CN106520554A - 一种获取安普霉素高产菌株的高通量筛选方法 - Google Patents

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CN106520554A CN201610929982.1A CN201610929982A CN106520554A CN 106520554 A CN106520554 A CN 106520554A CN 201610929982 A CN201610929982 A CN 201610929982A CN 106520554 A CN106520554 A CN 106520554A
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苏娟
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Abstract

本发明涉及一种获取安普霉素高产菌株的高通量筛选方法，步骤如下：(1)取黑暗链霉菌孢子至无菌水中，混合均匀，制得活跃链霉菌孢子悬液；(2)将黑暗链霉菌孢子悬液转接至灭菌后的培养皿中，无菌风吹干，制得菌膜，然后进行低能离子束的注射诱变，再进行紫外照射，使用无菌水洗涤后涂布平板培养基，制得单菌落；(3)将单菌落，接入孔板内的孔板培养基中，震荡培养，制得培养液；(4)将培养液，转接至含枯草芽孢杆菌的生测培养基平板中进行抑菌检测，选取抑菌圈直径大于15mm的单菌进行复筛。本发明所述获取安普霉素高产菌株的高通量筛选方法采用低能离子束紫外照射复合诱变，同时结合先进的高通量筛选技术效率高、筛选效果好、可重复性高。

Description

一种获取安普霉素高产菌株的高通量筛选方法
技术领域
本发明涉及一种获取安普霉素高产菌株的高通量筛选方法，属于物理诱变技术领域。
背景技术
安普霉素是由黑暗链霉菌产生的一类氨基糖苷类抗生素，安普霉素是一种广谱抗生素，作用于细菌的核糖体而导致mRNA密码的错读(misreading)，从而抑制蛋白质的合成。安普霉素由于具有独特的辛二糖结构，不易被氨基糖苷类抗生素的乙酰化酶、腺苷化酶、磷酸化酶钝化，对多种氨基糖苷类抗生素的耐药菌有抑制和杀灭作用，使用中不易产生交叉耐药性，同时具有低毒、低残留量、安全的特点，由于它具有上述特点，被广泛应用于由大肠杆菌、沙门氏菌等引起的畜禽急慢性腹泻、肠炎等疾病的预防和治疗且疗效显著。
安普霉素是近几年兴起的一种新型抗生素，其使用量不断扩大，目前，国内多家企事业单位对安普霉素生产工艺进行了开发优化，尤其是菌种方面，提升潜能较大。
高通量筛选技术近年来在生物育种领域得到了广泛的应用，能够成倍的提升菌种的选育数量，使用传统的诱变技术在海量的单菌落中挑选高产菌株成为可能，大大提高了选种效率。
低能离子是指能量在104KeV-105KeV之间的离子，它是相对于传统辐射生物学中106KeV-109KeV而言的，能够引起细胞性能改变，从而使菌体产生突变。
紫外诱变使用紫外照射使细胞碱基配对产生错乱，而引起突变的一种常规诱变方法，与新兴的基因技术相比，具有成本低、易操作等优点，目前仍是获取高产菌株的重要方法。
高通量筛选的技术难点是快速大量测定单菌产量高低，因一次选育菌种量较大，如何快速测定效价高低成为关键因素。
利用低能离子注入和紫外诱变时的主要技术难点是低能离子的能量低，理论射程很短，黑暗链霉菌未使用过低能离子和紫外复合处理，复合处理对黑暗链霉菌作用效果受哪些因素影响，目前并未研究清楚。
发明内容
本发明针对现有技术的不足，提供一种获取安普霉素高产菌株的高通量筛选方法。该方法可以有效提高安普霉素的选种效率和效果，为后续筛选高产安普霉素菌株提供技术支持。
本发明的技术方案如下：
