, Achlacinomycin A und B zu erzeugen. Das erfindungsgemässe Verfahren wird im Zusammenhang mit den folgenden Ausführungsbeispielen erläutert.
Beispiel I
Streptomyces lavendofoliae des Stammes 12/3-A werden auf einem festen Hafer-Nährboden bei einer Temperatur von 28"C 12 Tage lang bis zur Entwicklung von reichlichem Luftmyzel kultiviert. Die Kultur wird in einen 750 ml Erlenmeyer-Kolben in ein B-2 Medium übertragen, das weder Kupfersulfat noch ein Antischäummittel enthält. Der Kolben wird auf einer Schüttelvorrichtung mit 250 U/min umgerührt. Die Temperatur beträgt 28"C, die Behandlungszeit 2 Tage. Die Kultur aus dem Erlenmeyer-Kolben wird in einem Anteil von 5% in einen 10 1 - Inokulationsfermenter in ein B-2 Medium übertragen, das kein Kupfersulfat enthält.
Der Fermenter wird mit einer Geschwindigkeit von 200 U/min umgerührt und einen Tag lang bei einer Temperatur von 28"C mit 10 I/min Luft belüftet.
3 Liter der Kulturflüssigkeit aus diesem Fermenter werden in 60 Liter B-2 Nährmedium in einen 100 Liter Fermenter übertragen. Der Fermenter wird mit 200 U/min umgerührt und mit 60 I/min Luft bei einer Temperatur von 27"C 3 Tage lang belüftet.
Der Gehalt an Achlacinomycin A und B im Medium wird nach dem folgenden Verfahren bestimmt.
1) Bestimmt des Gehaltes an Achlacinomycin A und B im Myzel:
Nach Beendigung der Fermentation wird das Myzel von 5 ml durch Zentrifugieren mit 2000 U/min während 10 Min.
abgetrennt. Aus dem so erhaltenen Myzel werden die Antibiotica während zweier Stunden mit Hilfe von 4 ml Azeton extrahiert, wobei die Mischung in Intervallen von 15 bis 20 Minuten umgerührt wird. Das Azeton wird von 1 ml Extrakt in Vakuum bei einer Temperatur unter 40 C verdampft und der Rückstand wird mit 1,0 ml Chloroform extrahiert. Das konzentrierte Chloroform-Extrakt wird für die chromatographische Abtrennung des Antibiotica enthaltenden Komplexes verwendet. Zu diesem Zweck wird eine Platte verwendet, die unter Freilassung 2 cm breiter Randstreifen am linken und unteren Rand mit einer adsorbierenden Schicht bedeckt ist. Auf die Platte wird der gesamte Chloroform Extrakt mit Hilfe eines Kapillargefässes in Form einer Linie von 1 bis 1,5 cm Breite aufgetragen. Auf die gleiche Platte wird eine Standardlösung von Achlacinomycin A und B aufgetragen.
Die Platte wird in eine chromatographische Kammer eingebracht, welche ein Chloroform-Äthylacetat Methanol-Gemisch im Verhältnis 7:2:1 enthält. Wenn die Lösungsmittelfront den Plattenrand erreicht, wird die Platte herausgenommen und in Luft 20 Min. lang getrocknet. Die sich entsprechend der Mobilität von Achlacinomycin A und B ergebenden gelben Zonen werden getrennt mit 4 ml Methanol (pH-Wert = 6) ausgewaschen und spektralfotometrisch bei einer Wellenlänge von 430 nm gemessen. Die Gehalte an Achlacinomycin (mg/l Kulturmedium) werden auf der Basis der spezifischen Extinktion der Achlacinomy eine (E"i cm für die Achlacinomycin A und B betragen 161 bzw. 159, J.
Antibiotics 1979, 32, no. 8, s. 781-800) nach der folgenden Formel bestimmt: Achlacinomycin A C mg/ml = 199 D Achlacinomycin B C mg/ml = 201 D
2) Bestimmung des Gehaltes von Achlacinomycin A und B im Medium:
Von 5 ml Medium wird das Myzel durch Zentrifugierung abgetrennt. Die Extraktion wird mit Hilfe von Äthylacetat bei einem pH-Wert 6 und bei einem Mengenverhältnis von 5 ml Medium auf 5 ml Äthylacetat durchgeführt. 2 ml des Äthylacetatextraktes werden im Vakuum verdampft und der Rückstand wird mit 2 ml Chloroform extrahiert. Das weitere Verfahren erfolgt wie unter Punkt 1).
Die Mengen an Achlacinomycin A und B werden auf der Basis der spezifischen Extinktion nach der folgenden Formel bestimmt: Achlacinomycin A C mg/ml = 124,2 D Achlacinomycin B C mg/ml = 125,8 D
Nach 3 Tagen der Fermentation im Medium B-2 erzeugt die Kultur 1 2/3-A etwa 56 mg/l Achlacinomycin A und etwa 4 bis 8 mg/l Achlacinomycin B.
Um das Achlacinomycin A und B vom Medium zu trennen, werden 60 Liter in einem Saugfilter bei einem pH-Wert4.5 - 5,0 gefiltert. Die Antibiotica im Medium werden mit Äthylacetat im Verhältnis 10:1 extrahiert. Die organische Schicht wird abgetrennt und im Vakuum in einem Drehverdampfer bei einer Temperatur nicht über 40"C verdampft, bis der Rückstand eine wässrige Lösung ist.
