CN109705174B - 妥布霉素的提取方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种妥布霉素的提取方法，包括：(1)将5′氨基甲酰妥布霉素发酵滤液调pH至7.0～7.5，加入阳离子树脂吸附，用水、氨水洗脱，收集氨水洗脱液；(2)浓缩洗脱液；(3)所得浓缩液在碱性条件下进行水解，调水解液pH至5.0～6.0，用阳离子树脂进行脱色，收集脱色液，调pH至7.0～7.5，通过装有阳离子树脂的中压层析自备柱，用水、氨水洗脱，收集氨水洗脱液，然后通过强碱性阴离子树脂进行脱色，收集脱色液；(4)所得脱色液浓缩后用活性炭脱色，然后喷雾干燥，即得妥布霉素成品。该方法简化了生产工艺、使用超纳滤结合中压层析自备柱技术，缩短生产周期，无溶媒结晶，无残留溶剂，减少了环保排放及处理压力。

Description

妥布霉素的提取方法

技术领域

本发明属于生物医药领域，具体地说，涉及一种妥布霉素的提取方法。

背景技术

妥布霉素(托普霉素)是氨基糖苷类抗生素，是由黑暗链霉菌发酵得到的产物。目前妥布霉素发酵过程主要产生5′氨基甲酰妥布霉素、安普霉素及氨基甲酰卡拉霉素B(kb)这3种产物约各占30％，此外还有约10％左右的其他杂质产物，经过水解生产妥布霉素及卡那霉素B及其他副产物。这3类物质都是氨基糖苷类抗生素，性质非常接近，整个妥布霉素提纯过程工艺复杂，生产周期长，生产过程质量控制难度大。因此需要对现有的妥布霉素提取方法进行改良。

发明内容

本发明的目的是提供一种改良的妥布霉素提取方法，通过对现有妥布霉素提取工艺步骤进行优化改进，取消乙醇结晶工艺，不仅获得质量更好的妥布霉素成品，并且能够有效去除产品中的残留溶媒。

为了实现本发明目的，本发明提供一种妥布霉素的提取方法，包括以下步骤：

(1)将黑暗链霉菌(Streptomyces tenebrarius)发酵所得5′氨基甲酰妥布霉素发酵液进行过滤，收集滤液，调pH至7.0～7.5，加入大孔阳离子交换树脂I吸附，吸附结束后收集树脂，依次用纯化水、氨水洗脱，收集含有5′氨基甲酰妥布霉素的氨水洗脱液；

(2)将(1)收集的氨水洗脱液浓缩(优选超纳滤法)；

(3)将(2)所得浓缩液在碱性条件下进行水解，得到妥布霉素水解液，调pH至5.0～6.0，通过大孔阳离子交换树脂II(过柱)进行脱色，收集脱色液①，调pH至7.0～7.5，通过装有大孔阳离子交换树脂III的中压层析自备柱，先用纯化水洗脱，然后用氨水进行梯度洗脱，收集氨水洗脱液，然后通过强碱性阴离子交换树脂(过柱)进行脱色，收集脱色液②(妥布霉素纯度大于95％)；

(4)将(3)所得脱色液②浓缩(优选超纳滤法)后用活性炭脱色，然后喷雾干燥，即得妥布霉素成品。

本发明中，所用大孔阳离子交换树脂I优选为HZ-3C、D152或D151。更优选40～60目。

所用大孔阳离子交换树脂II优选为HD-2或122。更优选40～60目。

所用大孔阳离子色谱树脂III优选为HZ-3C或HZ-3B。更优选120目～160目。

所用强碱性阴离子交换树脂优选为201×7或201×4。更优选40～60目。

前述的方法，步骤(1)中用浓度为0.3～2mol/L的氨水进行梯度洗脱，优选氨水浓度为0.3～1mol/L。进一步地，先用低浓度的氨水进行洗脱，洗脱过程中用薄层TLC法(薄层层析法)进行组分检测，当出现5′氨基甲酰妥布霉素时，更换较高浓度的氨水进行洗脱并收集5′氨基甲酰妥布霉素。

前述的方法，步骤(2)中先用截留分子量5000Da的超滤膜进行过滤，再用截留分子量200Da的纳滤膜进行浓缩，浓缩至5′氨基甲酰妥布霉素的浓度为8～12％(手持糖量计)。

