CN105063011A

CN105063011A - 一种提高产那西肽的活跃链霉菌突变几率的诱变方法

Info

Publication number: CN105063011A
Application number: CN201510524748.6A
Authority: CN
Inventors: 王海波; 王洛菊; 高来平; 肖菊; 刘军
Original assignee: SHANDONG QILU KING-PHAR PHARMACEUTICAL Co Ltd
Current assignee: SHANDONG QILU KING-PHAR PHARMACEUTICAL Co Ltd
Priority date: 2015-08-24
Filing date: 2015-08-24
Publication date: 2015-11-18

Abstract

本发明涉及一种提高产那西肽的活跃链霉菌突变几率的诱变方法，步骤如下：(1)取活跃链霉菌孢子至无菌水中，混合均匀，制得活跃链霉菌单孢子悬液；(2)将活跃链霉菌单孢子悬液稀释后涂布至含筛选因子的平板培养基上，进行低能离子束的梯度剂量的注射诱变，然后进行后续筛选培养。本发明所述提高活跃链霉菌突变几率的诱变方法，采用低能离子束进行诱变，同时辅助用以那西肽和卡那霉素的抗性筛选，操作简便，效率高、筛选效果好，解除了菌种对常规物理和化学诱变的疲劳效应。

Description

一种提高产那西肽的活跃链霉菌突变几率的诱变方法

技术领域

本发明涉及一种提高产那西肽的活跃链霉菌突变几率的诱变方法，特别涉及利用低能离子束提高活跃链霉菌突变几率的诱变方法，属于物理诱变技术领域。

背景技术

那西肽(Nosiheptide)含丰富的硫元素，属多肽类抗生素，主要由活跃链霉菌产生；对革兰氏阳性菌有良好的抑制作用，通过与23SRNA和核糖体蛋白L11组成的复合体紧密结合，从而抑制延长因子活性和GTP的水解，最终抑制了蛋白质的合成，使细菌的生长受到抑制。那西肽由于其在肠道中溶解度低，不容易被动物吸收，因而可以在肠道内保持较高的药物浓度，它具有用量低、抑菌范围广、动物体内不残留等特点，可明显促进鸡、猪、鱼等动物的生长，因此是一种理想的新型非吸收性动物饲料添加剂。

目前，许多国家和地区都在使用那西肽。国内的多家企业和科研院所对那西肽的菌种选育及发酵工艺优化方面做了大量工作，但发酵水平较低，作为水平提高关键因素的菌种仍有很大的提升空间。

近年来离子束生物技术在微生物诱变育种的应用越来越广泛，低能离子注入作为一种新的诱变源成果是非常显著的，低能离子是指能量在10⁴KeV-10⁵KeV之间的离子，它是相对于传统辐射生物学中10⁶KeV-10⁹KeV而言的，能够引起靶物质原子移位和重排，使细胞表面产生刻蚀和穿孔，并能影响和改变细胞电性等现象，从而使菌体产生突变。

利用低能离子注入技术诱变时的主要技术难点是低能离子的能量低，理论射程很短，活跃链霉菌未经受过低能离子处理，低能离子对活跃链霉菌作用效果受哪些因素影响，目前并未研究清楚。

发明内容

本发明针对现有技术的不足，提供一种提高活跃链霉菌突变几率的诱变方法，该方法可以有效提高活跃链霉菌诱变几率低的问题，为后续筛选高产那西肽的突变活跃链霉菌提供技术支持。

本发明的技术方案如下：

一种提高活跃链霉菌突变几率的诱变方法，步骤如下：

(1)取活跃链霉菌孢子至无菌水中，混合均匀，制得活跃链霉菌单孢子悬液；

(2)将步骤(1)制得的活跃链霉菌单孢子悬液稀释至10～20cfu/mL，然后涂布至含筛选因子的平板培养基上，进行低能离子束的梯度剂量的注射诱变，靶室真空度为6.0～8.0×10^-3Pa，注射脉冲剂量设定为80～100×2.6×10¹³ions/(cm²·s)，注射完成后，进行后续筛选培养。