一种获取安普霉素高产菌株的高通量筛选方法，步骤如下：
(1)取黑暗链霉菌孢子至无菌水中，混合均匀，制得黑暗链霉菌孢子悬液；
(2)将步骤(1)制得的黑暗链霉菌孢子悬液转接至灭菌后的培养皿中，无菌风吹干，制得菌膜，然后进行低能离子束的注射诱变，靶室真空度为6.0～8.0×10-3Pa，注射脉冲剂量设定为70～90×2.6×1014ions/(cm2·s)，注射完成后，再进行紫外照射28～32s，紫外灯管功率为15W，照射距离28～32cm，然后使用无菌水洗涤后涂布平板培养基，36～38℃培养7～8天，制得单菌落；
(3)将步骤(2)中制得的单菌落，接入孔板内的孔板培养基中，在36～38℃震荡培养5～6天，制得培养液；
(4)将步骤(3)中获取的培养液，转接至含枯草芽孢杆菌的生测培养基平板中进行抑菌检测，36～38℃培养16h，选取抑菌圈直径大于15mm的单菌进行复筛。
根据本发明优选的，所述步骤(1)中链霉菌孢子为生长均匀、丰满的黑暗链霉菌的孢子。
根据本发明优选的，所述步骤(2)中，注射脉冲剂量为80×2.6×1014ions/(cm2·s)。
根据本发明优选的，所述步骤(2)中，紫外照射时间30s，照射距离30cm。
根据本发明优选的，所述步骤(2)中，培养条件为：36～38℃培养7天。
根据本发明优选的，所述步骤(2)中，平板培养基组分如下，均为质量百分比：
可溶性淀粉1.5～2.5％、牛肉膏0.05～0.15％、氯化钠0.03～0.07％、硫酸亚铁0.001％、硫酸镁0.03～0.07％、磷酸氢二钾0.03～0.07％、硝酸钾0.05～0.15％、琼脂1.5～2.0％，余量水，pH自然。上述培养基可采用常规配制方法，采用纯化水配制、121℃灭菌30min。
根据本发明优选的，所述步骤(3)中，所述孔板为24孔的孔板。
根据本发明优选的，所述步骤(3)中，孔板培养基组分如下，均为质量百分比：
豆饼粉2～6％、葡萄糖2～6％、蛋白胨0.5～1.5％、玉米粉0.5～1.5％、碳酸钙0.3～0.6％、氯化锰0.02～0.04％、氯化铵0.4～0.6％、硫酸锌0.002～0.005％、硫酸亚铁0.003～0.005％、硫酸镁0.2～0.05％、磷酸二氢钾0.003～0.005％、豆油0.8～1.20％，余量水，pH自然。上述培养基可采用常规配制方法，采用纯化水配制、121℃灭菌30min。
根据本发明优选的，所述步骤(4)中，枯草芽孢杆菌的质量含量为0.5％。
根据本发明优选的，所述步骤(4)中，所述抑菌检测采用牛津杯法，每个平板放6个牛津杯。
有益效果
1、本发明首次发现利用低能离子束诱变与紫外诱变复合进行诱变，二者顺序结合后可以显著提高正向诱变几率，能够更好地提高黑暗链霉菌的突变几率，具有操作简便，效率高、筛选效果好、可重复性高，解除了菌种对常规物理和化学诱变的疲劳效应；
2、本发明通过对黑暗链霉菌孢子悬液制备菌膜，能够更好更均匀的使孢子接触氮离子和紫外线的诱变，提高诱变几率；
3、本发明采用的24孔板，替代原来的摇瓶培养，极大地提高了菌落筛选数量，使用抑菌圈直径代替生物效价测定，使大量检测成为现实，大大提高了选种效率，利用本申请所述的方法，可以极大提高安普霉素选种效率，为筛选出高性能菌株奠定了基础。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明的技术方案做进一步的说明，但本发明所保护范围不限于此。实施例中所使用的设备均按照现有技术。
配制培养基：
培养基组分如下，均为质量百分比：
平板培养基：
可溶性淀粉1.5～2.5％、牛肉膏0.05～0.15％、氯化钠0.03～0.07％、硫酸亚铁0.001％、硫酸镁0.03～0.07％、磷酸氢二钾0.03～0.07％、硝酸钾0.05～0.15％、琼脂1.5～2.0％，余量水，pH自然。上述培养基可采用常规配制方法，采用纯化水配制、121℃灭菌30min。