前述的方法，步骤(3)是向(2)所得浓缩液中加入浓缩液体积16～20％的分析纯氨水，在90～100℃下水解2-3h。用薄层TLC法对水解产物进行检测，使5′氨基甲酰妥布霉素全部转化为妥布霉素。

前述的方法，步骤(3)中所述中压层析自备柱的径高比(柱的直径和高度之比)为1:15，柱中装有120～160目的HZ-3C或HZ-3B色谱树脂。

进一步地，用氨水将脱色液①调至pH7.0～7.5，然后上柱(中压层析自备柱)，用浓度为0.2～1mol/L的氨水进行梯度洗脱，且用于洗脱的氨水浓度逐级递增。例如，先用0.25mol/L氨水进行洗脱，洗脱过程中收集流出液，对流出液进行TLC检测，当出现单一妥布霉素斑点，即更换为1mol/L氨水进行洗脱。或者，先用0.2mol/L氨水进行洗脱，洗脱过程中收集流出液，对流出液进行TLC检测，当出现单一妥布霉素斑点，即更换为0.5mol/L氨水进行洗脱。

优选地，洗脱过程中柱压力控制在2～3MPa。

前述的方法，步骤(4)中先用截留分子量3000Da的超滤膜进行过滤，再用截留分子量200Da的纳滤膜进行浓缩，浓缩至妥布霉素的浓度为15～20％(手持糖量计)。浓缩液进行炭脱，喷雾干燥，得到妥布霉素成品。

前述的方法，步骤(1)用TLC法对收集的氨水洗脱液进行检测，使最终收集的氨水洗脱液中5′氨基甲酰妥布霉素纯度为90％。

借由上述技术方案，本发明至少具有下列优点及有益效果：

本发明提供的改良的妥布霉素提取方法，先将发酵滤液中的5′氨基甲酰妥布霉素提取出来，然后再进行水解，得到90％纯度的妥布霉素，然后再经过中压层析自备柱进一步提纯，采用喷雾干燥方式即可得到高纯度的妥布霉素。该方法简化了生产工艺、使用超纳滤结合中压层析自备柱技术，缩短生产周期(由原来3个月的生产周期缩短至1.5个月)，实现了无溶媒结晶，无残留溶剂，减少了环保排放及处理压力。

本发明通过对提取工艺步骤进行优化，采用较为先进的超纳滤及中压色谱层析技术，替代了原有的乙醇结晶工艺，乙醇残留为0；主要杂质RRT0.96可由原来的0.1％降至0.05％以下，杂质RRT0.73可由原来的0.3％降至0.15％以下；总杂质由原来的0.8％降至0.5％以下；妥布霉素含量由原来的950μg/mg提高到970μg/mg以上。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。

以下实施例中使用的HZ-3C树脂、D151树脂、D152树脂、HD-2树脂、122树脂、HZ-3C树脂、HZ-3B树脂、201×7树脂、201×4树脂均购自上海华震科技有限公司。

以下实施例中黑暗链霉菌发酵液的制备可参考王凯晨.妥布霉素发酵液粗品的分离纯化的工艺研究[D].2016。

实施例1妥布霉素的提取方法

1、用氨水调解黑暗链霉菌的发酵滤液(发酵滤液样品)，控制pH＝7.05，将大孔阳离子树脂HZ-3C投入到滤液中进行静态吸附，树脂按4万吸附单位进行计算投加。吸附结束后，收集树脂装入树脂柱，用纯化水洗涤8h，然后用浓度0.3mol/L氨水进行洗脱，洗脱过程中用薄层层析法(TLC)进行组分检测，当出现5′氨基甲酰妥布霉素时，更换1.0mol/L氨水进行洗脱并收集5′氨基甲酰妥布霉素(发酵粗品1样品)。

2、将步骤1收集液用超纳滤系统(先用截留分子量5000Da的超滤膜进行过滤，再用截留分子量200Da的纳滤膜进行浓缩)进行浓缩，控制浓缩温度小于28℃，浓缩液浓度为8％(手持糖量计)，5′氨基甲酰妥布霉素浓缩液中氨基甲酰妥布霉素效价控制在12000u/ml左右。