根据本发明优选的，所述步骤(1)中链霉菌孢子为生长均匀、丰满的活跃链霉菌的孢子。

根据本发明优选的，所述步骤(2)中，筛选因子选自那西肽、卡那霉素。

根据本发明优选的，所述步骤(2)中，筛选培养条件为：28～30℃、湿度20～60％的条件下，培养7～8天。

根据本发明优选的，所述步骤(2)中，所述筛选因子的质量百分比浓度为0.005～0.02％。

根据本发明优选的，所述步骤(2)中，含筛选因子的平板培养基组分如下，均为质量百分比：

可溶性淀粉1.5～2.5％、蛋白胨0.4～0.8％、磷酸二氢钾0.04～0.06％、硫酸亚铁0.001％、硝酸钾0.08～0.12％、硫酸镁0.04～0.06％、氯化钠0.04～0.06％、筛选因子0.005～0.02％、轻质碳酸钙0.4～0.6％、琼脂1.5～2.0％，余量水，pH6.5～7.0。上述培养基可采用常规配制方法，采用纯化水配制、121℃灭菌30min。

有益效果

1、本发明采用低能离子束作为诱变方式，具有损伤轻、突变率高、突变普广的特点，其与传统的物理化学诱变作用机理不同，低能离子束通过引起氨基酸和小分子无机化合物的损伤导致电荷和基团变化等引起突变；同时发明人通过对活跃链霉菌研究，发现提高诱变的条件，能够大大提高活跃链霉菌的突变效果。

2、本发明所述提高活跃链霉菌突变几率的诱变方法，采用低能离子束进行诱变，同时辅助用以那西肽和卡那霉素的抗性筛选，操作简便，效率高、筛选效果好，解除了菌种对常规物理和化学诱变的疲劳效应。

3、本发明通过对活跃链霉菌孢子悬液稀释后涂布含0.01％筛选因子的平板培养基，再进行低能离子束脉冲注入，通过计算致死率确定最佳注入剂量，确定最佳注射剂量后对活跃链霉菌孢子悬液进行了诱变，初筛、复筛和连续传代试验，利用本申请所述的方法，可以极大提高活跃链霉菌的突变几率，为筛选出高性能菌株奠定了基础。

附图说明

图1是实施例1的活跃链霉菌低能离子束的梯度剂量的注射诱变致死率曲线；

图2是对比例3的活跃链霉菌紫外线诱变致死率曲线；

具体实施方式

下面结合实施例对本发明的技术方案做进一步的说明，但本发明所保护范围不限于此。实施例中所使用的设备均按照现有技术。

配制培养基：

培养基组分如下，均为质量百分比：

平板培养基：可溶性淀粉1.5～2.5％、蛋白胨0.4～0.8％、磷酸二氢钾0.04～0.06％、硫酸亚铁0.001％、硝酸钾0.08～0.12％、硫酸镁0.04～0.06％、氯化钠0.04～0.06％、轻质碳酸钙0.4～0.6％、琼脂1.5～2.0％，pH6.5～7.0。上述培养基可采用常规配制方法，采用纯化水配制、121℃灭菌30min。

斜面培养基配比：可溶性淀粉1.5～2.5％、蛋白胨0.4～0.8％、磷酸二氢钾0.04～0.06％、硫酸亚铁0.001％、硝酸钾0.08～0.12％、硫酸镁0.04～0.06％、氯化钠0.04～0.06％、轻质碳酸钙0.4～0.6％、琼脂1.5～2.0％，pH6.5～7.0。上述培养基可采用常规配制方法，采用纯化水配制、121℃灭菌30min。

种子培养基配比：蔗糖1.5～2.0％、蛋白胨0.8～1.2％、硫酸铵0.1～0.3％、轻质碳酸钙0.3～0.5％，纯化水配制、pH6.5～7.0、121℃灭菌30min。