斜面培养基配比：
可溶性淀粉1.5～2.5％、牛肉膏0.05～0.15％、氯化钠0.03～0.07％、硫酸亚铁0.001％、硫酸镁0.03～0.07％、磷酸氢二钾0.03～0.07％、硝酸钾0.05～0.15％、琼脂1.5～2.0％，余量水，pH自然。上述培养基可采用常规配制方法，采用纯化水配制、121℃灭菌30min。
孔板培养基：
豆饼粉2～6％、葡萄糖2～6％、蛋白胨0.5～1.5％、玉米粉0.5～1.5％、碳酸钙0.3～0.6％、氯化锰0.02～0.04％、氯化铵0.4～0.6％、硫酸锌0.002～0.005％、硫酸亚铁0.003～0.005％、硫酸镁0.2～0.05％、磷酸二氢钾0.003～0.005％、豆油0.8～1.20％，余量水，pH自然。上述培养基可采用常规配制方法，采用纯化水配制、121℃灭菌30min。
生物效价测定培养基：
蛋白胨0.5％，磷酸氢二钾0.3％，牛肉膏0.3％，琼脂1.5％，余量水，pH7.6～7.8。上述培养基可采用常规配制方法，采用纯化水配制、121℃灭菌30min。
菌种：黑暗链霉菌Ap15-101，购自沈阳药科大学。
生测菌种：枯草芽孢杆菌CMCC(B)63501，购自山东大学菌种保藏中心。
实施例1：
一种获取安普霉素高产菌株的高通量筛选方法，步骤如下：
孢子悬液制备：
取黑暗链霉菌Ap15-101生产斜面一支，在超净台下向斜面内加入100mL无菌水，将斜面孢子刮下，转入250mL灭过菌的三角瓶中，加入适量灭过菌的玻璃珠，放置于摇床上震荡30min，将孢子液打碎，使用含有灭菌滤纸的漏斗过滤，得黑暗链霉菌孢子悬液；
菌膜制备：
取0.5mL黑暗链霉菌孢子悬液涂布于空白平板内，使用无菌风吹干，制备多个黑暗链霉菌菌膜以备诱变使用。
诱变：
将黑暗链霉菌菌膜在70×2.6×1014ions/(cm2·s)的脉冲剂量下进行氮离子注入，注入完成后在15W紫外灯管、距离30cm情况下照射30s，照射完成后取2ml无菌水加至诱变后的菌膜上洗涤，取洗涤液0.1ml涂平板放置于温度36～38℃条件下培养7天，挑选单菌落239个，对照一个，接入含发酵培养基的24孔板中，共接10个孔板，同步传斜面，做好菌落编号。
初筛：
单菌落接入孔板后，在温度36～38℃的条件下培养144h，摇床转速220～240rpm，然后取200μl，加入含0.5％枯草芽孢杆菌的生测培养基平板的牛津杯中，每个平板放6个牛津杯，36～38℃培养16h，量取抑菌圈直径，根据直径大小，选取直径大于15mm的菌种，进行复筛。
初筛结果如表1所示：
表1初筛结果
菌种号 直径(mm) 提升率(％)
Ap15-101 14.75 0
Ap16-17 17.70 20.0
Ap16-29 18.25 23.7
Ap16-69 18.95 28.5
Ap16-77 19.25 30.5
Ap16-99 20.05 35.9
Ap16-134 19.75 33.9
Ap16-157 17.85 21.0
Ap16-177 18.15 23.1
Ap16-199 18.95 28.5
Ap16-211 19.00 28.8
Ap16-236 18.25 23.7
Ap16-269 18.55 25.8
初筛共计239个单菌落，提高幅度从高至低排序，选取12个明显高于对照的单菌落，具体结果如上表，进行复筛。
经统计，正向突变菌株46株，正向突变率为19.2％。
复筛：
分别从对应菌号的12支斜面上挖下0.5～1.0cm2的孢子接入发酵培养基中，在温度36～38℃的条件下培养144h，测定效价，挑选出1支效价明显提高的菌株，最高效价达到8500U/mL，较出发菌株6000U/mL，提升幅度达到41.7％，复筛结果如表2所示：