3、将步骤2浓缩液加入浓缩液体积16％的分析纯氨水进行水解，水解温度98℃，保温水解2h。水解完后通过薄层层析法(TLC)检测方法判断5′氨基甲酰妥布霉素是否全部转化为妥布霉素。然后，采用HPLC法进行含量检测，妥布霉素含量为91％。(水解液1样品)

4、将水解液用盐酸调pH至5.0，物料过弱酸阳离子HD-2树脂进行脱色，收集脱色液然后用氨水调解pH至7.0，将物料吸附到色谱树脂HZ-3C(120～160目)上，用中压层析自备柱进行纯化液的制备。吸附完后，先用纯化水进行洗脱，再用0.25mol/L氨水进行洗脱，洗脱过程中收集流出液，对流出液进行TLC法检测，当出现单一妥布霉素斑点，即更换1mol/L氨水进行洗脱，将洗脱液串联至201×7树脂进行脱色，收集脱色液(纯化液1样品)。然后，采用HPLC法进行含量检测，妥布霉素含量为96％，RRT0.96杂质含量为0.034％，RRT0.73杂质含量为0.11％。注：RRT代表杂质的相对保留时间。利用杂质的相对保留时间对相应的杂质进行表征。

5、将纯化脱色液用超纳滤系统(先用截留分子量3000Da的超滤膜进行过滤，再用截留分子量200Da的纳滤膜进行浓缩)进行浓缩至浓度15％，再用活性炭进行脱色，然后采用喷雾干燥工艺获得妥布霉素成品(实施例1成品)。成品中妥布霉素含量为96.7％，kb含量0.034％，F含量为0.11％。

本实施例中使用的中压层析自备柱的径高比为1:15，柱中装有120～160目的HZ-3C色谱树脂。洗脱过程中柱压力控制在2MPa。

实施例2妥布霉素的提取方法

1、用氨水调解黑暗链霉菌的发酵滤液，控制pH＝7.20，用大孔阳离子树脂HZ-3C投入到滤液中进行静态吸附，树脂按4.5万吸附单位进行计算投加。吸附结束后，收集树脂装入树脂柱，用纯化水洗涤8h，然后用浓度0.4mol/L氨水进行洗脱，洗脱过程中用TLC进行组分检测，当出现氨基甲酰妥布霉素时，更换1.5mol/L氨水进行洗脱并收集氨基甲酰妥布霉素(发酵粗品2样品)。

2、将步骤1收集液用超纳滤系统(先用截留分子量5000Da的超滤膜进行过滤，再用截留分子量200Da的纳滤膜进行浓缩)进行浓缩，控制浓缩温度小于28℃，浓缩液浓度为10％，浓缩液中氨基甲酰妥布霉素效价控制在15000u/ml左右。

3、将步骤2浓缩液加入浓缩液体积20％的分析纯氨水进行水解，水解温度96℃，保温水解3h。水解完后通过TLC检测方法判断氨基甲酰妥布霉素是否全部转化为妥布霉素。然后，采用HPLC法进行含量检测，妥布霉素含量为93％(水解液2样品)。

4、将水解液用盐酸调pH至5.5，物料过弱酸阳离子122树脂进行脱色，收集脱色液然后用氨水调解pH至7.3，将物料吸附到色谱树脂HZ-3B上，用中压层析自备柱进行纯化液的制备。吸附完后，先用纯化水进行洗脱，再用0.2mol/L氨水进行洗脱，洗脱过程中收集流出液，对流出液进行TLC法检测，当出现单一妥布霉素斑点，即更换0.5mol/L氨水进行洗脱，将洗脱液串联至201×4树脂进行脱色，收集脱色液(纯化液2样品)。然后，采用HPLC法进行含量检测，妥布霉素含量为96.7％，RRT0.96杂质含量为0.025％，RRT0.73杂质含量为0.10％。注：RRT代表杂质的相对保留时间。可利用杂质的相对保留时间对相应的杂质进行表征。

5、将纯化脱色液用超纳滤系统(先用截留分子量3000Da的超滤膜进行过滤，再用截留分子量200Da的纳滤膜进行浓缩)进行浓缩至浓度18％，再用活性炭进行脱色，然后采用喷雾干燥工艺获得妥布霉素成品(实施例2成品)。成品中妥布霉素含量为97.2％，RRT0.96杂质含量为0.021％，RRT0.73杂质含量为0.09％。