Das nasse Myzel (5 kg) wird zweimal mit 10 Liter Azeton extrahiert. Das Myzel wird durch Filtration abgetrennt und abgelegt. Die Azetonextrakte werden kombiniert und verdampft. Die wässrigen Rückstände, die sich nach Verdampfung des Äthylacetates und Azetons ergeben, werden kombiniert und das auf diese Weise erhaltene Konzentrat (51) wird mit einer 1 0%gen NaOH-Lösung auf einen pH-Wert von 6,8 neutralisiert, wobei die Antibiotica mit 3 x 10 1 Toluol extra hiert werden. Die Toluol-Extrakte werden kombiniert und die wässrige Schicht wird abgelegt. Das Toluol-Extrakt (30 1) wird im Vakuum bei einer Temperatur, die 40"C nicht überschreitet, verdampft, bis der Rückstand 3 1 beträgt.
Aus diesem Konzentrat werden die Antibiotica mit dem 0,5-fachen Volumen von 0,01N HCI extrahiert. Die aus dieser Extraktionsstufe resultierende Emulsion wird durch Zentrifugieren gebrochen. Die Antibiotica in der wässrigen
Lösung werden mit dem 0,5-fachen Volumen Chloroform extrahiert. Die Extraktionszeit beträgt unter fortlaufendem
Rühren 20 bis 30 Minuten.
Die erhaltene Emulsion wird durch Zentrifugieren gebrochen. Dic Chloroformschicht ( 1,5 1) wird gewonnen und vier Stunden lang über Na2SO4-Anhydrid (10 g Na2SO4/100 ml des Extraktes) getrocknet. Das Na2SO4 wird abgefiltert und das Chloroform wird unter Vakuum in einem
Drehverdampfer auf das 0, I-fache Volumen destilliert. Der Rückstand wird dem 10-bis 12-fachen Volumen an trokkenem Hexan zugesetzt, wobei ein Niederschlag gebildet wird, der setzen gelassen wird (30 min.). Die niedergeschlagenen Antibiotica werden auf einem Glasfilter Nr. 4 gefiltert und getrocknet.
Das Filtrat wird bis zur Trockenheit in einem drehenden Verdampfcr bei einer Temperatur, die 40"C nicht überschreitet, verdampft. Der Rückstand wird in Hexan suspendiert, und das Hexan wird durch Filtration abgetrennt. Beide Rückstände werden abgetrennt und chromatographisch gereinigt. Die Ausbeute beträgt 2,5 g an Rohprodukt.
Chromatographische Abtrennung der Achlacinomycine
Eine Säule (8x95 cm) wird mit 5,5 1 einer Suspension gefüllt, die aus 1,8 kg wässriger Kieselsäure (250-400 ,um) und 5,51 Chloroform besteht, in dem 0,5% Triäthylamin und Essigsäure gelöst wurden. Nach dem Füllen wird die Säule mit 3 1 Chloroform gespült. Das oben erwähnte Rohprodukt (10 g) wird in 100 ml Chloroform aufgelöst zugesetzt. Nach der Absorption der Antibiotica wird die Säule ausgespült. Für die Abtrennung der Antibiotica wird eine schrittweise Auswaschung vorgenommen.
Zu diesem Zweck werden folgende Stoffe durch die Säule geleitet:
1) 41 Kohlenstofftetrachlorid
2) 8 1 eines Lösungsmittelsystems, das aus Kohlenstofftetrachlorid und Isopropanol (25:1) besteht
3) 8,5 1 eines Lösungsmittelsystems, das aus Kohlenstofftetrachlorid und Isopropanol (20:1) besteht
4) 20,5 1 eines Lösungsmittelsystems, das aus Kohlenstofftetrachlorid und Isopropanol (10:1) besteht.
Achlacinomycin B wird aus der Säule mit dem System CCI4: Isopropanol (20:1) und Achlacinomycin A mit dem System CCI4: Isopropanol (10:1) entfernt. Die Auswaschungen (5 bis 7 1), die die Achlacinomycine A und B enthalten, werden getrennt mit dem 0,2-fachen Volumen einer 0,01 N NaOH-Lösung extrahiert.
Die Antibiotica werden aus der wässrigen Phase mit dem 0,2-fachen Volumen extrahiert. Die Chloroform-Extrakte der Achlacinomycine A und B werden getrennt mit Na2SO4- Anhydrid (2g/100 ml Lösung) getrocknet, das Natriumsulfat wird abgefiltert und das Filtrat im Vakuum bei 40"C auf das 0, 1-fache Volumen verdampft. Ein 10-faches Volumen an trockenem Hexan wird beigefügt und die Mischung wird etwa 30 Min. lang stehen gelassen. Der Rückstand wird auf einem Glasfilter Nr. 4 filtriert und das erhaltene Produkt wird luftgetrocknet. Auf diese Weise werden aus 2,5 g des Rohproduktes 0,7 g Achlacinomycin A und 0,1 g Achlacinomycin B verhalten.
Beispiel 2
Streptomyces lavendofoliae Stamm 12/3-A wird 12 Tage lang auf einem Hafer-Nährboden kultiviert. Die Kultur wird in einen Kolben übertragen. der als Nährmedium B-2 ohne Kupfersulfat enthält. Der Kolben wird 2 Tage lang bei einer Temperatur von 28"C mit 250 U/min. geschüttelt. Die Kultur wird in einen Erlenmeyer-Kolben übertragen. Die übertragene Menge entspricht typisch 5-10% des Volumens des Mediums. Als Medium wird B-3 verwendet, das aus folgenden Bestandteilen besteht:Sojamehl - 1,5%, Kartoffelstärke - 3%, Calziumkarbonat - 1,4%, Natriumchlorid 0,3%, Kupfersulfat - 0,007%. Die Kulturbedingungen sind die gleichen, wie beim Beispiel 1 und die Kulturzeit beträgt 72 Stunden. Die Aktivität des Kulturmediums liegt dann bei 60 mg/l Achlacinomycin A und 10 mg/l Achlacinomycin B.