发酵培养基配比：热榨豆饼粉3.0～3.5％、玉米淀粉6.0～8.0％、硫酸钠0.1～0.3％、磷酸二氢钾0.01～0.03％、硫酸铵0.1～0.3％、轻质碳酸钙0.2～0.3％、豆油0.5～0.7％，自来水配制、pH自然、121℃灭菌30min。

菌种：活跃链霉菌NX-9，购自中科院微生物所；那西肽纯品购自中国兽药监察所，卡那霉素纯品购自中国药品生物制品鉴定所。

实施例1：

孢子悬液制备：

取活跃链霉菌NX-9生产斜面一支，在超净台下向斜面内加入100mL无菌水，将斜面孢子刮下，转入250mL灭过菌的三角瓶中，向里加入适量灭过菌的玻璃珠，放置于摇床上震荡30min，将孢子液打碎，使用含有灭菌滤纸的漏斗过滤，得活跃链霉菌单孢子悬液；

稀释：

将活跃链霉菌单孢子悬液依次稀释为10⁰、10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5、10^-6、10^-7，分别取0.1mL涂布平板培养基，放置在温度28～30℃、湿度20-60％的条件下培养7～8天，计算平板内的菌落数，平板内菌落数100～200个为宜，梯度10^-3和10^-4符合标准；

诱变剂量的确定：

将活跃链霉菌孢子悬液稀释至10^-3，分别取孢子悬液0.1mL涂布在含有质量百分比为0.01％那西肽的平板培养基上，进行低能离子束的梯度剂量的注射诱变，靶室真空度为8.0×10^-3Pa，注射脉冲剂量设定为n×2.6×10¹³ions/(cm²·s)，n＝(30,50,70,90,110,130)，选取六个梯度进行注射，注射完成后，平板放置于温度28～30℃、湿度20～60％的条件下培养7～8天，通过计算平板菌落数，在90×2.6×10¹³ions/(cm2·s)的剂量下致死率达到90％，结果如图1所示。

诱变：

将活跃链霉菌孢子悬液稀释至10^-3，取孢子悬液0.1mL涂布在含有质量百分比为0.01％那西肽的平板培养基上，在90×2.6×10¹³ions/(cm²·s)的脉冲剂量下进行照射，照射完成后平板放置于温度28～30℃、湿度20～60％的条件下培养7～8天，挑选单菌落60个，接入500ml发酵瓶，同步传斜面，做好菌落编号。

初筛：

单菌落接入发酵瓶后，在温度28～30℃、湿度20～60％的条件下培养210～240h，摇床转速220～240rpm，然后测定效价，效价提高幅度明显的单菌落有9个；单菌落传斜面后在温度28～30℃、湿度20～60％的条件下培养7～8天，以效价高的9个单菌落的斜面作为复筛的出发菌株，进行复筛。初筛结果如表1所示：

表1初筛结果

菌种号	初筛效价(U/ml)	提升率(％)
			NX-9	2850	0
NX9-4	3475	21.9
			NX9-7	3775	32.5
NX9-11	4100	43.9
			NX9-16	3950	38.6
NX9-17	4025	41.2
			NX9-39	3385	18.8
NX9-41	3500	22.8
			NX9-49	3835	34.6
NX9-51	3690	29.5

初筛共计60个单菌落，明显高于对照的单菌落有9个，具体结果如上表。

复筛：

分别从9支斜面上挖下0.5～1.0cm²的孢子接入种子培养基，在温度28～30℃、湿度20～60％的条件下培养28～34h，按发酵瓶体积8％的接种量接入发酵瓶，在温度28～30℃、湿度20～60％的条件下培养210～240h，测定效价，挑选出1支效价明显高的菌株，最高效价达到4160U/mL，较出发菌株2900U/mL，提升幅度达到43.4％，复筛结果如表2所示：

