BG61310B1 - щам sтrертомyсеs теnевrаrius,продуцент на тобрамицин - Google Patents

Abstract

1. Щам Streptomyces tenebrarius, продуцент на тобрамицин, регистриран в НБПМКК под № 2342.

Description

ОБЛАСТ HA ТЕХНИКАТА

Изобретението се отнася до щам Streptomyces tenebrarius, продуцент на тобрамицин, приложим във фармацевтичната промишленост.

ПРЕДШЕСТВАЩО СЪСТОЯНИЕ НА ТЕХНИКАТА

Известно е, че щам S.tenebrarius продуцира небрамицинов антибиотичен комплекс, който се състои от 11 аминоциклитолни компонента с известна химична структура. Три от тях се синтезират в значително по-големи количества - фактор 2(апрамицин); фактор 4 (карбамоилканамицин В) и фактор 5' (карбамоилтобрамицин), а останалите са минори (J. Antibiot. 26 (12), 1973,745-751; Antibiot. Agents Chemother.,1970,309-313;J. Org.Chem., 1976,41, 2087-2092).

Фактор 2 (апрамицин) намира приложение във ветеринарната медицина. Фактор 4 се превръща във фактор 5 (канамицин В) чрез алкална хидролиза след отстраняване на карбамоилната група. Фактор 5' се превръща във фактор 6 (тобрамицин) при същите условия и намира приложение в хуманната медицина за третиране на инфекции, причинени от грамположителни и грамотрицателни микроорганизми и по-специално от Pseudomonas, Proteus и др. (Antimicrob.Agents Chemother.,1970,309313;J.Inf.Diseases, 1976,134,Suppl.s3-s 19).

Известни са щамове, продуциращи различни компоненти или съотношение на компоненти в небрамициновия комплекс, в това число и такива, продуциращи предимно фактор 5' (American Inst.of Biol. Science. Washington, 1976,61-77; Антибиотики, 1980,25 (12) 891894).

Известно е също, че при дълбочинни условия щам S.tenebrarius 1575 продуцира апра мицин, карбамоилканамицин В и карбамоилтобрамицин в съотношение 4:2:1, т.е. продукцията на карбамоилтобрамицина е 1/7 част от общото количество синтезиран продукт /BG 47276А/.

Известно е, че щам S.tenebrarius 5519 в условията на дълбочинна ферментация продуцира антибиотиците апрамицин, карбамоилканамицин В и карбамоилтобрамицин в съотношение 0,5:0,1:1,3 /BG 47276А/.

Недостатъци на посочените щамове са преобладаващата продукция на факторите 2 и 4 в културалната течност, което ги прави слабо ефективни за промишлено производство, поради ниската концентрация на целевия продукт - фактор 5', и води до значителни разходи при получаването му.

СЪЩНОСТ НА ИЗОБРЕТЕНИЕТО

Съгласно изобретението се получава щам Streptomyces tenebrarius, който продуцира преимуществено карбамоилтобрамицин /фактор 5'/ при намалена продукция на апрамицин и карбамоилканамицин В /фактори 2 и 4/.

Щамът е регистриран в НБПМКК под № 2342 и се получава чрез мутагенеза и селекция на изходен щам S.tenebrarius, регистриран в НБПМ КК под № 1022 и произхождащ от родителя S.tenebrarius 1575.

Селекцията на щам S.tenebrarius включва протопластиране и регенерация, третиране на получените колонии с ултравиолетова светлина с дължина на вълната 253,7 пш при преживяемост 0,01 - 1 % и последващ естествен отбор.

За характеризиране на щамовете и получения мутант S.tenebrarius са използвани методите на International Streptomyces Project (Ind. J.Syst.bacteriol, 1966,16/3/,313-340).

Цветът на въздушния (ВМ) и субстратния (СМ) мицели, както и пигментацията в средата се отчитат по скалата на Бондарцев, (Бондарцев А.С.,Шкала цветов, Изд.АН СССР, 1954, с.27).

Таблица 1

Сравнителна характеристика на родителския, изходния щам и получения от него мутант.