Die chemische Abtrennung der Achlacinomycine A und B wird in der gleichen Verfahrensweise wie beim Beispiel 1 vorgenommen.
Wie sich aus den Ausführungsbeispielen ergibt, erbringt das erfindungsgemässe Verfahren für die Herstellung von Achlacinomycin A und B im Vergleich zu dem bekannten Verfahren folgende Vorteile:
1. Höhere Ausbeute an Achlacinomycin A. Der Prototyp Stamm erzeugt 46,ug/ml und der erfindungsgemässe Stamm sogar 60 g/ml.
2. Keine Bildung von Cinerubin A und B, so dass eine zusätzliche Reinigung vermieden wird. In den bekannten Verfahren müssen diese Nebenprodukte als Metall-Ionen Komplexe abgetrennt werden.
3. Es wird weniger Achlacinomycin B gebildet. Der Prolotypstamm erzeugt 23,ug/ml und der erfindungsgemässe Stamm 4 bis 8,ug/ml.
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PATENT CLAIMS
1. A process for the preparation of the cancer-fighting antibiotics achlacinomycin A and B or mixtures thereof, characterized in that Streptomyces lavendofoliae of the strain 12/3-A CBS 261.83 under aerobic conditions in a nutrient medium which contains carbon- and nitrogen-containing compounds and mineral salts , at temperatures of 20-30 "C and a pH of 6-8.5 48-96 h, after which the achlacinomycins A and B formed are obtained.
2. The method according to claim 1 for the production of achlacinomycin A and B, characterized in that the obtained achlacinomycins A and B are separated and purified.
3. The method according to claim 1 or 2, wherein cultivation is carried out at a pH of 6.9-7.9.
4. Streptomyces lavendofoliae, strain 12/3-A CBS 261.83 as a means for performing the method according to claim 1.
The invention relates to a new process for the treatment of the antibiotic compounds achlacinomycin A and B with an antitumor effect.
The invention also relates to a new strain of microorganisms which can be used in this process.
Achlacinomycin has the general formula:
EMI1.1
In achlacinomycin A, R means
EMI1.2
In achlacinomycin B, R means
EMI1.3
The achlacinomycins A and B belong to the group of anthracyclines antibiotics. They are effective in connection with various gram-positive bacteria and prevent the growth of tumors in animals. The Achlacinomycins A and B and processes for their preparation were first described in JA-PS 864851, application date July 27, 1974. Equivalents to the aforementioned JA-PS are GB-PS 1 491 266 and US-PS 3 988315 and 4071411.
The cited patent uses Streptomyces galilaeus MA 144 M1 as the achlacinomycin-producing strain, which is available in the American Type Cultuire Collection under A.T.C.C. No. 31133 and the Japanese Fermentation Research Institute under FERM No. 2455 is deposited.
The named strain of microorganisms has the following characteristics: poorly developed aerial mycelium on a solid culture medium, color: gray. Forms spiral spore carriers, the spores are oval with a smooth surface, the spore size is 0.4 to 0.8 m. The colonies are wrinkled and the carrier mycelium is yellow-brown. Solvable pigment is missing or is light brown. A yellowish green pigment is formed on some culture media.
Streptomyces galilaeus is cultivated under aerobic conditions. The optimal growth occurs between 24 and 30 "C; at 50" C there is no growth. It hydrolyzes gelatin, peptonises milk and slightly hydrolyzes starch. Melanoid pigments are formed on organic nutrient media. It thrives on the Priedheim and Gottlied broth, which contains D-glucose, D-xylose, L-arabinose, L-rhamnose, D-galactose and inositol, but does not grow on a substrate that contains D-mannitol.
If the strain is cultivated on a nutrient medium containing soy flour, glucose, starch and various salts under aerobic conditions, it forms 46 mg / l achlacinomycin A and 23 mg / l achlacinomycin B after 36 hours.
The antibiotics are contained in both the mycelium and the nutrient medium. They are extracted from the mycelium with acetone and from the culture liquid with ethyl acetate.
The extracts are combined and Achlacinomycins A and B are separated using column chromatography. The Achlacinomycins A and B obtained contain antibiotics of the E-pyrromycin group as impurities, which are eliminated by treatment with copper ions.
A disadvantage of the known method mentioned above is
the low production activity of the microorganism.
In addition to the achlacinomycins, various antibiotics of the E-pyrromycin group are formed, so that the chemical cleaning technique becomes more complicated.
The main object of the present invention was to provide new cultures producing achlacinomycin A and B which develop greater activity in the production of achlacinomycin A compared to the known cultures and which produce these antibiotics as main components.
As a result of this research, a new strain 12/3-A was found from a sample of soil from Central Asia, which can be assigned to the species Streptomyces lavendofoliae and which mainly forms achlacinomycin A.
The Streptomyces lavendofoliae strain was on January 20, 1982 in the collection of cultures of the VNIIA under No. Deposited in 1670. The collection of microorganism strains of the institute VNIIA is in the register of the International Federation of Collections under the no. 337 (1972) registered.
The Streptomyces lavendofoliae strain 12/3-A was also deposited with the depository of the Centraalbureau voor Schimmelcultures (CBS), Osteerstraat 1, Baarn, Netherlands, on March 31, 1983 under No. CBS 261.83.
Streptomyces lavendofoliae, strain 12/3-A shows the following morphological, physiological and antagonistic properties.