表2复筛结果

菌种号	复筛效价(U/ml)	提升率(％)
			NX-9	2900	0
NX9-4	3125	7.8
			NX9-7	3649	25.8
NX9-11	4160	43.4
			NX9-16	3865	33.3
NX9-17	3950	36.2
			NX9-39	3500	20.7
NX9-41	3700	27.6
			NX9-49	3275	12.9
NX9-51	3543	22.2

以效价高的9个单菌落的斜面作为复筛的出发菌株，进行复筛，结果如上表，选取提升幅度最高的NX9-11进行菌种保藏并进行稳定性考察。

连续传代：

将1支效价高的菌株用接种针传F1代，在相同培养条件下培养7～8天，挖块接种发酵瓶，相同条件下培养210～240h测定效价；重复上述操作分别验证F2、F3、F4、F5摇瓶能力,确认新选菌株摇瓶能力稳定，对新选菌株NX9-11进行了菌种保藏。

菌种诱变过程中，在致死率达到90％左右时，相对菌株正突变率较高，即得到效价提高的突变株较多。

稳定性考察：

将NX9-11菌种进行斜面传代，得到的各子代斜面进行摇瓶发酵能力考察，经过5代考察，新筛选菌株遗传能力稳定,说明本方法筛选的菌株其有较好的遗传稳定性。

连续传代五次，验证发酵效价为：F1效价4100，F2效价3950，F3效价4100，F4效价4167，F5效价4000。

那西肽效价测定方法：

那西肽效价采用分光光度法。

标准曲线制作：称取标准品适量于100ml容量瓶中，用二甲酰胺溶解定容，浓度为5000U/ml，分别称取标准液适量于50ml容量瓶中，使用无水乙醇配制成50U/ml、100U/ml、200U/ml、300U/ml、400U/ml、500U/ml、600U/ml的供试液，以无水乙醇为空白，于410nm波长处测定吸收度，以浓度(C)对吸收度(A)进行线性回归，得回归方程为C＝KA+b。求出斜率K。

发酵液的测定：准确称取那西肽发酵液2.5g于25ml具塞试管中，准确量取无水乙醇5ml加入具塞试管中，放置37℃水浴中保温30min使其被充分提取，过滤后取滤液1mL加入10ml硼酸溶液和8ml正丁醇溶液，37℃水浴静止20min。取4mL上清液于25ml具塞试管中加乙醇4ml摇匀，倒入比色皿中以无水乙醇为空白，用分光光度计在408nm处比色，测定OD值。

实施例2：

一种提高活跃链霉菌突变几率的诱变方法，步骤如下：

(1)取活跃链霉菌NX-9生产斜面一支，在超净台下向斜面内加入100mL无菌水，将斜面孢子刮下，转入250mL灭过菌的三角瓶中，向里加入适量灭过菌的玻璃珠，放置于摇床上震荡30min，将孢子液打碎，使用含有灭菌滤纸的漏斗过滤，得活跃链霉菌单孢子悬液；

(2)将步骤(1)制得的活跃链霉菌菌液稀释至10～20cfu/mL，然后涂布至含有质量百分比为0.01％那西肽的平板培养基上，进行低能离子束的梯度剂量的注射诱变，靶室真空度为8.0×10^-3Pa，注射脉冲剂量设定为90×2.6×10¹³ions/(cm²·s)，注射完成后，进行后续筛选培养。

其他步骤同实施例1。初筛结果如表3所示，60个单菌落中有6个明显高于对照。

表3初筛结果

将6支效价较高的单菌落斜面，接入种子培养基，培养完成后，按照发酵瓶体积的8％接种培养，培养完成后测定效价，结果如下表：

表4复筛结果

菌种号	复筛效价(U/ml)	提升率(％)
			NX-9	2910	0
NX9-64	3260	12.0
			NX9-69	3590	23.4
NX9-71	3920	34.7
			NX9-76	3565	22.5
NX9-77	3600	23.7
			NX9-86	3765	29.4

