CN102477052A - 一种提取安普霉素的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种提取安普霉素的方法。该方法包括将生产氨基甲酰妥布霉素的黑暗链霉菌发酵液通过阳离子型树脂进行提纯，得到含有安普霉素的氨基甲酰妥布霉素粗溶液；再进行水解，得到含有安普霉素的妥布霉素粗溶液；然后通过阳离子型树脂进行提纯，得到安普霉素溶液。根据本发明的方法，能够在从氨基甲酰妥布霉素发酵液生产妥布霉素的同时，将其副产物安普霉素提取出来，提高了妥布霉素生产过程中副产物的利用率，同时降低了产品的生产成本，并降低环保风险。

Description

一种提取安普霉素的方法

技术领域

本发明属于医药领域，涉及一种兽用原料药的制备方法，具体地说，涉及一种从氨基甲酰妥布霉素发酵液中提取精制安普霉素的方法。

背景技术

安普霉素(Apramycin)又名阿普拉霉素，属于氨基环醇类化合物，其结构如式(I)所示：

安普霉素在20世纪80年代由美国开发成功。将安普霉素作为药物型饲料添加剂，能明显促进动物增重和提高饲料转化率，因此其在畜禽养殖领域得到广泛应用。安普霉素的特点是抗菌谱广，不易产生抗药性。其对革兰氏阳性菌、部分革兰氏阴性菌均有效，对一部分霉浆菌也有效。对安普霉素最为敏感的是大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、支原体等。其中安普霉素对大肠杆菌和沙门氏杆菌的杀菌能力比抑菌能力还要强，对断奶后小猪下痢、鸡大肠杆菌有特效。此外，安普霉素也能作抗生素化学改造的起始物质。

黑暗链霉菌(Streptomyces tenebrarius)可产生一种属于氨基糖苷类的抗生素复合物，该复合物主要由三个活性组分组成，这三个活性组分为安普霉素、氨甲酰卡那霉素B和氨甲酰妥布拉霉素；后两个组分经水解分别生成适于临床应用的卡那霉素B和妥布拉霉素(参见科技文献1：方佩静等，“发酵液内氨甲酰妥布拉霉素的定量测定”，《微生物学通报》，1999年，26(1)，第45-47页)。

目前，行业内生产安普霉素的常规方法主要是通过将黑暗链霉菌菌株进行诱变得到高产安普霉素的菌株，并进行发酵、提取，其中提取采用树脂吸附、洗脱、浓缩、冻干干燥方法(参见科技文献2：熊宗贵等，“尼拉霉素单组份-安普霉素高产菌株的研究”，《中国抗生素杂志》1997年10月第22卷第5期，第334-339、350页)。

而行业内生产妥布霉素的常规方法主要是通过将黑暗链霉菌菌株进行诱变得到高产氨基甲酰妥布霉素的菌株，然后培养发酵并水解而得到妥布霉素(可参见科技文献3：林玉双等，“氨基甲酰妥布霉素高产菌株选育及其发酵特性研究”，《中国抗生素杂志》2008年第33卷7期)。在生产氨基甲酰妥布霉素的过程中，会产生安普霉素等副产物。如果能充分利用妥布霉素生产过程中产生的副产物，将安普霉素提取出来，则可降低产品的生产成本和环保风险。

但是到目前为止，还没有任何文献记载有关从生产妥布霉素的副产物中提取安普霉素的方法。

发明内容

为解决上述现有技术中存在的问题，本发明提供一种从生产氨基甲酰妥布霉素的黑暗链霉菌发酵液中提取安普霉素的方法具体而言，本发明提供：

(1)一种提取安普霉素的方法，该方法包括以下步骤：

1)将生产氨基甲酰妥布霉素的黑暗链霉菌(Streptomycestenebrarius)发酵液吸附到第一阳离子型树脂上，用第一洗脱剂洗脱，收集洗脱液，从而得到含有安普霉素的氨基甲酰妥布霉素粗溶液；