Morphological properties:
Streptomyces lavendofoliae forms an expanded aerial mycelium of purple-pink color () K 3). The spore carriers are spiral, the spores have a smooth surface and a size of 0.7 to 1.4 film. The carrier mycelium is beige-pink to dirty-purple in color (K1 + M2). The pigment developed in the carrier medium is dark brown to brown-pink-violet + r 2+ H2). The colors are determined according to the Bondarzev color scale of the USSR Academy of Sciences, 1954.
The culture takes place at a temperature of 28 C for 28 days.
Table 1 Culture medium parameter characteristics 2 2 3 Czapeck's culture medium aerial mycelium well developed, lilac pink () K 3)
Carrier mycelium beige-pink-purple (K + K2) soluble pigment brown-pale pink (Kl) Gauze I nutrient medium aerial mycelium abundant growth, pale pale pink (# 3 + D3)
Carrier mycelium brown-dirty violet (# 2 + H2) soluble pigment brown-pale pink (Kl) Krasiljnikov's aerial mycelium abundant growth, purple-pale pink () K3) Medium I Carrier mycelium beige-dirty violet (Kl + H2) soluble pigment brown-pale pink-violet (K + F2 + H2) starch medium air mycelium moderate growth,
pale pink () IC3)
Carrier mycelium beige-pink (Kl) soluble pigment beige-pink (Kl) glucose-asparagine aerial mycelium extensive growth, light gray (K6)
Carrier mycelium sandy brownish to brown (Jl 7-K7) soluble pigment sandy brown (JI7 + K7) Waxman's nutrient aerial mycelium extensive growth, pale pink-gray (A3)
Carrier mycelium brown-hazelnut brown to dirty violet (B2-H2) soluble pigment brown-dark brown (B2) yeast medium with extensive aerial growth, pink-gray (A3) soluble starch Carrier mycelium brown (B7) soluble pigment sand-brown to brown (B7-K7 ) Glucose yeast medium aerial mycelium extensive growth, whitish (Dl)
Carrier mycelium dark brown (JI 5) soluble pigment brown (K7) oat medium air mycelium good growth,
pink-gray (A3)
Carrier mycelium dark brown-brown (B2) soluble pigment light brown (B7) malt medium aerial mycelium extensive growth, pink-gray (A3)
Carrier mycelium brown-hazelnut-brown (B2 + K7) soluble pigment dark brown-brown (B2 + K7) Gauze 2 medium air mycelium moderate growth, light gray (A6)
Carrier mycelium brown (K7) soluble pigment brown (K7) MPA aerial mycelium weak growth
Carrier mycelium beige-sand-colored (B6) soluble pigment is missing
Table 1 (continued) Culture medium parameter characteristics 2.
3 agar with tyrosine aerial mycelium abundant growth, purple-pink () K3)
Carrier mycelium plum blue-black. (O 1) soluble pigment umbra (07) Tresner's medium with aerial mycelium good growth, purple-pink () K3) iron citrate potato chips carrier mycelium dark umbra (fl 2) soluble pigment dark umber (# 2)
Aerial mycelium good growth, white to pink (03-X (3)
Carrier mycelium dark brown (Kl + Bl) soluble pigment dark brown (K 1 + Bl)
Physiological properties:
Aerobic, optimal growth at 24 to 30 C. None
Growth at 50 C. It has a moderately liquefying effect on gelatin, peptonises milk while browning and has a moderately hydrolyzing effect on starch. It forms melanoids (Tresner's
Medium with iron citrate and agar with tyrosine).
Streptomyces lavendofoliae, strain 12/3-A assimilates well the following carbon sources: D-glucose, D-xylose,
L-arabinose, D-fructose, D-galactose, inositol. It assimilates poorly or not at all: L-rhamnose, saccha rose, rafinose and D-mannitol. Streptomyces lavendofoliae,
Strain 12/3-A can be stored for 6 months at a temperature of +5 C on a suitable nutrient medium under a layer of petroleum jelly oil.
Antagonistic properties:
Streptomyces lavendofoliae 12/3-A is cultivated in a liquid nutrient medium on a shaker.
After 3 days, an amount of about 56 to 60 mg / ml achlacinomycin A has formed, which has the following antimicrobial activity, cytotoxic activity and antitumor activity on experimental animals (Tables 2 to 4).
Table 2 Antimicrobial spectrum of Achlacinomycin A, which was obtained from a culture of Streptomyces lavendofoliae strain 12/3-A, and from a comparative preparation.
Test organism MîC, ug / mlt
Achlacinomycin A Achlacinomycin A isolated from available from
St. Lavendofoliae Zaideanhojin
Biseibutsu Kagaku
Kenkyukai, Tokyo,
Japan 1. 2. 3.
Staphylococus aureus 15.56 7.8 209P Staph. aureus 209P
Streptomycin resistant 15.56 15.56
Penicillin resistant 15.56 15.56
Gentamycin resistant 15.56 15.56
Kanamycin resistant 11.6 11.6
Oelandomycin resist. 15.56 11.6
Linkomycin resistant 15.56 23.3
Violarin-resistant 23.3 19.0
Erythromycin resist. 31.2 23.2
Dactinomycin resist. 31.2 70.0
Novobiocin resist. > 250.0> 250.0
Rimfampicin resist. 125.0 125.0
Table (continued)
Vankomycin resist. 125.0 125.0 E.
coli 675> 250.0> 250.0 Pseudomanas aeruginosa> 250.0 250.0 Klebsiella pneumoniae> 250.0> 250.0 Providencia stuartii
ATCC 7240> 250.0> 250.0 Candida albicans> 250.0> 250.0 * MIC, the minimum, growth-inhibiting pharmaceutical concentration is determined by the fact that in two parallel-running test programs a standard microbe load of 105 / ml in a series of Test tube. containing the peptone broth as a nutrient medium and an increasing proportion of the pharmaceutical agent. Is cultivated for 20 hours at a temperature of 37 ° C. and a pH of 7.