本实施例中使用的中压层析自备柱的径高比为1:15，柱中装有120～160目的HZ-3B色谱树脂。洗脱过程中柱压力控制在2.5MPa。

实施例3妥布霉素的提取方法

1、用氨水调解黑暗链霉菌的发酵滤液，控制pH＝7.50，用大孔阳离子树脂HZ-3C投入到滤液中进行静态吸附，树脂按5.0万吸附单位进行计算投加。吸附结束后，收集树脂装入树脂柱，用纯化水洗涤8h，然后用浓度0.5mol/L氨水进行洗脱，洗脱过程中用TLC进行组分检测，当出现氨基甲酰妥布霉素时，更换2.0mol/L氨水进行洗脱并收集氨基甲酰妥布霉素(发酵粗品3样品)。

2、将步骤1收集液用超纳滤系统(先用截留分子量5000Da的超滤膜进行过滤，再用截留分子量200Da的纳滤膜进行浓缩)进行浓缩，控制浓缩温度小于28℃，浓缩液浓度控制为12％，浓缩液中氨基甲酰妥布霉素浓缩液中氨基甲酰妥布霉素效价控制在18000u/ml左右。

3、将步骤2浓缩液加入浓缩液体积20％的分析纯氨水进行水解，水解温度98℃，保温水解3h。水解完后通过TLC检测方法判断氨基甲酰妥布霉素是否全部转化为妥布霉素。然后，采用HPLC法进行含量检测，妥布霉素含量为93％(水解液3样品)。

4、将水解液用盐酸调pH至6.0，物料过弱酸阳离子122树脂进行脱色，收集脱色液然后用氨水调解pH至7.5，将物料吸附到色谱树脂HZ-3B上，用中压层析自备柱进行纯化液的制备。吸附完后，先用纯化水进行洗脱，再用0.25mol/L氨水进行洗脱，洗脱过程中收集流出液，对流出液进行TLC法检测，当出现单一妥布霉素斑点，即更换1.0mol/L氨水进行洗脱，将洗脱液串联至201×4树脂进行脱色，收集脱色液(纯化液3样品)。然后，采用HPLC法进行含量检测，妥布霉素含量为97.8％，RRT0.96杂质含量为0.012％，RRT0.73杂质含量为0.077％。注：RRT代表杂质的相对保留时间。利用杂质的相对保留时间对相应的杂质进行表征。

5、将纯化脱色液用超纳滤系统(先用截留分子量3000Da的超滤膜进行过滤，再用截留分子量200Da的纳滤膜进行浓缩)进行浓缩至浓度20％，再用活性炭进行脱色，然后采用喷雾干燥工艺获得妥布霉素成品(实施例3成品)。成品中妥布霉素含量为98.5％，RRT0.96杂质含量为0.013％，RRT0.73杂质含量为0.075％。

本实施例中使用的中压层析自备柱的径高比为1:15，柱中装有120～160目的HZ-3B色谱树脂。洗脱过程中柱压力控制在3.0MPa。

实施例4实施例1-3与原工艺的比较

从黑暗链霉菌的发酵滤液提取妥布霉素的原工艺，包括如下步骤：

1、用盐酸调解黑暗链霉菌的发酵滤液，控制pH＝6.0，用大孔阳离子树脂732投入到滤液中进行静态吸附，树脂按5万吸附单位进行计算投加。吸附结束后，收集树脂装入树脂柱，用纯化水洗涤2h，然后用浓度2.0mol/L氨水进行解析(发酵粗品原工艺样品)。

2、将732解析液进行浓缩，控制浓缩液浓度为10％，加入浓缩液体积15％氨水进行水解。水解温度98℃，水解时间3h。然后用TLC进行妥布霉素组分判定(水解液原工艺样品)。

3、将水解液通入阴离子树脂201×4树脂中进行脱色，收集滤液进行浓缩。用氨水调浓缩液pH至8.0，再将物料通入大孔阳离子树脂D151树脂柱中用纯化水、0.2mol/L、0.3mol/L、0.5mol/L氨水进行梯度洗脱。用TLC进行组分判断，收集单一妥布霉素。