表2复筛结果
选取提升幅度最高的Ap16-99进行菌种保藏并进行稳定性考察。
连续传代：
将1支效价高的菌株用接种针传F1代，在相同培养条件下培养7天，挖块接种发酵瓶，相同条件下培养144h测定效价；重复上述操作分别验证F2、F3、F4、F5摇瓶能力,确认新选菌株摇瓶能力稳定，对新选菌株Ap16-99进行了菌种保藏。
稳定性考察：
将Ap16-99菌种进行斜面传代，得到的各子代斜面进行摇瓶发酵能力考察，经过5代考察，新筛选菌株遗传能力稳定,说明本方法筛选的菌株其有较好的遗传稳定性。
连续传代五次，验证发酵效价为：F1效价8390，F2效价8257，F3效价8669，F4效价8450，F5效价8299。
安普霉素效价测定方法：
安普霉素效价采用生物效价测定法。
标准曲线制作：称取安普霉素标准品适量于100ml容量瓶中，用无盐水定容，制成浓度为1000U/ml标准溶液，吸取1000U/ml的溶液2ml于100ml容量瓶中，加无菌水定容制成20U/ml的溶液。分别吸取20U/ml的溶液4.55、5.70、7.15、8.95、10.12、14.00、17.50、21.85ml于100ml容量瓶中，加磷酸盐缓冲液(pH7.8)定容制成0.91、1.14、1.43、1.79、2.24、2.80、3.50、4.37U/ml的溶液。在恒温室36～38℃培养17小时，量取抑菌圈直径，以直径为横坐标，以浓度为纵坐标，求斜率，作为发酵液生物效价测定时的参数，以浓度(C)对直径(A)进行线性回归，得回归方程为C＝KA+b，求出斜率K。
发酵液的测定：准确吸取合适体积安普霉素发酵液滤液于50ml容量瓶中，使用pH7.8的缓冲液定容，配制成2U/ml的样品溶液，吸取合适体积的上述标品溶液于50ml瓶中，使用pH7.8的缓冲液定容，制成2U/ml的标品溶液。
采用一剂量法测定效价：取制备好的双碟，每份供试品用1只双碟，在间隔的3个不锈钢小钢管中滴装供样品溶液，其余3个小钢管滴装标准品溶液，滴完后，盖好陶瓦盖，在恒温室36～38℃培养16～18小时。取出双碟，测量各个抑菌圈的直径。照生物检定统计法进行可靠性测验，并计算效价。
效价P(U/ml)＝P0×antlg[(T-S)/3×K]
式中：P0供试品估计效价；K为斜率
标准品所致抑菌圈直径之和S＝S1+S2+S3
供试品所致抑菌圈直径之和T＝T1+T2+T3
实施例2：
一种获取安普霉素高产菌株的高通量筛选方法，步骤如下：
(1)取黑暗链霉菌Ap15-101生产斜面一支，在超净台下向斜面内加入100mL无菌水，将斜面孢子刮下，转入250mL灭过菌的三角瓶中，加入适量灭过菌的玻璃珠，放置于摇床上震荡30min，将孢子液打碎，使用含有灭菌滤纸的漏斗过滤，得黑暗链霉菌孢子悬液；取0.5mL黑暗链霉菌孢子悬液涂布于空白平板内，使用无菌风吹干，制备黑暗链霉菌菌膜以备诱变使用；
(2)将黑暗链霉菌菌膜在80×2.6×1014ions/(cm2·s)的脉冲剂量下进行氮离子注入，注入完成后在15W紫外灯管、距离30cm情况下照射30s，照射完成后取2ml无菌水加入诱变后的菌膜上洗涤，取洗涤液0.1ml涂平板放置于温度36～38℃条件下培养8天，挑选单菌落239个，对照一个，接入含发酵培养基的24孔板中，共接10个孔板，同步传斜面，做好菌落编号。
其他步骤同实施例1。初筛结果如表3所示，239个单菌落中选取15个明显高于对照的单菌落。
表3初筛结果
菌种号 直径(mm) 提升率(％)
Ap15-101 15.00 0
Ap16-244 20.15 34.3
Ap16-266 19.95 33.0
Ap16-267 18.95 26.3
Ap16-300 19.25 28.3
Ap16-311 20.15 34.3
Ap16-316 20.25 35.0