Table 3 Antitumor effects of achlacinomycin A on experimental animals.
EMI3.1
<tb>
Animal breed <SEP> application <SEP> optimal <SEP> lifetime <SEP> tumor
<tb> <SEP> time <SEP> (days) <SEP> dosage <SEP> ex. <SEP> (%) <SEP> growth ver
<tb> <SEP> (mg / kg) <SEP> hes. <SEP> (0MO) <SEP>
<tb> La
<tb> CBFI <SEP> 1 # 9 <SEP> <SEP> 2.5 <SEP> 92
<tb> LLC
<tb> CBF <SEP> 1 - + 9 <SEP> 5 <SEP> 67
<tb> S-37
<tb> Bastard- <SEP> 1 # 5 <SEP> <SEP> 2.5 <SEP> 80
<tb> mice
<tb>
Table 4 Cytostatic effect of achlacinomycin A and its complexes with DNA on a suspended culture of tumor cells P-388 preparation EDso, psxml * Achlacinomycin A 0.01 Achlacinomycin A -DNA complex 0.01 * The dose leading to a reduction in the growth of the Nucleic acids (DNA + RNA) leads to 50%.
A comparison of the morphological and physiological properties of the strain 12/3-A according to the invention with that of the known producer of achlacinomycin A and B, Streptomyces galilaeus, confirms the differences between the cultures in question.
On the other hand, the microbial strain according to the present invention corresponds to the properties of Streptomyces lavendofoliae as defined by Bergey (Table 5), as can be seen from the basic principles above.
Table 5 Comparison of the morphological and physiological properties of a culture of the strain 12/3-A according to the invention, with the properties of the prototype Streptomyces galilaeus MA 144 and Streptomyces lavendofoliae.
Parameters strain 12/3-A Str. Galilaeus Str. Lavendofoliae
MA 144M1 (prototype) 2. 2. 3. 4.
Spore carriers spiral spiral spiral spores smooth, oval smooth, oval smooth, oval synthetic medium: aerial mycelium growth moderate good from good to growth, growth abundant, light gray to purple-pink bluish-pink gray () K3) carrier mycelium beige-pink to yellow-brown , yellow-brown dirty purple on some to (Jl 7-M2) media dark brown yellowish green soluble dark brown none or yellowish pigment to brown brown or dark brown dark brown pink-violet (Kl + r2 + H2) organic media:
: Aerial mycelium good growth moderate good growth pink-gray (A3) growth purple-pale pink light gray to dirty violet carrier mycelium sand brown to yellow brown dark brown brown to deep (X (7 + B7- dark brown
K7) soluble dark brown brown dark brown pigment (x7-B2 + K7) or deep dark brown U-potato chips: aerial mycelium good growth good growth good growth white to pink light gray dark brown (D3-) K3) to pink carrier mycelium dark brown brown-yellow dark brown (Kl + Bl) soluble dark brown hazelnut dark brown pigment (Kl + Bl) brown melanoids: formed formed formed growth on cellulose well moderately good milk:
under moderate under
Browning peptonized Browning peptonized Peptonized Hydrolysis of starch moderate moderate moderate
Table (continued) liquefaction of gelatin moderate moderate moderate sucrose - + D-glucose + + + D-xylose + + + L-arabinose + + + L-rhamnose - + - D-fructose + + D-galactose + + + raffinose - + D-mannitol inositol - + +
The following references were used in the taxonometric determination of the culture 12/3-A: Krasiljnikov, N.V. Radiant fungi, Nauka Publishers, 1970, pages 172, 238; Bergey's Manual of Determinative Bacteriology, Editors: Buchanan R.E., Gibbons, N.E. et al., pages 808 to 810.
Any substrate that can be assimilated by the achlacinomycin-producing strain of the species Streptomyces lavendofoliae can be used as nutrient medium.
Fructose, glucose, arabinose, xylose, galactose, starch etc. are preferably used as the carbon source (carbohydrate source) in the nutrient medium.
As a nitrogen source, meat extract, peplon, corn extract, yeast extract, casein, hydrolyzate, corn flour, soy flour, cottonseed flour, etc., as well as nitrogenous organic and inorganic compounds, such as ammonium salts (nitrates, sulfates, phosphates, etc.), urea, etc.
be used.
Mineral salts such as calcium carbonate, sodium and potassium phosphate, sodium and potassium chloride, magnesium salts, copper and other mineral salts can also be added to the medium.
Larger amounts of achlacinomycin A and B are produced in two stages using an aerated deep culture. The fermenter is inoculated with vegetative mycelium. The substrate used for the culture of vegetative mycelium can be the same as that used in the biosynthesis of achlacinomycin A and B, but can also be different.
A test of various possible media showed. that the nutrient media B-2 and B-3 appear the cheapest: component nutrient medium B-2 (%) B-3 (%)
1. ammonium sulfate 0.1 1.5 2. soy flour 1.1 1.5 3. potato starch 2.6 3.0 4. calcium carbonate 0.8 1.4 5. sodium chloride 0.3 0.3 6. copper sulfate 0.007 0.007 7. Anti-foaming agent AC-60 0.5 0.5
The medium is sterilized at a temperature of 124 to 126dz for 30 to 40 minutes, after which the pH of the medium is neutral.