Среда	Родителски щам S.tenebrarius 1575	Изходен щам S.tenebrarius № 1022, НБПМКК	Получен мутант S.tenebrarius № 2342, НБПМКК
1	2	3	4
ISP-2 дрождево малцов агар	ВМ-тебеширенобял /дЗ/;СМ-розово теракотов до бледориж /в5-ж2/. Обилен ръст и спорулация. Образува розоволилав разтворим в средата пигмент /жЗ/	ВМ-тебеширенобял /дЗ/;СМ-тьмнокремав/об/. Колонии с неспорулирал център. Не образува разтворим в средата пигмент.	ВМ-тебеширенобял /дЗ/;СМ-тьмнокремав/об/. Обилен ръст и спорулация. Не образува разтворим в средата пигмент.
ISP-3 овесен агар	ВМ-тебеширенобял до шамуа/дЗ-г5/;СМ безцветен до кремав /66/. Образува слаборазтворим в средата пигмент /жЗ/.	ВМ-тебеширенобял /дЗ/;СМ-безцветен Добър ръст. Не образува разтворим в средата пигмент.	ВМ-тебеширенобял до тъмнокремав / дЗ-об/;СМ-безцветен. Не образува разтворим в средата пигмент.
ISP-4 нишестено солев агар	ВМ-шамуа/г5/;СМкремав/бб/. Добър ръст, обилна спорулация. Не образува разтворим в средата пигмент.	ВМ-тебеширенобял /дЗ /; СМ -жълто-кафяв /д4/. Добър ръст спорул. по края на колониите. Не образува разтворим в средата пигмент.	ВМ-тебеширенобял до кремав/дЗ-бб/ СМ-кремав до жълто-кафяв/б6-д4/. Добър ръст, обилна спорулация. Не образува разтворим рим в средата пигмент.
ISP-5 глицериново аспаргинов агар	ВМ-тебеширенобял / дЗ/; СМ-кайсиевожълт до тъмнокафяв/д2-в6/. Добър ръст. Образува розово-лилав разтворим в средата пигмент/жЗ/.	ВМ-тебеширенобял /дЗ/;СМ-тъмно-кафяв до шамуа/в6-г5/. Мн.добър ръст. Не образува разтворим в средата пигмент.	ВМ-тебеширенобял /дЗ/ ;СМ-тъмно-кафяв до шамуа/в6-г5/. Добър ръст. Не образува разтворим в средата пигмент.
ISP-7 тирозинов агар	ВМ-тебеширенобял / дЗ/ ;СМ-розово-лилав/жЗ/. Много добър ръст. Образува розово-лилав разтворим в средата пигмент/жЗ/	ВМ-бледоват/д1/ СМ-бледокафяв/в7дЗ/. Много добър ръст. Не образува разтворим в средата пигмент.	ВМ-тебеширенобял до кремав/дЗ-бб/; СМ-тъмнокафяв до шамуа/в6-г5/. Добър ръст. Не образува пигмент в средата.

мине-	Колонии с диаметър	Колонии с диаметър	Колонии с диаме-
рална	5-8 mm с изпъкнал	2-4 mm, плоски с	тър 4-6 mm с
среда	център, радиални с	точковиден неспо-	вдлъбнат център
Гаузе	обилна спорулация.	рулиращ център,	и обилна спору-
1	Образува разтворим	вдлъбнат. Не обра-	лация. Не обра-
	в агара розово-ли-	зува в агара раз-	зува в агара
	лав пигмент.	творим пигмент.	разтворим пигмент

Броят на спорите в спороносните хифи е над 10. Спороносните хифи представляват спирали с множество витки. 15

По отношение усвояването на моноза хари не се наблюдава различие в усвояването им при трите щама. Разлики съществуват по отношение на резистентността им спрямо различни антибиотици.

Таблица 2

Сравнителна резистентност на изходните щамове Streptomyces tenebrarius и получения мутант спрямо различни антибиотици.

Щам	К	Ам	Км	Тм	См	Гм	Пен	Цеф	Хлф	Риф	Тц
1575	+	+	+	+	+	+	+	+	+		+
№ 1022
НБПМКК	+	+	+	+	+	+	+	+	-	-	-
№ 2342
НБПМКК	+	+	+	+	+	+	+	+	+	-	+

К-контрола; Ам-апрамицин; Км-канамицин; Тм-тобрамицин; См-стрептомицин; Гмгентамицин; Пен-пеницилин; Цеф-цефалоспорин; Хлф-хлорамфеникол; Риф-рифамицин; Тцтетрациклин; “+”-устойчив; “-’’-резистентен.

Изследванията са направени върху агарова среда Гаузе 1, като антибиотиците са добавени към средата при температура под 50°С.

Същественото в случая е, че полученият мутант Streptomyces tenebrarius № 2342 НБП МКК е резистентен спрямо основните компоненти на небрамициновия комплекс в много повисока степен, отколкото щамове S.tenebrarius 1575 и S.tenebrarius № 1022 НБПМКК.

По отношение на pH, температура и други изисквания щамовете не показват съществени различия.

Ферментацията се провежда двустъпално при използване на следните хранителни среди.

Инокулационна среда в %: глицерин 2, царевичен екстракт 2, амониев хлорид 0,2, натриев хлорид 0,3, калциев карбонат 0,5, чешмяна вода, pH 7,0.

Ферментационна среда в %: соев шрот 3, амониев хлорид 0,6, магнезиев сулфат 1,1, калциев карбонат 0,8, глюкоза 3, соево масло 0,6, чешмяна вода, pH 7,0.

Таблица 3

Продуктивност на щамове Streptomyces tenebrarius.

Щам	Съотношение на продуцираните фактори 2:4:5'
S.tenebrarius 1575	4:2:1
S.tenebrarius
№ 1022 НБПМКК	0,5 : 0,1 : 1,3
S.tenebrarius
№ 2342 НБПМКК	2:1:6

Предимствата на щама съгласно изобретението се изразяват в измененото съотношение на продукцията на основните фактори в небрамициновия комплекс - нарастване образуването на карбамоилтобрамицин /фактор 57 в средата при намалена продукция на апрамицин и карбамоилканамицин В /фактори 2 и 4/.