Ap16-326 19.65 31.0
Ap16-344 20.20 34.7
Ap16-366 20.05 33.7
Ap16-369 21.25 41.7
Ap16-376 21.00 40.0
Ap16-406 21.35 42.3
Ap16-436 19.85 32.3
Ap16-469 19.55 30.3
Ap16-470 22.25 48.3
经统计，正向突变菌株40株，正向突变率为16.7。
将15支提高幅度高的单菌落斜面，接入发酵培养基，进行复筛，培养完成后测定效价，结果如下表：
表4复筛结果
由表4可以看出，Ap16-470效价幅度提升最明显，效价达到9400，提升幅度为52.5％，Ap16-470进行菌种保藏，并进行了稳定性考察。
稳定性考察：
将Ap16-470菌种进行斜面传代,得到的各子代斜面进行摇瓶发酵能力考察,经过5代考察,新筛选菌株遗传能力稳定,说明本方法筛选的菌株有较好的遗传稳定性。
连续传代五次，验证发酵效价为：F1效价9000U/ml，F2效价9250U/ml，F3效价9300U/ml，F4效价9450U/ml，F5效价9000U/ml。
实施例3：
一种获取安普霉素高产菌株的高通量筛选方法，步骤如下：
(1)取黑暗链霉菌Ap15-101生产斜面一支，在超净台下向斜面内加入100mL无菌水，将斜面孢子刮下，转入250mL灭过菌的三角瓶中，向里加入适量灭过菌的玻璃珠，放置于摇床上震荡30min，将孢子液打碎，使用含有灭菌滤纸的漏斗过滤，得黑暗链霉菌孢子悬液；取0.5mL黑暗链霉菌孢子悬液涂布于空白平板内，使用无菌风吹干，制备多个黑暗链霉菌菌膜以备诱变使用。
(2)将黑暗链霉菌菌膜在90×2.6×1014ions/(cm2·s)的脉冲剂量下进行氮离子注入，注入完成后在15W紫外灯管、距离28cm情况下照射28s，照射完成后取2ml无菌水加入诱变后的菌膜上洗涤，取洗涤液0.1ml涂平板放置于温度36～38℃条件下培养7天，挑选单菌落239个，对照一个，接入含发酵培养基的24孔板中，共接10个孔板，同步传斜面，做好菌落编号。
其他步骤同实施例1。初筛结果如表5所示，239个单菌落中选取10个明显高于对照的单菌落。
表5初筛结果
经统计，正向突变菌株43株，正向突变率为18.0％。
将10支较高的单菌落斜面，接入发酵培养基，培养完成后测定效价，结果如下表：
表6复筛结果
菌种号 效价(U/ml) 提升率(％)
Ap15-101 6100 0
Ap16-499 8650 41.8
Ap16-503 7779 27.5
Ap16-566 9266 51.9
Ap16-577 8742 43.3
Ap16-601 9000 47.5
Ap16-634 7890 29.3
Ap16-666 8650 41.8
Ap16-677 10000 63.9
Ap16-699 9760 60.0
Ap16-711 9926 41.8
由上表可以看出，Ap16-677提升最明显，效价达到10000U/ml，选取Ap16-677进行菌种保藏，并进行了稳定性考察。
稳定性考察：
将Ap16-677菌种进行斜面传代,得到的各子代斜面进行摇瓶发酵能力考察,经过5代考察,新筛选菌株遗传能力稳定,说明本方法筛选的菌株有较好的遗传稳定性。
连续传代五次，验证发酵效价为：F1效价9600U/ml，F2效价9926U/ml，F3效价9850U/ml，F4效价9000U/ml，F4效价9630U/ml。
对比例1：
一种选育方法，步骤如下：
(1)取黑暗链霉菌Ap15-101生产斜面一支，在超净台下向斜面内加入100mL无菌水，将斜面孢子刮下，转入250mL灭过菌的三角瓶中，向里加入适量灭过菌的玻璃珠，放置于摇床上震荡30min，将孢子液打碎，使用含有灭菌滤纸的漏斗过滤，得黑暗链霉菌孢子悬液；