Streptomyces lavendofoliae, strain 12/3-A produces in the culture and with aeration in the extent of 11/1 medium / min. (one liter of air per liter of medium and minute), at a temperature of 20 to 30 ° C. and a pH of about 6-8.5, preferably 6.9-7.9, after 48 to 96 hours of achlacinomycin A in an amount up to 60 mg / l and achlacinomycin Am an amount of 4-10 mg / l.
Table 6 Comparison of the physico-chemical properties of Achlacinomycin A from St. galilaeus (antibiotic from Zaidanhojin Biseibutsu Kagaku, Kenkyukai, Tokyo, Japan) and from St. Lavendofoliae.
Antibiotic-producing strain
St. galilaeus MA 144 ml St. lavendofoliae
2. 3.
UV spectrum *
1% Xnm / E max 1 cm 90% MeOH 431.5 / 146.1 / 290 / 431.5 / 148.6 /, 289 / 112.1 / 137.4 / 257 / 302.9 /
257 / 285.3 /, 228 /, 228/502 /;
485.7 /; 0.1N HCl 431.5 / 146.1 /, 257 / 431.5 / 151.4 /, 289 /
285.3 / 137.4 /, 290 / 112.1 /, 228 /, 257 / 302.9 /, 228 /
485.7 /; 499.2 /; 0.1N NaOH 521.3 / 118.9 /, 317.3 / 521.3 / 130 /, 318.3 /
64.5 / 285 / 101.9 /, 236 / 78.5 /, 284 / 126.2 /
424.6, 236 / 440.3 /.
IR spectrum ** Wmax cm- 3450.2980.2945.2820, 3480.2980.2950.2825,
2760,1735,1675,1620, 2775,1735,1680,1625,
1600.1010. 1600.1010.
PMR spectrum *** #ppm 12.55, lH, s .; 12.7, 1H, s .;
12.0, 1H, s .; 12.0, 1H, s .;
7.15-7.85.4H, m .; 7.83 1H, J1 = 1.8 Hz
5.58 1H, s .; J2 = 7.8 Hz; 7.68, 1H, t.
J = 7.8 Hz;
7.68, 1H, s .; 7.30.
5.31 1H, s .; 1H, J1 = 1.8 Hz, J2 =
4.95-5.20, 2H, m .; 7.8 Hz
4.35-4.65.2H, m .; 5.52 1H, m.; 5.28.1H,
4.11.1H, s .; m.; 4.95-5.20.2H, m;
4.40-4.70, 2H, m .;
4.11 1H, s .;
3.68, 3H, s .; 3.70, 3H, s;
2.3-2.7 5H, m .;
2.25-2.65, 5H, m .; 2.23, 6H, s .; 1.40-2.15,
2.20.6H, s .; 8H, m .; 1.32.3H, d .;
J = 6.6 Hz .; 1.45-2.15, 8H, m .; 1.29, 3H, d.
J = 6.4 Hz;
1.00-1.36 12H, m .; 1.17.3H, d.
J = 6.2 Hz;
1.08.3H, t., J = 7 Hz.
Mass spectrum **** m / z 376/100% /; 114, / 2.6% /,
377/50% /, 376/100% /, 795/15% /, 377 / 42.8% /,
812.30% /, 394, / 5.1% /,
416 / 1.5% /,
794 / 10.2% /,
812 / 28.8% /.
* The UV spectra were recorded on a Pye Unicam SP-8-100 instrument using standard HO-720540 and Di-720538 filters
Pye Unicam was calibrated.
** The IR spectra were recorded on a UR-20 instrument in a tablet with KBr.
*** The PMR spectra were recorded on a Bruker WH 90 instrument,
90 MHz with CDCl3, TMS added as reference.
**** The mass spectra of the field desorption were recorded on a Varian Mat 31 I-A instrument. The calibration was done with PFK.
The emitter current was 5 to 20 mA.
Table 7 Comparison of the physico-chemical properties of Achlacinomycin B from St. galilaeus and St. lavendofoliae.
Antibiotic-producing strain
Str. Galilaeus MA 144 Ml Str. Lavendofoliae 1. 2. 3.
UV spectrum 1% Xnm / E / max Icm 90% MeOh 432/159 /, 298.5 / 137 / 431.5 / 149.2 /, 290 /, 259/313 /, 229.5 / 498; 119 /, 257/296 /, 228 /
508 /; 0.1N HCl 431/162 /, 289.5 / 156 / 431.5 / 149 /, 290/119 /, 259/355 /, 229/586 /; , 257/296 /, 228/503; 0.1N NaOH 522/145 /, 315/101 / 521.3 / 127 /, 316.3 /, 284/160 /, 239/510. 77.3 /, 285/119 /, 236 /
453 /.
IR spectrum vcm-1 3540,2980,2945,2820, 3490,2980,2950,2830, max 2760,1730,1675,1620, 2780,1735,1680,1625,
1600.1010. 1605.1015.
PMR spectrum #ppm 12.2, lH, s .; 12.68, lH, s .;
11.5.1H, s .; 12.02.1H, s .;
7.2-7.9, 4H, m .; 7.24-7.89, 4H, m .;
5.5, 1H, s .; 5.48, 1H, s .;
5.1-5.3, 3H, m .; 5.09-5.27, 3H, m .:
4.6-4.9, 2H, m .; 4.62-4.90, 2H, m;
4.5, 1H, s .; 4.53, 1H, s .;
4.3-4.4, 1H, m .; 4.36, 1H, q .;
4.15, lH, s .; 4.11, lH, s .;
3.8-4.0, 2H, m .; 3.90-4.03, 2H, m .;
3.7.3H, s .; 3.75.1H, s .;
2.2-2.7.4H, m .; 3.69.3H, s .;
2.2, 6H, s .;
2.58, 2H, d .; 1.4-2.0, 8H, m .; 2.46, 1H, d .; 0.9-1.4, 12H, m .; 2.35, 1H, s .;
2.15.6H, s .;
1.45-2.01, 8H, m .;
0.89-1.45, 12H, m .;
The UV-IR and PMR spectra of achlacinomycin A and B are shown in FIGS. 1 to 6.