ПРИМЕРИ ЗА ИЗПЪЛНЕНИЕ НА ИЗОБРЕТЕНИЕТО

Изобретението се изяснява със следните примери.

Пример 1. Щамът, монопродуцент на тобрамицин, се получава, като щам Streptomyces tenebrarius № 1022, НБПМКК се протопластира по метод на Ferenzy /US 4729951/. Използва се вегетативна култура с оптична плътност при 600 nm 0,4 - 0,8, от транзитната фаза на развитие, култивирана трикратно върху среда съдържаща глицин 4 - 6 %.

Мицелът се центрофугира и промива, след което се обработва с лизоцим 0,5 % за 1 h при 37°С. Получените протопласти се промиват и се разсяват върху регенерационна среда. Израстналите колонии се препасажират на среда Гаузе 1 и се проверяват за продуктивност. Получените колонии от хетерокариозисен тип се обработват с ултравиолетова светлина с дължина на вълната 253,7 nm при преживяемост 0,01 - 0,1 % на обработваната суспензия. На обработка се подлага водна спорова суспензия с гъстота 1 - 1,5.10’. 2 ml суспензия се поставят в стъклено петри с диаметър 50 mm при постоянно бъркане, на разстояние 20 cm от източника за 30 - до 60 sek. След облъчването се правят серийни разреждания и разсев върху агарова среда Гаузе 1. Колониите се препасажират на епруветки и се изпитват за продуктивност чрез ферментация, както е описано в пример 2.

Пример 2. Към 50 ml инокулационна среда, в колби от 250 ml се поставя късче агар с повърхност около 1 cm от добре спорулирала култура и се култивира на тъмно при 37°С 18 h на ротативна клатачка. След това към 80 ml ферментационна среда се прехвърлят 10 об. % от развития инокулум и ферментацията продължава при същите условия 120 Ь. След отстраняване на мицела 10 μΐ филтрат се закапват на плака Merk 5553 за тънкослойна хроматография, която се развива в система етилметил кетон:етанол:амоняк в съотношение 1:1:1. След изсушаване на плаката, съдържаща пробите и съответните стандарти в подходящи концентрации, последната се биоавтографира върху повърхността на агарова среда, съдържаща в %: пептон 0,1, дрождев екстракт 0,3, натриев фосфат 0,2 и arap 2, с pH 7,8 8,0, заразена с 1 % от стандартизирана суспензия на тестмикроба Bacillus subtilis ATCC 6633, при 530 nm за пропускливост 20 %. Хроматографските плаки се налагат върху агаровата повърхност за 30 min и термостатират за 16 до 18 h при 37°С. След оцветяване с разтвор на метиленово синьо се снемат отпечатъци. Спрямо съответни стандарти на апрамицин, канамицин и тобрамицин се установява съотношението на факторите 2:4:5’, което е 2:1:6.

Прецизен анализ на продуктивността се прави чрез високоефективна течностна хроматография (Abstract of VII-th Nat.Conf.on Antibiotics, Razgrad, 1988,7).

Пример 3. От добре спорулирала епруветка на получения монопродуцент S.tenebrarius № 2342, НБПМКК, върху среда Гаузе 1 се посява еднолитрова Ерленмайлерова колба с 200 ml инокулационна среда със следния състав в %: царевичен екстракт 2, амониев хлорид 0,2, натриев хлорид 0,3, глицерин 2, калциев карбонат 0,5 и чешмяна вода, с pH 7,0, стерилизирана 30 min при 120°С. Културата се инкубира при 37°С на ротационна клатачка 18 до 20 h. Този инокулум се използва за посев на 50 1 ферментатор, зареден със същата среда. Култивирането се извършва при 37°С, 100 об. на бъркалката, приток на въздух

1:1, налягане 0,5 at за около 20 h. 10 % об. от така развития посевен материал се подават към 50 1 фсрмснтатор, съдържащ среда със следния състав в %: соев шрот 3, амониев хлорид 0,6, магнезиев сулфат 1,1, калциев карбонат 0,8, 5 глюкоза 3, соево масло 0,6 и чешмяна вода, и pH 7,0. Ферментационният процес се провежда при температура 37°С; 100 об. на бъркалката, въздух 1:1 и налягане 0,5 at за около 120 h.

Антибиотичното съдържание в културалната течност се определя чрез тънкослойна хроматография с последваща биоавтография с тестмикроба B.subtilis АТСС 6633, описана в пример 2.

Съотношението на компонентите в културалната течност е следното: фактор 2: фактор 4: фактор 5' = 2:1:6.

Получената активност на културална течност по отношение на фактор 5' е 3000 U/ ml, определена по метода на ВЕТХ (Abstract of VII-th Nat.Conf.on Antibiotics Razgrad,988,7).

Claims (1)

1. Патентни претенции

   1. Щам Streptomyces tenebrarius - продуцент на тобрамицин, регистриран в НБПМКК под № 2342.