(2)将步骤(1)制得的黑暗链霉菌孢子悬液，取10ml加入带转子的无菌培养皿内，放入紫外诱变箱，开启紫外灯，距离15cm，照射30s，照射液逐步稀释至10-6，取每个梯度
诱变稀释液0.1ml涂平板放置于温度36-38℃条件下培养8天，挑选单菌落239，对照一个，接入含发酵培养基的24孔板中，共接10个孔板，同步传斜面，做好菌落编号。
其他步骤同实施例1，初筛结果如下：
表7初筛结果
菌种号 直径(mm) 提升率(％)
Ap15-101 14.75 0
Ap16-729 17.00 15.3
Ap16-796 16.45 11.5
Ap16-801 15.55 5.4
Ap16-866 16.00 8.5
Ap16-879 16.15 9.5
Ap16-896 15.95 8.1
Ap16-906 15.85 7.5
Ap16-936 15.70 6.4
Ap16-940 15.15 2.7
Ap16-954 15.25 3.4
经统计，正向突变菌株26株，正向突变率为10.9％。
将10支效价较高的单菌落斜面，接入发酵培养基，进行复筛，培养完成后测定效价，结果如下表：
表8复筛结果
菌种号 效价(U/ml) 提升率(％)
Ap15-101 6250 0
Ap16-729 7000 12.0
Ap16-796 7250 16.0
Ap16-801 7100 13.6
Ap16-866 6950 11.2
Ap16-879 6956 11.3
Ap16-896 6329 1.3
Ap16-906 6435 3.0
Ap16-936 6508 4.1
Ap16-940 6469 3.5
Ap16-954 6649 6.4
由上表可以看出，Ap16-796效价幅度提升较明显，效价达到7250U/ml，提升幅度为16.0％，选取，Ap16-796进行菌种保藏，并进行了稳定性考察。
稳定性考察：
将Ap16-796菌种进行斜面传代,得到的各子代斜面进行摇瓶发酵能力考察,经过5代考察,新筛选菌株遗传能力稳定,说明本方法筛选的菌株有较好的遗传稳定性。
连续传代五次，验证发酵效价为：F1效价7000U/ml，F2效价7100U/ml，F3效价7300U/ml，F4效价7200U/ml，F5效价7300U/ml。
对比例2：
一种选育方法，步骤如下：
一种获取安普霉素高产菌株的高通量筛选方法，步骤如下：
(1)取黑暗链霉菌Ap15-101生产斜面一支，在超净台下向斜面内加入100mL无菌水，将斜面孢子刮下，转入250mL灭过菌的三角瓶中，向里加入适量灭过菌的玻璃珠，放置于摇床上震荡30min，将孢子液打碎，使用含有灭菌滤纸的漏斗过滤，得黑暗链霉菌孢子悬液；将黑暗链霉菌孢子悬液取0.5mL涂布在空白平板内，使用无菌风吹干，制备多个黑暗链霉菌菌膜以备诱变使用。
(2)将黑暗链霉菌菌膜在100×2.6×1014ions/(cm2·s)的脉冲剂量下进行氮离子注入，注入完成后在15W紫外灯管、距离30cm情况下照射30s,照射完成后取2ml无菌水加入诱变后的菌膜上洗涤，取洗涤液0.1ml涂平板放置于温度36-38℃条件下培养8天，挑选单菌落49个，对照一个，接入500ml发酵瓶中，摇瓶培养，同步传斜面，做好菌落编号。
其他步骤同实施例1。初筛结果如表9所示，49个单菌落中选取3个明显高于对照的单菌落。
其他步骤同实施例1。对比例2选取49个单菌落进行初筛，初筛结果如下：
表9初筛结果
经统计，正向突变菌株6株，正向突变率为12.2％。
将3支效价较高的单菌落斜面，接入发酵培养基，进行复筛，培养完成后测定效价，结果如下表：
表10复筛结果
由上表可以看出，Ap16-996效价幅度提升较明显，效价达到8100U/ml，提升幅度为33.6％，选取Ap16-996进行菌种保藏，并进行了稳定性考察。
