CN101638650A

CN101638650A - 一种林可霉素产生菌的筛选方法

Info

Publication number: CN101638650A
Application number: CN200910065399A
Authority: CN
Inventors: 李红德; 高同伟; 张新静; 冯剑波; 赵晴; 王�锋; 刘海波
Original assignee: NANYANG PUKANG PHARMACEUTICAL CO Ltd
Current assignee: NANYANG PUKANG PHARMACEUTICAL CO Ltd
Priority date: 2009-07-01
Filing date: 2009-07-01
Publication date: 2010-02-03

Abstract

本发明公开了一种林可霉素产生菌的筛选方法，该方法采用离子注入技术对林可霉素产生菌林肯链霉菌进行诱变与抗性筛选复合处理，使用N⁺作为离子源，研究了N⁺注入对林可霉素生产菌所产生的生物学效应，通过其自身产物林可霉素前体物抗性筛选法获得多株遗传稳定性较好的高产突变株，使其中突变株发酵单位比出发菌株提高了81.4％。

Description

一种林可霉素产生菌的筛选方法

所属技术领域

本发明涉及林可霉素产生菌的筛选方法，特别是涉及一种可以提高林可霉素产量的突变菌的筛选方法。

背景技术

林可霉素，又称洁霉素，是由林肯链霉菌(Streptomyces lincolnensis)产生的林可酰胺类抗生素，组分包括氨基酸和糖，是由L-酪氨酸和戊糖磷循环(戊糖-5-磷酸和景天糖-7-磷酸)的中间产物缩合而成，整个生物合成途径包括2个分支：一个由L-酪氨酸合成丙基脯氨酸(PPL)，另一个由景天糖-7-磷酸构成α一甲硫林可胺(α-MIL)，是经三级有氧发酵生产的。抗革兰氏阳性菌，临床主要用于治疗革兰氏阳性菌引起的感染，具有疗效显著，副反应少，不易产生交叉耐药性等特点，广泛运用于临床。另外其深加工衍生物用量不断地加大，是一种很有前途的抗生素，所以提高林可霉素的生产水平势在必行！而筛选高产林可霉素的菌株是提高林可霉素的生产水平最为有效的途径之一。

目前，筛选高产林可霉素的菌株的方法有：用紫外线/氯化锂复合诱变剂对林可霉素产生菌进行处理，并用高效的琼脂块培养法对菌株进行筛选.结果：筛选出的菌株在摇瓶中的发酵单位比对照菌株提高了21.73％；而用热诱变对林可霉素产生菌进行处理，并用高效的琼脂块培养法对菌株进行筛选，结果：筛选出的菌株在摇瓶中的发酵单位比对照菌株提高了23.53％；这些筛选林可霉素高产菌株方法，对林可霉素产量提高不大，效果仍不甚理想。

发明内容

因此人类对提高林可霉素产量的高产菌株的筛选方法仍存在需求，至今为止，还没有发现任何有关本发明的报道，本发明人经过反复研究，终于找到了提高林可霉素产量的高产菌株的筛选方法，完成了本发明。针对上述情况，为克服现有技术的缺陷，本发明的目的就在于提供一种提高林可霉素产量的突变菌株的筛选方法。

为达到上述目的，本发明所述的筛选方法如下：

将冷冻保藏的沙土管接入斜面培养成熟后，作为出发菌种，刮去适量孢子经无菌水稀释后，注入N⁺进行诱变处理，在含有蛋氨酸的培养基上培养，用琼脂块培养法进行初筛，用一级、二级发酵培养基发酵培养进行复筛，将选出的高产突变株进行遗传稳定性试验，即可获得目的菌株。

所述诱变剂N⁺注入剂量为5-50keV，抗性物质蛋氨酸浓度百分比为0.1-4.0％。

所述一级发酵培养基是由下列重量百分比的原料制成的：淀粉1.0-3.0％、豆粉1.0-3.0％、蛋白胨0.3-0.7％、葡萄糖0.5-1.5％、KNO₃0.1-0.3％、NaH₂PO₄0.4-1.0％、CaCO₃0.1-0.5％、余量为水，pH 6-8；

250mL三角瓶装液30mL，25-35℃，220r/min条件下培养40-60h；

所述二级发酵培养基是由下列重量百分比的原料制成的：淀粉1.0-3.0％、葡萄糖0.5-1.5％、豆饼粉0.5-2.0％、水解蛋白0.5-1.0％、NH₄)₂SO₄0.1-0.5％、Mg₂SO₄0.05-0.2％、KH₂PO₄0.01-0.05％、CaCO₃0.1-1.0％、余量为水，pH 6-8；