由表4可以看出，NX9-71效价幅度提升最明显，效价达到3920u/ml，提升幅度为34.7％，选取NX9-71进行菌种保藏，并进行了稳定性考察。

稳定性考察：

将NX9-71菌种进行斜面传代,得到的各子代斜面进行摇瓶发酵能力考察,经过5代考察,新筛选菌株遗传能力稳定,说明本方法筛选的菌株有较好的遗传稳定性。

连续传代五次，验证发酵效价为：F1效价3910，F2效价3950，F3效价4025，F4效价3965，F5效价4000。

实施例3：

一种提高活跃链霉菌突变几率的方法，步骤如下：

采用与实施例2完全相同的步骤,只是将筛选因子更换为卡那霉素，对照菌种仍使用NX-9。实施例3同样选取60支单菌落，初筛结果见下表，60个单菌落中有7个明显高于对照。

表5初筛结果

菌种号	初筛效价(U/ml)	提升率(％)
			NX-9	2905	0
NX9-130	3150	8.43
			NX9-139	3450	18.8
NX9-144	3650	25.6
			NX9-156	3500	20.5
NX9-166	3690	27.0
			NX9-167	3560	22.5
NX9-177	3765	29.6

将7支效价较高的单菌落斜面，接入种子培养基，培养完成后，按照发酵瓶体积的8％接种培养，培养完成后测定效价，结果如下表：

表6复筛结果

菌种号	复筛效价(U/ml)	提升率(％)
			NX-9	2900	0
NX9-130	3100	6.89
			NX9-139	3400	17.2
NX9-144	3590	23.8
			NX9-156	3465	19.5
NX9-166	3620	24.8
			NX9-167	3550	22.4
NX9-177	3750	29.3

由上表可以看出，NX9-177效价幅度提升最明显，效价达到3750u/ml，提升幅度为29.3％，选取NX9-177进行菌种保藏，并进行了稳定性考察。

稳定性考察：

将NX9-177菌种进行斜面传代,得到的各子代斜面进行摇瓶发酵能力考察,经过5代考察,新筛选菌株遗传能力稳定,说明本方法筛选的菌株有较好的遗传稳定性。

连续传代五次，验证发酵效价为：F1效价3700，F2效价3850，F3效价3750，F4效价3765，F5效价3720。

实施例4：

一种提高活跃链霉菌突变几率的诱变方法，步骤如下：

(2)将步骤(1)制得的活跃链霉菌菌液稀释至10～20cfu/mL，然后涂布至含有质量百分比为0.01％那西肽的平板培养基上，进行低能离子束的梯度剂量的注射诱变，靶室真空度为6.0×10^-3Pa，注射脉冲剂量设定为80×2.6×10¹³ions/(cm²·s)，注射完成后，进行后续筛选培养。

其他步骤同实施例1。实施实例4同样选取60个单菌落进行初筛，初筛结果如下：

表7初筛结果

菌种号	初筛效价(U/ml)	提升率(％)
			NX-9	2900	0
NX9-186	3250	12.1
			NX9-190	3460	19.3
NX9-199	3520	21.4
			NX9-209	3500	20.7
NX9-211	3760	29.7
			NX9-227	3690	27.2

表8复筛结果

菌种号	初筛效价(U/ml)	提升率(％)
			NX-9	2900	0
NX9-186	3360	15.9
			NX9-190	3500	20.7
NX9-199	3460	19.3
			NX9-209	3600	24.1
NX9-211	3700	27.6
			NX9-227	3650	25.9