4、将单一妥布霉素进行浓缩，调解浓缩液PH至5.5过122树脂进行脱色，调解脱色液pH至8.0通入D151树脂进行纯化解析(纯化液原工艺样品)。

5、将纯化解析液进行浓缩，控制浓度至38％，加入浓缩液体积6倍的乙醇结晶。然后分离干燥得到成品(成品原工艺样品)。

表1原工艺与实施例1-3提取过程中杂质及主成分含量对比

表2原工艺与实施例1-3制备的成品的质量对比

质量	原工艺	实施例1	实施例2	实施例3
					色级	1号色	0.5号	0.5号	0.5号
澄清度	0.5	0.5	0.5	0.5
					比旋度	139.2	141.8	143.2	143.6
乙醇残留	0.05％	0	0	0
					总杂质	0.54％	0.38％	0.36％	0.36％

表3原工艺与实施例1-3提取方法的生产参数对比

从以上比较可以看出：1、妥布霉素提取原工艺在水解前没有对发酵液进行纯化得到比较纯的物质，因而在水解过程中又再次发生一些化学反应，加大了杂质含量。而本发明工艺中从发酵液中提取较为纯的产物后，再进行水解从而使水解过程中杂质减少，增大产物的转化率。2、纯化过程中，原工艺采用常规的柱层析，杂质分离效果较差，且时间长。本发明工艺在水解的基础上，采用中压色谱技术，大大提高了产物的纯度，降低了杂质含量，可省去后续结晶工艺。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (3)

1.妥布霉素的提取方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)将黑暗链霉菌(Streptomyces tenebrarius)发酵所得5′氨基甲酰妥布霉素发酵液进行过滤，收集滤液，调pH至7.0～7.5，加入大孔阳离子交换树脂I吸附，吸附结束后收集树脂，依次用纯化水、氨水洗脱，收集含有5′氨基甲酰妥布霉素的氨水洗脱液；

(2)将(1)收集的氨水洗脱液浓缩；

(3)将(2)所得浓缩液在碱性条件下进行水解，得到妥布霉素水解液，调pH至5.0～6.0，通过大孔阳离子交换树脂II进行脱色，收集脱色液①，调pH至7.0～7.5，通过装有大孔阳离子色谱树脂III的中压层析自备柱，先用纯化水洗脱，然后用氨水进行梯度洗脱，收集氨水洗脱液，然后通过强碱性阴离子交换树脂进行脱色，收集脱色液②；

(4)将(3)所得脱色液②浓缩后用活性炭脱色，然后喷雾干燥，即得妥布霉素成品；

所述大孔阳离子交换树脂I为HZ-3C；和/或

所述大孔阳离子交换树脂II为HD-2或122；和/或

所述强碱性阴离子交换树脂为201×7或201×4；

步骤(1)中用浓度为0.3～1mol/L的氨水进行梯度洗脱；

步骤(2)中先用截留分子量5000Da的超滤膜进行过滤，再用截留分子量200Da的纳滤膜进行浓缩，浓缩至5′氨基甲酰妥布霉素的浓度为8～12％；

步骤(3)是向(2)所得浓缩液中加入浓缩液体积16～20％的分析纯氨水，在90～100℃下水解2-3h；

步骤(3)中所述中压层析自备柱的径高比为1:15，柱中装有120～160目的HZ-3C或HZ-3B色谱树脂；

步骤(3)中用氨水将脱色液①调至pH7.0～7.5，然后上柱，用浓度为0.2～1mol/L的氨水进行梯度洗脱，且用于洗脱的氨水浓度逐级递增；其中，洗脱过程中柱压力控制在2～3MPa；

步骤(4)中先用截留分子量3000Da的超滤膜进行过滤，再用截留分子量200Da的纳滤膜进行浓缩，浓缩至妥布霉素的浓度为15～20％。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中先用低浓度的氨水进行洗脱，洗脱过程中用薄层TLC法进行组分检测，当出现5′氨基甲酰妥布霉素时，更换较高浓度的氨水进行洗脱并收集5′氨基甲酰妥布霉素。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，步骤(1)用薄层TLC法对收集的氨水洗脱液进行检测，使最终收集的氨水洗脱液中5′氨基甲酰妥布霉素纯度为90％。