2)将所述的含有安普霉素的氨基甲酰妥布霉素粗溶液进行水解得到含有安普霉素的妥布霉素粗溶液；

3)将所述的含有安普霉素的妥布霉素粗溶液吸附到第二阳离子型树脂上，用第二洗脱剂洗脱，收集含有安普霉素的洗脱液组分，从而得到安普霉素溶液。

(2)如(1)所述的方法，其特征在于，在步骤1)中，将所述发酵液先酸化至pH5-6，再用所述第一阳离子型树脂进行吸附，并用氨水进行洗脱。

(3)如(2)所述的方法，其特征在于，在步骤1)中，所述第一阳离子型树脂为强酸性苯乙烯系阳离子交换树脂。

(4)如(1)所述的方法，其特征在于，在步骤2)中，所述水解为加热水解，水解温度为80-90℃，水解时间为1-3小时。

(5)如(4)所述的方法，其特征在于，在步骤2)中，在所述水解之前，将所述的含有安普霉素的氨基甲酰妥布霉素粗溶液的氨基甲酰妥布霉素浓度调节至2×10⁴-3×10⁴μ/ml。该浓度，即抗生素的生物效价，可根据科技文献1中所述的管碟扩散法或薄层层析生物显迹抑菌斑定量测定法进行测定。

(6)如(1)所述的方法，其特征在于，在步骤3)中，将所述的含有安普霉素的妥布霉素粗溶液先调节pH至8-9，再用所述第二阳离子型树脂进行吸附，并用氨水进行洗脱。

(7)如(6)所述的方法，其特征在于，在步骤3)中，在所述的用氨水进行洗脱的过程中，采用TLC薄层层析法对洗脱液组分进行监测，其中所述TLC薄层层析法以纯安普霉素为标准点位，当洗脱液组分的供试液的点位与安普霉素点位符合时，收集对应的含有安普霉素的洗脱液组分。

(8)如(6)所述的方法，其特征在于，在步骤3)中，所述第二阳离子型树脂为大孔丙烯酸系弱酸性阳离子交换树脂。

(9)如(1)所述的方法，其特征在于，该方法还包括：

4)将所得到的安普霉素溶液进一步纯化，其中，将所述安普霉素溶液用第二阳离子型树脂和第三阴离子型树脂串联柱进行纯化，并进行结晶，得到安普霉素。

(10)如(9)所述的方法，其特征在于，所述第二阳离子型树脂为大孔丙烯酸系弱酸性阳离子交换树脂，所述第三阴离子型树脂为强碱性苯乙烯系阴离子交换树脂。

根据本发明提供的从生产氨基甲酰妥布霉素的黑暗链霉菌发酵液中提取安普霉素的方法，能够在从氨基甲酰妥布霉素发酵液生产妥布霉素的同时，将其副产物安普霉素提取出来，并进行精制，得到安普霉素纯品，提高了妥布霉素生产过程中副产物的利用率，同时降低了生产成本，并降低了环保风险。本方法制备的安普霉素质量符合中国兽药典，适用于工业化连续生产。

以下通过具体实施方式的描述对本发明作进一步说明，但这并非是对本发明的限制，本领域技术人员根据本发明的基本思想，可以做出各种修改或改进，但是只要不脱离本发明的基本思想，均在本发明的范围之内。

具体实施方式

在本发明的步骤1)中，生产氨基甲酰妥布霉素的黑暗链霉菌可以是任何能主要产生氨基甲酰妥布霉素的黑暗链霉菌。可通过将黑暗链霉菌菌株进行诱变(例如，紫外照射)得到高产氨基甲酰妥布霉素的菌株。

在本发明的步骤1)中，优选的是，生产氨基甲酰妥布霉素的黑暗链霉菌发酵液可以先被酸化至pH5-6，更优选pH5.5，再将酸化后的发酵液用第一阳离子型树脂进行吸附。酸化可以用任何适合的酸溶液(包括但不限于：盐酸、硫酸、草酸等酸的溶液，优选盐酸溶液)以任何适合的浓度来进行。

在本发明的步骤1)中，第一阳离子型树脂优选为强酸性苯乙烯系阳离子交换树脂，例如732树脂(可购自安徽蚌埠市天星树脂有限责任公司)。本领域的技术人员可以根据发酵液的量来确定所用树脂的量，并确定吸附时间。

在本发明的步骤1)中，第一洗脱剂优选为氨水，浓度可以为1-2mol/L，优选为2mol/L。

在本发明的步骤2)中，所述水解优选为加热水解，温度优选为80-90℃，水解时间优选为1-3小时。本领域的技术人员可以根据洗脱液中氨基甲酰妥布霉素的含量来确定水解条件。例如，在所述水解之前可以将所述洗脱液中氨基甲酰妥布霉素的浓度调节至2×10⁴-3×10⁴μ/ml；水解温度为80-90℃，水解时间为2小时。