由上表可以看出，NX9-211效价幅度提升最明显，效价达到3700u/ml，提升幅度为27.6％，选取NX9-211进行菌种保藏，并进行了稳定性考察。

稳定性考察：

将NX9-211菌种进行斜面传代,得到的各子代斜面进行摇瓶发酵能力考察,经过5代考察,新筛选菌株遗传能力稳定,说明本方法筛选的菌株有较好的遗传稳定性。

连续传代五次，验证发酵效价为：F1效价3700，F2效价3750，F3效价3800，F4效价3700，F5效价3720。

实施例5：

一种提高活跃链霉菌突变几率的诱变方法，步骤如下：

(2)将步骤(1)制得的活跃链霉菌菌液稀释至10～20cfu/mL，然后涂布至含有质量百分比为0.01％那西肽的平板培养基上，进行低能离子束的梯度剂量的注射诱变，靶室真空度为7.0×10^-3Pa，注射脉冲剂量设定为100×2.6×10¹³ions/(cm²·s)，注射完成后，进行后续筛选培养。

其他步骤同实施例1。实施实例5同样选取60个单菌落进行初筛，初筛结果如下：

表9初筛结果

将8支效价较高的单菌落斜面，接入种子培养基，培养完成后，按照发酵瓶体积的8％接种培养，培养完成后测定效价，结果如下表：

表10复筛结果

由上表可以看出，NX9-266效价幅度提升最明显，效价达到4100u/ml，提升幅度为40.9％，选取NX9-266进行菌种保藏，并进行了稳定性考察。

稳定性考察：

将NX9-266菌种进行斜面传代,得到的各子代斜面进行摇瓶发酵能力考察,经过5代考察,新筛选菌株遗传能力稳定,说明本方法筛选的菌株有较好的遗传稳定性。

连续传代五次，验证发酵效价为：F1效价3960，F2效价4000，F3效价4000，F4效价4100，F5效价4000。

对比例1：

一种诱变方法，步骤如下：

(2)将步骤(1)制得的活跃链霉菌菌液稀释至10～20cfu/mL，然后涂布至含有质量百分比为0.01％那西肽的平板培养基上，进行低能离子束的梯度剂量的注射诱变，靶室真空度为8.0×10^-3Pa，注射脉冲剂量设定为60×2.6×10¹³ions/(cm²·s)，注射完成后，进行后续筛选培养。

其他步骤同实施例1。对比例1同样选取60个单菌落进行初筛，初筛结果如下：

表11初筛结果

菌种号	初筛效价(U/ml)	提升率(％)
			NX-9	2900	0
NX9-313	3000	3.45
			NX9-349	3100	6.90

将2支效价较高的单菌落斜面，接入种子培养基，培养完成后，按照发酵瓶体积的8％接种培养，培养完成后测定效价，结果如下表：

表12复筛结果

菌种号	初筛效价(U/ml)	提升率(％)
			NX-9	2900	0
NX9-313	3150	8.62
			NX9-349	3200	10.3

由上表可以看出，NX9-349效价幅度提升较明显，效价达到3200u/ml，提升幅度为10.3％，选取NX9-349进行菌种保藏，并进行了稳定性考察。

稳定性考察：

将NX9-349菌种进行斜面传代,得到的各子代斜面进行摇瓶发酵能力考察,经过5代考察,新筛选菌株遗传能力稳定,说明本方法筛选的菌株有较好的遗传稳定性。

连续传代五次，验证发酵效价为：F1效价3100，F2效价3100，F3效价3250，F4效价3150，F5效价3100。

对比例2：

一种诱变方法，步骤如下：

(2)将步骤(1)制得的活跃链霉菌菌液稀释至10～20cfu/mL，然后涂布至含有质量百分比为0.01％那西肽的平板培养基上，进行低能离子束的梯度剂量的注射诱变，靶室真空度为8.0×10^-3Pa，注射脉冲剂量设定为110×2.6×10¹³ions/(cm²·s)，注射完成后，进行后续筛选培养。