250mL三角瓶装液30mL，由一级发酵液按5％接种量接种，25-35℃，220r/min条件下培养100-120h；

在本发明中，由于质、能、荷三因子的协同作用，离子束注入引起大量受体原子移位、重组和生物大分子的变异，形成新的分子结构和基因，产生丰富的基因突变，因而离子注入可以在损伤较轻的情况下获得较高的突变率。利用林肯链霉菌对自身产物及其前体物的抗性筛选，有明确的方向性，更有利于加快筛选工作的进程，扩大筛选的规模，增加正突变率。本发明以林可霉素前体物-蛋氨酸为添加剂，利用林可霉素抗性筛选法作为诱变育种的辅助筛选手段，结合氮离子注入诱变，进行定向育种，大幅提高了筛选效率。

本发明采用林可霉素抗性筛选结合离子注入诱变方法，选育林可霉素产生菌获得较好的效果，通过多轮选育得到一株发酵效价提高81.4％且遗传性状稳定的突变菌株。并研究了不同离子注入参数对菌株存活率的影响，总结离子注人对林肯链霉菌产生的生物学效应，为进一步优化离子注入参数用于选育高产林可霉素产生菌株提供参考，使用林可霉素抗性作为筛选手段大大提高了正突变菌株的选育效率。

附图说明

下面结合附图对本发明作进一步说明。

图1是本发明一实施例进行离子注入诱变菌株存活率曲线图。

具体实施方式

本发明所述的筛选方法如下：

250mL三角瓶装液30mL，25-35℃，220r/min条件下培养40-60h；

所述二级发酵培养基是由下列重量百分比的原料制成的：淀粉1.0-3.0％、葡萄糖0.5-1.5％、豆饼粉0.5-2.0％、水解蛋白0.5-1.0％、(NH₄)₂SO₄0.1-0.5％、Mg₂SO₄0.05-0.2％、KH₂PO₄0.01-0.05％、CaCO₃0.1-1.0％、余量为水，pH 6-8；

1材料与方法

1.1菌种

出发菌株林肯链霉菌816A，由南阳普康药业有限公司菌种研究所保存；

1.2培养基及培养条件

斜面与平板分离培养基：营养琼脂培养基

一级发酵培养基：淀粉2.0％、豆粉2.0％、蛋白胨0.5％、葡萄糖1.0％、KNO₃0.2％、NaH₂PO₄0.7％、CaCO₃0.3％、余量为水，pH 7.0；

250mL三角瓶装液30mL，30℃，220r/min条件下培养48h；

二级发酵培养基：淀粉2.0％、葡萄糖1.0％、豆饼粉1.5％、水解蛋白0.5％、(NH₄)₂SO₄0.2％、Mg₂SO₄0.1％、KH₂PO₄0.03％、CaCO₃0.5％、余量为水，pH 7.2；

250mL三角瓶装液30mL，由一级发酵液按5％接种量接种，30℃，220r/min条件下培养108h；

生物鉴定培养基：八叠球菌抗菌活性测定培养基pH 7.5～8.0，中国药品生物制品检定所

1.3诱变剂及处理方法

林肯链霉菌经斜面培养基活化后，孢子成熟，室温下，用无菌水洗下斜面孢子并用接种环轻刮斜面表面，将菌悬液加到盛有玻璃珠的无菌水中，放入摇床220r/min，30℃，培养30min，使孢子充分分散和活化，然后用微孔过滤注射器过滤除去菌丝体，滤液即为诱变用的出发菌株，孢子悬液过滤后取0.1mL孢子滤液均匀涂布于无菌培养皿上，以无菌风吹至干燥后进行N⁺注入，N⁺注入机为LZD900多功能N⁺注入机，本实验用能量为5～50keV的N⁺进行不同注量的离子注入进行诱变，靶室真空度为10Pa，以5s脉冲式注入，间隔15s。N⁺注入后，取出平皿，用1.5mL无菌水洗脱，梯度稀释到10^-6涂布到含有不同浓度(0.3～3.0％)蛋氨酸的平板培养基上，30℃培养箱中培养至长出单菌落，空白平板作对照，计数单菌落数目，以作存活率统计，然后继续培养至成熟，挑长势良好的单菌落接斜面，成熟后用以筛选；

存活率：诱变过的菌株，在固体平面培养基生长的菌落数与未诱变对照菌株在固体平面培养基生长的菌落数的比值，即是其存活率。

1.4筛选方法

初筛：采用琼脂块培养法进行初筛抑菌活力(抑菌比，IR)＝抑菌圈直径(mm)/菌落直径(mm)；具体方法：将菌株30℃培养3d，用打孔器将单菌落连同琼脂块一同取出放入空培养皿中(80～90琼脂块)，在30℃、相对湿度75％静止培养5d，刮取少量的成熟孢子传入斜面，然后再将每个琼脂块移到含抗菌的生物鉴定平板上(120～150琼脂块)，37℃培养16～18h，测定抑菌圈直径，挑出抑菌圈明显大于对照菌(未作诱变处理)抑菌圈的菌落，做进一步摇瓶实验，对照组菌落琼脂块应放在同一生物检定平板上培养，对照菌落的数量应不低于总琼脂块的20％，放置位置须遍布检定平板的各个部位。