在本发明的步骤3)中，优选的是，将含有安普霉素的妥布霉素粗溶液先调节pH至8-9，再用第二阳离子型树脂进行吸附。其中，调节pH可以用任何适合的酸溶液(包括但不限于：盐酸、硫酸、草酸等酸的溶液，优选盐酸溶液)以任何适合的浓度来进行。

在本发明的步骤3)中，第二阳离子型树脂优选为大孔丙烯酸系弱酸性阳离子交换树脂，如D151树脂或D152树脂(均可购自安徽蚌埠市天星树脂有限责任公司)，优选D151树脂。

在本发明的步骤3)中，优选的是，当用第二阳离子型树脂吸附饱和之后，用去离子水进行预洗。本领域的技术人员可以根据含有安普霉素的妥布霉素粗溶液的量和所用第二阳离子型树脂的量，来确定预洗时间。

在本发明的步骤3)中，第二洗脱剂优选为氨水，浓度可以为0.3-1.0mol/L，优选为0.5mol/L。

在本发明的步骤3)中，在用氨水进行洗脱的过程中，可以采用任何适合的方法(例如，TLC薄层层析法、HPLC高效液相色谱等)对洗脱液组分进行监测。优选的是，采用TLC薄层层析法对洗脱液组分进行监测。其中该TLC薄层层析法以纯安普霉素为标准点位，当洗脱液组分的供试液的点位与安普霉素点位符合时，收集对应的含有安普霉素的洗脱液组分；当供试液的点位偏离安普霉素点位时，停止收集。合并所收集的含有安普霉素的洗脱液组分，从而得到安普霉素溶液。

优选的是，本发明还包括将所得到的安普霉素溶液进一步纯化的步骤4)，其中，将安普霉素溶液用第二阳离子型树脂和第三阴离子型树脂串联柱进行纯化，并进行结晶，得到安普霉素。

在本发明的步骤4)中，第二阳离子型树脂优选为大孔丙烯酸系弱酸性阳离子交换树脂，例如D151或D 152树脂，优选D151树脂；第三阴离子型树脂优选为强碱性苯乙烯系阴离子交换树脂，如711树脂或717树脂(均可购自安徽蚌埠市天星树脂有限责任公司)，优选711树脂。

在本发明的步骤4)中，优选的是，将安普霉素溶液先调节pH至8-9，再用第二阳离子型树脂进行吸附。其中，调节pH可以用任何适合的酸溶液(包括但不限于：盐酸、硫酸、草酸等酸的溶液，优选盐酸溶液)以任何适合的浓度来进行。

在本发明的步骤4)中，还优选的是，在用第二阳离子型树脂(优选D151树脂)和第三阴离子型树脂(优选711树脂)串联柱进行纯化时，先用第二阳离子型树脂进行吸附，再串联第三阴离子型树脂，然后用氨水进行洗脱(如果还有其它可供选择的洗脱剂，也请指出)，浓度可以为1-3mol/L，优选为2mol/L。该步骤能去除安普霉素溶液中的部分杂质和色素。

在本发明的步骤4)中，还优选的是，在将安普霉素溶液用第二阳离子型树脂和第三阴离子型树脂串联柱进行纯化之后，将所得到的洗脱液进行浓缩(优选采用薄膜浓缩)，得到结晶液。安普霉素结晶液的浓度优选为45×10⁴-50×10⁴μ/ml。还优选的是，在结晶液中加入其体积0.5-0.6％(W/V)的活性炭，炭脱一定时间后，再压滤以进行结晶。首先计量所得结晶液体积，在结晶罐中加入结晶液体积3-5倍的无水乙醇，再加入结晶液，搅拌，静置结晶，然后离心分离并干燥，制成安普霉素成品。

下述实施例1中所用的氨基甲酰妥布霉素发酵液(即，生产氨基甲酰妥布霉素的黑暗链霉菌发酵液)可通过如下方式得到：通过将黑暗链霉菌菌株(例如科技文献1中提到的黑暗链霉菌AS4.1098)培养筛选得到合格单菌落，然后经过常规发酵(例如可采用科技文献3中提到的发酵方法)，收集得到发酵液。

下述实施例1中所用D151树脂、711树脂、732树脂可购自安徽蚌埠市天星树脂有限责任公司；试剂氨水(分析纯)可购自重庆川东化工(集团)有限公司化学试剂厂；无水乙醇(分析纯)可购自广东汕头西陇化工股份有限公司。

实施例1

将18000L氨基甲酰妥布霉素含量为2550μ/ml的氨基甲酰妥布霉素发酵液用5mol/L HCl溶液调pH至5.5，然后加入700L 732树脂，搅拌吸附8小时，然后收集树脂，并将其移至树脂柱中，使用浓度为2mol/L的氨水作为洗脱剂进行洗脱，收集洗脱液2100L，氨基甲酰妥布霉素的含量为18000μ/ml。