稳定性考察：
将Ap16-996菌种进行斜面传代,得到的各子代斜面进行摇瓶发酵能力考察,经过5代考察，新筛选菌株遗传能力稳定，说明本方法筛选的菌株有较好的遗传稳定性。
连续传代五次，验证发酵效价为：F1效价8000U/ml，F2效价7965U/ml，F3效价8225U/ml，F4效价8742U/ml，F5效价8200U/ml。
对比例3
一种选育方法，步骤如下：
一种获取安普霉素高产菌株的高通量筛选方法，步骤如下：
(1)取黑暗链霉菌Ap15-101生产斜面一支，在超净台下向斜面内加入100mL无菌水，将斜面孢子刮下，转入250mL灭过菌的三角瓶中，向里加入适量灭过菌的玻璃珠，放置于摇床上震荡30min，将孢子液打碎，使用含有灭菌滤纸的漏斗过滤，得黑暗链霉菌孢子悬液；将黑暗链霉菌孢子悬液取0.5mL涂布在空白平板内，使用无菌风吹干，制备多个黑暗链霉菌菌膜以备诱变使用。
(2)将黑暗链霉菌菌膜在15W紫外灯管、距离30cm情况下照射30s,照射完成后在90×2.6×1014ions/(cm2·s)的脉冲剂量下进行氮离子注入，注入成后取2ml无菌水加入诱变后的菌膜上洗涤，取洗涤液0.1ml涂平板放置于温度36-38℃条件下培养8天，挑选单菌落239个，对照一个，接入含发酵培养基的24孔板中，共接10个孔板，同步传斜面，做好菌落编号。
其他步骤同实施例1。初筛结果如表11所示，239个单菌落中选取6个明显高于对照的单菌落。
其他步骤同实施例1。对比例3选取239个单菌落进行初筛，初筛结果如下：
表11初筛结果
经统计，正向突变菌株21株，正向突变率为8.79％。
将6支效价较高的单菌落斜面，接入发酵培养基，进行复筛，培养完成后测定效价，结果如下表：
表12复筛结果
由上表可以看出，Ap16-1154效价幅度提升较明显，效价达到7600U/ml，提升幅度为26.7％，选取Ap16-1154进行菌种保藏，并进行了稳定性考察。
稳定性考察：
将Ap16-1154菌种进行斜面传代,得到的各子代斜面进行摇瓶发酵能力考察,经过5代考察，新筛选菌株遗传能力稳定，说明本方法筛选的菌株有较好的遗传稳定性。
连续传代五次，验证发酵效价为：F1效价7800U/ml，F2效价7965U/ml，F3效价8000U/ml，F4效价8100U/ml，F5效价7900U/ml。
对比例4
一种选育方法，步骤如下：
一种获取安普霉素高产菌株的高通量筛选方法，步骤如下：
(1)取黑暗链霉菌Ap15-101生产斜面一支，在超净台下向斜面内加入100mL无菌水，将斜面孢子刮下，转入250mL灭过菌的三角瓶中，向里加入适量灭过菌的玻璃珠，放置于摇床上震荡30min，将孢子液打碎，使用含有灭菌滤纸的漏斗过滤，得黑暗链霉菌孢子悬液；将黑暗链霉菌孢子悬液取0.4mL涂布在空白平板内，并加入0.1ml的0.5％氯化锂溶液，混匀，使用无菌风吹干，制备多个黑暗链霉菌菌膜以备诱变使用。
(2)将黑暗链霉菌菌膜在90×2.6×1014ions/(cm2·s)的脉冲剂量下进行氮离子注入，注入成后取2ml无菌水加入诱变后的菌膜上洗涤，取洗涤液0.1ml涂平板放置于温度36-38℃条件下培养8天，挑选单菌落239个，对照一个，接入含发酵培养基的24孔板中，共接10个孔板，同步传斜面，做好菌落编号。
其他步骤同实施例1。初筛结果如表12所示，239个单菌落中选取5个明显高于对照的单菌落。
其他步骤同实施例1。对比例4选取239个单菌落进行初筛，初筛结果如下：
表13初筛结果
经统计，正向突变菌株19株，正向突变率为7.95％。
将5支效价较高的单菌落斜面，接入发酵培养基，进行复筛，培养完成后测定效价，结果如下表：
表14复筛结果
由上表可以看出，Ap16-1319效价幅度提升较明显，效价达到7995U/ml，提升幅度为33.3％，选取Ap16-1319进行菌种保藏，并进行了稳定性考察。