复筛：发酵液经滤纸过滤后采用管蝶法测生物效价

1.5遗传稳定性试验

挑取经筛选的对八叠球菌有较强抑制效果的突变菌株进行传代培养，连续传7～10代，对每一代进行摇瓶发酵培养，收集发酵液，对发酵原液过滤后采用管蝶法测其抑菌效果，从而判断遗传稳定特性。

2实验结果

2.1离子注入存活率曲线

实验以816A为原始出发菌株，进行离子注入诱变，注入离子为氮离子，不同注入能量诱变条件下菌株816A的存活率曲线如图1所示。

2.2筛选结果

挑取菌落形态良好，生命力强的菌落进行扩大培养，之后按材料与方法所述进行培养与筛选，得到的初筛结果见表2。

表2复合诱变处理对菌株的复筛结果

由表2可以看出，经复筛后，菌株816A-782产林可霉素的能力有明显的提高，产量较原来出发菌株摇瓶发酵提高了81.4％，此时的诱变条件为：N⁺注入能量为20keV，蛋氨酸的含量为0.8％。

2.3高产菌株的选育与遗传稳定试验

在能量为20keV氮离子最佳注入参考剂量下进行多次平行离子注入诱变，挑选林可霉素抗性菌株进行发酵测定林可霉素产量，得到多株高产菌株。将产菌株在斜面培养基上连续传7代，其产孢子速率基本一致。将各代菌种加液体培养基发酵，生物测效价测定林可霉素产量。从表3中可以看到，这些菌株传7代，菌种发酵效价下降均不高于5％，表明遗传稳定性较好，其中816A-782发酵产量较出发菌株提高最多，约81.4％。

结果见表3

表3遗传稳定性试验结果

2.4突变株的验证结果

将出发菌株816A与突变株816A-782在120m³大生产发酵罐上试验，培养条件(压力、温度、通气量、搅拌转速等)均相同，培养时间176±3h，试验结果如下表4。

表4突变株816A-782的生产验证结果

从表4可以看出，在120m³生产罐上突变株816A-782的发酵效价比出发菌株816A提高12％，效果明显。推广后，年提高林可霉素产量近300吨，增加产值近亿元。

3结论

本发明采用林可霉素抗性筛选结合离子注入诱变方法，选育林可霉素产生菌获得较好的效果，通过多轮选育得到一株产量提高81％且遗传性状稳定的高产菌。并研究了不同离子注入参数对菌株存活率的影响，总结离子注人对林肯链霉菌产生的生物学效应，为进一步优化离子注入参数用于选育高产林可霉素产生菌株提供参考，使用林可霉素抗性作为筛选手段大大提高了高产菌株的选育效率。

Claims

1、一种林可霉素产生菌的筛选方法，所述的筛选方法如下：

将冷冻保藏的沙土管接入斜面培养成熟后，作为出发菌种，刮去适量孢子经无菌水稀释后，注入N+进行诱变处理，在含有蛋氨酸的培养基上培养，用琼脂块培养法进行初筛，用一级、二级发酵培养基发酵培养进行复筛，将选出的高产突变株进行遗传稳定性试验，即可获得目的菌株。

2、根据权利要求1所述的林可霉素产生菌的筛选方法，其特征在于所述诱变剂N+注入剂量为5-50keV，抗性物质蛋氨酸浓度百分比为0.1-4.0％。

3、根据权利要求1所述的林可霉素产生菌的筛选方法，其特征在于所述一级发酵培养基是由下列重量百分比的原料制成的：淀粉1.0-3.0％、豆粉1.0-3.0％、蛋白胨0.3-0.7％、葡萄糖0.5-1.5％、KNO₃ 0.1-0.3％、NaH₂PO₄ 0.4-1.0％、CaCO₃ 0.1-0.5％、余量为水，pH 6-8。

4、根据权利要求1所述的林可霉素产生菌的筛选方法，其特征在于所述二级发酵培养基是由下列重量百分比的原料制成的：淀粉1.0-3.0％、葡萄糖0.5-1.5％、豆饼粉0.5-2.0％、水解蛋白0.5-1.0％、(NH₄)₂SO₄ 0.1-0.5％、Mg₂SO₄0.05-0.2％、KH₂PO₄ 0.01-0.05％、CaCO₃ 0.1-1.0％、余量为水，pH 6-8。

5、根据权利要求2所述的林可霉素产生菌的筛选方法，其特征在于所述蛋氨酸的浓度百分比为0.3-3.0％。