将洗脱液中氨基甲酰妥布霉素的浓度调节至25450μ/ml，加热至80-90℃，水解2小时。

然后用浓度为2mol/L的HCl溶液将水解后溶液的pH调节至8.5，再加入到D151树脂柱中进行吸附，当D 151树脂吸附饱和后，用去离子水2000L洗涤24小时，再用浓度为0.5mol/L的氨水进行洗脱，控制氨水的流速为2000ml/分钟。

在用氨水进行洗脱的过程中，采用TLC薄层层析法对洗脱液组分进行监测。其中TLC薄层层析法以纯安普霉素为标准点位，当洗脱液组分的供试液的点位与安普霉素点位符合时，收集对应的含有安普霉素的洗脱液组分。当供试液的点位偏离安普霉素点位时，停止收集。最终收集的安普霉素溶液为1500L，安普霉素浓度为18500μ/ml，总亿为27.75ka(其中总亿为活性单位)。

将收集的安普霉素溶液的pH用浓度为2mol/L的HCL溶液调节至8-9，用D151树脂进行吸附，吸附饱和后串联711树脂，用浓度为2mol/L的氨水进行洗脱，得到洗脱液的体积为380L，安普霉素浓度为68900μ/ml，总亿为26.18ka。

接下来，将洗脱液采用薄膜浓缩方式浓缩至安普霉素浓度468250μ/ml，体积为53L；然后加入0.3kg活性炭，炭脱30分钟，过滤，计量所得结晶液体积为51L。在结晶罐中放入155L无水乙醇，再加入所得结晶液，搅拌2小时后，静置结晶8小时，然后离心分离并干燥，制成安普霉素成品20.81kg，对应洗脱收率为75％。

安普霉素成品经红外光谱和紫外光谱进行鉴定，符合安普霉素的特征。

Claims (10)

1.一种提取安普霉素的方法，该方法包括以下步骤：

1)将生产氨基甲酰妥布霉素的黑暗链霉菌(Streptomycestenebrarius)发酵液吸附到第一阳离子型树脂上，用第一洗脱剂洗脱，收集洗脱液，从而得到含有安普霉素的氨基甲酰妥布霉素粗溶液；

2)将所述的含有安普霉素的氨基甲酰妥布霉素粗溶液进行水解得到含有安普霉素的妥布霉素粗溶液；

3)将所述的含有安普霉素的妥布霉素粗溶液吸附到第二阳离子型树脂上，用第二洗脱剂洗脱，收集含有安普霉素的洗脱液组分，从而得到安普霉素溶液。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤1)中，将所述发酵液先酸化至pH5-6，再用所述第一阳离子型树脂进行吸附，并用氨水进行洗脱。

3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，在步骤1)中，所述第一阳离子型树脂为强酸性苯乙烯系阳离子交换树脂。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤2)中，所述水解为加热水解，水解温度为80-90℃，水解时间为1-3小时。

5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，在步骤2)中，在所述水解之前，将所述的含有安普霉素的氨基甲酰妥布霉素粗溶液的氨基甲酰妥布霉素浓度调节至2×10⁴-3×10⁴μ/ml。

6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤3)中，将所述的含有安普霉素的妥布霉素粗溶液先调节pH至8-9，再用所述第二阳离子型树脂进行吸附，并用氨水进行洗脱。

7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，在步骤3)中，在所述的用氨水进行洗脱的过程中，采用TLC薄层层析法对洗脱液组分进行监测，其中所述TLC薄层层析法以纯安普霉素为标准点位，当洗脱液组分的供试液的点位与安普霉素点位符合时，收集对应的含有安普霉素的洗脱液组分。

8.如权利要求6所述的方法，其特征在于，在步骤3)中，所述第二阳离子型树脂为大孔丙烯酸系弱酸性阳离子交换树脂。

9.如权利要求1所述的方法，其特征在于，该方法还包括：

4)将所得到的安普霉素溶液进一步纯化，其中，将所述安普霉素溶液用第二阳离子型交换树脂和第三阴离子型交换树脂串联柱进行纯化，并进行结晶，得到安普霉素。

10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述第二阳离子型交换树脂为大孔丙烯酸系弱酸性阳离子交换树脂，所述第三阴离子型交换树脂为强碱性苯乙烯系阴离子交换树脂。