稳定性考察：
将Ap16-1319菌种进行斜面传代,得到的各子代斜面进行摇瓶发酵能力考察,经过5代考察，新筛选菌株遗传能力稳定，说明本方法筛选的菌株有较好的遗传稳定性。
连续传代五次，验证发酵效价为：F1效价8000U/ml，F2效价7965U/ml，F3效价8100U/ml，F4效价8000U/ml，F5效价8200U/ml。
结果分析
由上述实施例1～3和对比例1和对比例4的数据可以看出，低能离子束和紫外复合诱变黑暗链霉菌，显著提高正突变率，且遗传性能稳定；由实施例1～3和对比例2的数据可以看出，当脉冲剂量超过本发明所保护的范围后，正突变率会显著下降；由实施例1～3和对比例2的数据可以看出，低能离子束和紫外复合诱变二者的顺序也会对正突变率产生显著的影响。

Claims (10)

1.一种获取安普霉素高产菌株的高通量筛选方法，其特征在于，步骤如下：
(1)取黑暗链霉菌孢子至无菌水中，混合均匀，制得活跃链霉菌孢子悬液；
(2)将步骤(1)制得的黑暗链霉菌孢子悬液转接至灭菌后的培养皿中，无菌风吹干，制得菌膜，然后进行低能离子束的注射诱变，靶室真空度为6.0～8.0×10-3Pa，注射脉冲剂量设定为70～90×2.6×1014ions/(cm2·s)，注射完成后，再进行紫外照射28～32s，紫外灯管功率为15W，照射距离28～32cm，然后使用无菌水洗涤后涂布平板培养基，36～38℃培养7～8天，制得单菌落；
(3)将步骤(2)中制得的单菌落，接入孔板内的孔板培养基中，在36～38℃震荡培养5～6天，制得培养液；
(4)将步骤(3)中获取的培养液，转接至含枯草芽孢杆菌的生测培养基平板中进行抑菌检测，36～38℃培养16h，选取抑菌圈直径大于15mm的单菌进行复筛。
2.如权利要求1所述的高通量筛选方法，其特征在于，所述步骤(1)中链霉菌孢子为生长均匀、丰满的黑暗链霉菌的孢子。
3.如权利要求1所述的高通量筛选方法，其特征在于，所述步骤(2)中，注射脉冲剂量为80×2.6×1014ions/(cm2·s)。
4.如权利要求1所述的高通量筛选方法，其特征在于，所述步骤(2)中，紫外照射时间30s，照射距离30cm。
5.如权利要求1所述的高通量筛选方法，其特征在于，所述步骤(2)中，培养条件为：36～38℃培养7天。
6.如权利要求1所述的高通量筛选方法，其特征在于，所述步骤(2)中，平板培养基组分如下，均为质量百分比：
可溶性淀粉1.5～2.5％、牛肉膏0.05～0.15％、氯化钠0.03～0.07％、硫酸亚铁0.001％、硫酸镁0.03～0.07％、磷酸氢二钾0.03～0.07％、硝酸钾0.05～0.15％、琼脂1.5～2.0％，余量水，pH自然。
7.如权利要求1所述的高通量筛选方法，其特征在于，所述步骤(3)中，所述孔板为24孔的孔板。
8.如权利要求1所述的高通量筛选方法，其特征在于，所述步骤(3)中，孔板培养基组分如下，均为质量百分比：
豆饼粉2～6％、葡萄糖2～6％、蛋白胨0.5～1.5％、玉米粉0.5～1.5％、碳酸钙0.3～0.6％、氯化锰0.02～0.04％、氯化铵0.4～0.6％、硫酸锌0.002～0.005％、硫酸亚铁0.003～0.005％、硫酸镁0.2～0.05％、磷酸二氢钾0.003～0.005％、豆油0.8～1.20％，余量水，pH自然。
9.如权利要求1所述的高通量筛选方法，其特征在于，所述步骤(4)中，枯草芽孢杆菌的质量含量为0.5％。
10.如权利要求1所述的高通量筛选方法，其特征在于，所述步骤(4)中，所述抑菌检测采用牛津杯法，每个平板放6个牛津杯。
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