1 shows the UV spectrum of achlacinomycin A hydrochloride in 90% methanol, FIG. 2 shows the UV spectrum of achlacinomycin B hydrochloride in 90% methanol, FIG. 3 shows the IR spectrum of achlacinomycin A hydrochloride from a KBr tablet 4 shows the IR spectrum of achlacinomycin B hydrochloride from a KBr tablet, FIG. 5 shows the PMR spectrum of Achlacino mycin A hydrochloride (CDCl3 - TMS; T = 303 "C) and FIG. 6 shows the PMR spectrum of achlacinomycin B hydrochloride (CDCl3-TMS; T = 303 C).
Achlacinomycins A and B are contained in the mycelium and in the (nutrient) medium. After fermentation, the medium is filtered at a pH of 4.5 - 6.0. The antibiotics are extracted from the medium with ethyl acetate (one volume part of ethyl acetate is used for 10 parts by volume of the medium).
The antibiotic-containing organic layer is separated from the mycelium. After removing the solvents, the aqueous residues are combined and neutralized to a pH of 6.9. The antibiotics are then extracted with toluene and twice the volume of a 0.01 N HCL solution. The antibiotics are extracted from the aqueous solution with chloroform, which is dried on Na2SO4 anhydride.
The chloroform extract is concentrated in a rotary evaporator to 0.1 volume and the residue is added 10 to 12 parts by volume of dry hexane. The precipitated antibiotics are separated off and dried.
The antibiotics are purified and separated chromatographically on aqueous silica in a solvent system consisting of carbon tetrachloride and isopropanol.
Tables 6 and 7 show the results of a comparison of achlacinomycin A and B, which results were obtained by UV-IR-PMR and mass spectrography and which the similarities between the antibiotics which are obtained with the strain according to the invention and the strains previously known, to confirm.
The antibiotics achlacinomycin A and B, which are produced with the strain 1 2/3-A of Str. Lavendofoliae, are thus identical to the antibiotics which are produced by the culture of Str.
galilaeus MA144 M1 can be obtained. It was not previously known that Str. Lavendofoliae is able to produce achlacinomycin A and B. The method according to the invention is explained in connection with the following exemplary embodiments.
Example I
Streptomyces lavendofoliae of the strain 12/3-A are cultivated on a solid oat culture medium at a temperature of 28 ° C. for 12 days until sufficient aerial mycelium has developed. The culture is placed in a 750 ml Erlenmeyer flask in a B-2 medium transferred, which contains neither copper sulfate nor an anti-foaming agent. The flask is stirred on a shaker at 250 rpm. The temperature is 28 ° C., the treatment time is 2 days. The culture from the Erlenmeyer flask is transferred in a proportion of 5% in a 10 1 inoculation fermenter in a B-2 medium which contains no copper sulfate.
The fermenter is stirred at a speed of 200 rpm and aerated with 10 l / min of air at a temperature of 28 ° C. for one day.
3 liters of the culture liquid from this fermenter are transferred into 60 liters of B-2 nutrient medium in a 100 liter fermenter. The fermenter is stirred at 200 rpm and aerated with 60 l / min of air at a temperature of 27 ° C. for 3 days.
The content of achlacinomycin A and B in the medium is determined by the following method.
1) Determines the content of achlacinomycin A and B in the mycelium:
After the fermentation is complete, the 5 ml mycelium is centrifuged at 2000 rpm for 10 min.
separated. The antibiotics are extracted from the mycelium obtained in this way for two hours using 4 ml of acetone, the mixture being stirred at intervals of 15 to 20 minutes. The acetone is evaporated from 1 ml of extract in vacuo at a temperature below 40 C and the residue is extracted with 1.0 ml of chloroform. The concentrated chloroform extract is used for the chromatographic separation of the complex containing antibiotics. For this purpose, a plate is used that is covered with a 2 cm wide edge strip on the left and bottom edge with an adsorbing layer. The entire chloroform extract is applied to the plate using a capillary in the form of a line from 1 to 1.5 cm wide. A standard solution of achlacinomycin A and B is applied to the same plate.
The plate is placed in a chromatographic chamber which contains a chloroform-ethyl acetate-methanol mixture in a ratio of 7: 2: 1. When the solvent front reaches the edge of the plate, the plate is removed and dried in air for 20 minutes. The yellow zones resulting from the mobility of achlacinomycin A and B are washed separately with 4 ml of methanol (pH = 6) and measured spectrophotometrically at a wavelength of 430 nm. The levels of achlacinomycin (mg / l culture medium) are based on the specific absorbance of the achlacinomy (E "i cm for achlacinomycin A and B are 161 and 159, J.
Antibiotics 1979, 32, no. 8, p. 781-800) according to the following formula: Achlacinomycin A C mg / ml = 199 D Achlacinomycin B C mg / ml = 201 D
2) Determination of the content of achlacinomycin A and B in the medium:
The mycelium is separated from 5 ml of medium by centrifugation. The extraction is carried out with the aid of ethyl acetate at a pH of 6 and in a ratio of 5 ml of medium to 5 ml of ethyl acetate. 2 ml of the ethyl acetate extract are evaporated in vacuo and the residue is extracted with 2 ml of chloroform. The rest of the procedure is as in point 1).