其他步骤同实施例1。对比例2同样选取60个单菌落进行初筛，初筛结果如下：

表13初筛结果

将3支效价较高的单菌落斜面，接入种子培养基，培养完成后，按照发酵瓶体积的8％接种培养，培养完成后测定效价，结果如下表：

表14复筛结果

由上表可以看出，NX9-399效价幅度提升较明显，效价达到3550u/ml，提升幅度为22.4％，选取NX9-399进行菌种保藏，并进行了稳定性考察。

稳定性考察：

将NX9-399菌种进行斜面传代,得到的各子代斜面进行摇瓶发酵能力考察,经过5代考察,新筛选菌株遗传能力稳定,说明本方法筛选的菌株有较好的遗传稳定性。

连续传代五次，验证发酵效价为：F1效价3460，F2效价3500，F3效价3500，F4效价3600，F5效价3500。

对比例3：

一种诱变方法，步骤如下：

(2)将步骤(1)制得的活跃链霉菌菌液稀释至10～20cfu/mL，然后涂布至含有质量百分比为0.01％那西肽的平板培养基上，进行紫外照射诱变，照射完成后，确定诱变剂量。

(3)诱变剂量的确定：

分别取孢子悬液0.1mL涂布在含有质量百分比为0.01％那西肽的平板培养基上，进行紫外照射，照射时间为30s、60s、90s、120s、150s、180s，选取六个梯度进行照射，照射完成后，平板放置于温度28～30℃、湿度20～60％的条件下培养7～8天，通过计算平板菌落数，在照射120s时致死率达到90％，结果如图2所示。

诱变剂量确定后，其他步骤同实施例1。对比例3同样选取60个单菌落进行初筛，初筛结果如下：

表15初筛结果

菌种号	初筛效价(U/ml)	提升率(％)
			NX-9	2900	0
NX9-430	2930	1.03
			NX9-470	2920	0.69

表16复筛结果

菌种号	初筛效价(U/ml)	提升率(％)
			NX-9	2900	0
NX9-430	2920	0.69
			NX9-470	2950	1.72

由上表可以看出，NX9-470效价幅度提升稍高，效价达到2950u/ml，提升幅度为1.72％，选取NX9-470进行菌种保藏，并进行了稳定性考察。

稳定性考察：

将NX9-470菌种进行斜面传代,得到的各子代斜面进行摇瓶发酵能力考察,经过5代考察,新筛选菌株遗传能力稳定,说明本方法筛选的菌株有较好的遗传稳定性。

连续传代五次，验证发酵效价为：F1效价2950，F2效价2930，F3效价3000，F4效价2950，F5效价3000。

结果分析

由以上事例可以得出，合理剂量内的低能离子束诱变能够很好的提高活跃链霉菌的突变几率，且提高幅度明显，遗传性能稳定，合理剂量外的诱变，能够提高活跃链霉菌的突变几率，提高幅度较小，常规的紫外诱变效果不明显，本发明创造性地提出80～100×2.6×10¹³ions/(cm²·s)低能离子束照射诱变活跃链霉菌能够提高活跃链霉菌的突变几率。

Claims

1.一种提高产那西肽的活跃链霉菌突变几率的诱变方法，其特征在于，步骤如下：

2.如权利要求1所述的诱变方法，其特征在于，所述步骤(1)中链霉菌孢子为生长均匀、丰满的活跃链霉菌的孢子。

3.如权利要求1所述的诱变方法，其特征在于，所述步骤(2)中，筛选因子选自那西肽、卡那霉素。

4.如权利要求1所述的诱变方法，其特征在于，所述步骤(2)中，筛选培养条件为：28～30℃、湿度20～60％的条件下，培养7～8天。

5.如权利要求1所述的诱变方法，其特征在于，所述步骤(2)中，所述筛选因子的质量百分比浓度为0.005～0.02％。

6.如权利要求1所述的诱变方法，其特征在于，所述步骤(2)中，含筛选因子的平板培养基组分如下，均为质量百分比：

可溶性淀粉1.5～2.5％、蛋白胨0.4～0.8％、磷酸二氢钾0.04～0.06％、硫酸亚铁0.001％、硝酸钾0.08～0.12％、硫酸镁0.04～0.06％、氯化钠0.04～0.06％、筛选因子0.005～0.02％、轻质碳酸钙0.4～0.6％、琼脂1.5～2.0％，余量水，pH6.5～7.0。