The amounts of achlacinomycin A and B are determined on the basis of the specific absorbance according to the following formula: achlacinomycin A C mg / ml = 124.2 D achlacinomycin B C mg / ml = 125.8 D
After 3 days of fermentation in medium B-2, the culture 1 2/3-A produces about 56 mg / l achlacinomycin A and about 4 to 8 mg / l achlacinomycin B.
To separate the achlacinomycin A and B from the medium, 60 liters are filtered in a suction filter with a pH value of 4.5 - 5.0. The antibiotics in the medium are extracted with ethyl acetate in a ratio of 10: 1. The organic layer is separated and evaporated in vacuo in a rotary evaporator at a temperature not above 40 ° C. until the residue is an aqueous solution.
The wet mycelium (5 kg) is extracted twice with 10 liters of acetone. The mycelium is separated by filtration and deposited. The acetone extracts are combined and evaporated. The aqueous residues which result after evaporation of the ethyl acetate and acetone are combined and the concentrate (51) obtained in this way is neutralized to a pH of 6.8 with a 10% NaOH solution, the antibiotics be extracted with 3 x 10 1 toluene. The toluene extracts are combined and the aqueous layer is deposited. The toluene extract (30 1) is evaporated in vacuo at a temperature which does not exceed 40 ° C. until the residue is 3 1.
The antibiotics are extracted from this concentrate with 0.5 times the volume of 0.01N HCl. The emulsion resulting from this extraction step is broken by centrifugation. The antibiotics in the watery
Solution are extracted with 0.5 times the volume of chloroform. The extraction time is continuous
Stir for 20 to 30 minutes.
The emulsion obtained is broken by centrifugation. The chloroform layer (1.5 l) is obtained and dried over Na2SO4 anhydride (10 g Na2SO4 / 100 ml of the extract) for four hours. The Na2SO4 is filtered off and the chloroform is vacuumed in one
Rotary evaporator distilled to 0.1 times the volume. The residue is added to 10 to 12 times the volume of dry hexane, forming a precipitate which is allowed to settle (30 min.). The deposited antibiotics are filtered on a No. 4 glass filter and dried.
The filtrate is evaporated to dryness in a rotary evaporator at a temperature not exceeding 40 ° C. The residue is suspended in hexane and the hexane is separated off by filtration. Both residues are separated off and purified by chromatography. The yield is 2 , 5 g of crude product.
Chromatographic separation of the achlacinomycins
A column (8x95 cm) is filled with 5.5 l of a suspension consisting of 1.8 kg of aqueous silica (250-400 μm) and 5.51 of chloroform, in which 0.5% of triethylamine and acetic acid have been dissolved. After filling, the column is rinsed with 3 liters of chloroform. The above-mentioned crude product (10 g) is added dissolved in 100 ml of chloroform. After the antibiotics have been absorbed, the column is rinsed out. A gradual washout is carried out to separate the antibiotics.
For this purpose, the following substances are passed through the column:
1) 41 carbon tetrachloride
2) 8 1 of a solvent system consisting of carbon tetrachloride and isopropanol (25: 1)
3) 8.5 l of a solvent system consisting of carbon tetrachloride and isopropanol (20: 1)
4) 20.5 liters of a solvent system consisting of carbon tetrachloride and isopropanol (10: 1).
Achlacinomycin B is removed from the column using the CCI4: isopropanol (20: 1) system and achlacinomycin A using the CCI4: isopropanol (10: 1) system. The washouts (5 to 7 l), which contain the achlacinomycins A and B, are extracted separately with 0.2 times the volume of a 0.01 N NaOH solution.
The antibiotics are extracted from the aqueous phase with 0.2 times the volume. The chloroform extracts of achlacinomycins A and B are dried separately with Na2SO4 anhydride (2 g / 100 ml solution), the sodium sulfate is filtered off and the filtrate is evaporated in vacuo to 40 times the volume to 0.1 times the volume. times the volume of dry hexane is added and the mixture is left to stand for about 30 minutes, the residue is filtered on a glass filter No. 4 and the product obtained is air-dried. In this way 2.5 g of the crude product become 0.7 g Achlacinomycin A and 0.1 g Achlacinomycin B behave.
Example 2
Streptomyces lavendofoliae strain 12/3-A is cultivated on an oat culture medium for 12 days. The culture is transferred to a flask. which contains B-2 as nutrient medium without copper sulfate. The flask is shaken for 2 days at a temperature of 28 ° C. at 250 rpm. The culture is transferred to an Erlenmeyer flask. The amount transferred typically corresponds to 5-10% of the volume of the medium. B- 3, which consists of the following components: soy flour - 1.5%, potato starch - 3%, calcium carbonate - 1.4%, sodium chloride 0.3%, copper sulfate - 0.007%. The culture conditions are the same as in Example 1 and the culture time is 72 hours and the activity of the culture medium is then 60 mg / l achlacinomycin A and 10 mg / l achlacinomycin B.
The chemical separation of Achlacinomycins A and B is carried out in the same procedure as in Example 1.
As can be seen from the exemplary embodiments, the process according to the invention for the production of achlacinomycin A and B has the following advantages over the known process:
1. Higher yield of achlacinomycin A. The prototype strain produces 46 .mu.g / ml and the strain according to the invention even 60 g / ml.
2. No formation of cinerubin A and B, so that additional cleaning is avoided. In the known processes, these by-products have to be separated off as metal ion complexes.
3. Less achlacinomycin B is formed. The prolotype strain produces 23 µg / ml and the strain according to the invention produces 4 to 8 µg / ml.