CN100529056C - 高产Zwittermicin A和晶体蛋白的高毒力苏云金芽胞杆菌突变株D1-23及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于微生物农药制备技术领域，具体涉及一种高产Zwittermicin A和晶体蛋白高毒力苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis)突变株的选育。特征是，以本申请人的授权专利菌株YBT-1520为出发菌株，通过紫外线和硫酸二乙酯诱变，得到苏云金芽胞杆菌突变株D1-23(保藏号为CCTCC NO：M206064)，通过制剂化生产和生物防治应用，其发酵液对甜菜夜蛾LC50平均为0.266μL/mL，对棉铃虫的效价平均为6053IU/μL，Zwittermicin A产量平均为163units/mL，晶体蛋白产量平均为5.91mg/mL。本发明能有效降低苏云金芽胞杆菌杀虫剂的生产和使用成本，对增强其对甜菜夜蛾和棉铃虫等夜蛾科害虫的杀虫毒力，拓宽杀虫谱具有重要意义。
Description
技术领域
本发明属于微生物农药技术领域，具体涉及一种苏云金芽胞杆菌突变菌株的筛选及应用。
背景技术
苏云金芽胞杆菌是目前应用最为成功的微生物杀虫剂，多年来已被人们深入研究，但是仍有许多问题有待解决。如：苏云金芽胞杆菌杀虫晶体蛋白均在不同程度上引起了昆虫的抗性，对不同的昆虫作用有较高的特异性，许多重要农业害虫对苏云金芽胞杆菌毒素不敏感，且现有商品株杀虫谱过窄，工程菌株遗传性状不稳定，各类害虫对已有cry基因抗性的不断产生，都将成为影响苏云金芽胞杆菌进一步成功推广应用的制约性因素。
甜菜夜蛾是一种世界性分布的重要农作物害虫，为害甜菜、花生、大豆、玉米、棉花等100多种植物。目前报道的苏云金芽胞杆菌菌株对不同害虫具有较高的特异性，但对甜菜夜蛾等夜蛾科害虫较不敏感，因此分离筛选对甜菜夜蛾高毒力活性的新的苏云金芽胞杆菌菌株，是当前世界各国苏云金芽胞杆菌研究的热点。
有资料显示，双效菌素(Zwittermicin A)是一种氨基多元醇类抗生素，自身对昆虫的毒性极弱，但可显著提高苏云金芽胞杆菌库斯塔克亚种菌株对甜菜夜蛾的杀虫活性，其增效作用可达几百倍，同时可延缓昆虫对Bt杀虫剂的抗性。一般的苏云金芽胞杆菌对夜蛾科甜菜夜蛾等害虫的毒性较低，但对棉铃虫具有很好的杀虫效果，因此获得高产Zwittermicin A的苏云金芽胞杆菌，对增强其对甜菜夜蛾等夜蛾科害虫的杀虫毒力，拓宽杀虫谱，提高Bt杀虫剂的应用效果具有重要意义。
近年来，也有一些研究者采用传统的物理化学诱变或分子生物学定点突变的方法，用琼脂平板扩散法筛选高产Zwittermicin A的苏云金芽胞杆菌突变株(Outtrup et al.，2001；Outtrupet al.，2005；Elizabeth et al.，2004)，但该方法效率低、工作强度大，也不经济，因此迫切需要建立新的高效筛选模型并获得上述目标性状的苏云金芽胞杆菌突变株。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的缺陷，所要解决的技术问题是利用现有的遗传育种手段，获得一种高产Zwittermicin A和杀虫晶体蛋白且对夜蛾科昆虫有高毒力的苏云金芽胞杆菌突变株及其在制备苏云金芽胞杆菌制剂和农业防治中的应用。
本发明通过以下技术方案实现：
发明人筛选得到一株能高产Zwittermicin A和晶体蛋白且对夜蛾科昆虫具有高毒力的苏云金芽胞杆菌株突变株，被命名为D1-23，该突变株为一种苏云金芽胞杆菌Bacillusthuringiensis，于2006年7月5日保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，其保藏号为CCTCC NO：M206064。并利用该菌株通过深层发酵工艺获得高产Zwittermicin A和晶体蛋白晶体，通过制剂化生产得到苏云金芽胞杆菌制剂，进而用于农业生物防治，例如夜蛾科昆虫的防治。
本发明的出发菌株是采用本申请人已经授权的发明专利菌株苏云金芽胞杆菌YBT-1520，该菌株属于一株对棉铃虫高毒力的苏云金芽胞杆菌菌株(参见中国发明专利说明书，专利号为ZL95106749.4)，通过紫外线和硫酸二乙酯诱变育种，采用建立的筛选模型选育出高产Zwittermicin A和晶体蛋白且对夜蛾科昆虫高毒力的突变株D1-23。申请人将该菌株应用于高产Zwittermicin A和晶体蛋白的发酵工艺，开发出新一代高效广谱苏云金芽胞杆菌菌剂。
以下对本发明作进一步的描述：
本发明通过建立以下筛选模型来选育对甜菜夜蛾具有高毒力的突变株，利用苏云金芽胞杆菌YBT-1520菌株(参见中国发明专利，ZL95106749.4)为出发菌株，通过紫外线(UV)和硫酸二乙酯(DES)进行诱变育种，用琼脂块平板大通量筛选法初筛出高产Zwittermicin A和晶体蛋白的突变株，然后对高产Zwittermicin A突变株进行摇瓶发酵，通过测定其晶体蛋白和Zwittermicin A的含量进一步复筛，最后通过对高产Zwittermicin A和晶体蛋白的突变株进行生物效价测定，筛选得到一株对夜蛾科有高毒力的苏云金芽胞杆菌突变株D1-23。具体选育步骤如下：
(1)采用专利菌株YBt-1520(专利号：ZL 95106749.4)为出发菌株，该菌株对棉铃虫具有高毒力杀虫活性；
(2)紫外线(UV)诱变：将YBt-1520菌株接种到通用的LB液体培养基上培养6-8h，3000rpm离心15min，弃上清，制成菌悬液，调整细胞浓度为108个/mL，作为待处理菌液，取5mL上述菌液加到直径11cm的无菌培养皿内，并放入无菌磁力搅拌器，在15W，254nm紫外灯30cm处分别照射0、0.5、1、2、3、5min，在红灯下取1mL照射过的菌液加到装有4mL LB液体培养基的试管中进行活化，用黑布包好避光，于30℃、180rpm恒温摇床中培养2h；
(3)硫酸二乙酯(DES)诱变：将步骤(2)的经紫外线诱变得到的突变菌株在LB液体培养基培养6-8h，3000rpm离心15min，弃上清，制成菌悬液，使每毫升菌悬液约含108个苏云金芽胞杆菌孢子，取4mL上述菌悬液加入16mL pH7.0的25mM磷酸钠缓冲液，再加5mL 5％的DES乙醇溶液(DES的终浓度为0.01g/mL)，分别震荡处理20、40、60min后加入0.5mL25％的硫代硫酸钠溶液终止反应，取1mL诱变菌液加到装有4mL LB液体培养基试管中进行活化，于30℃、180rpm恒温摇床中培养2h；
(4)将诱变后的活化菌悬液稀释，涂布在H8固体培养基(培养基的组成如后所述)平板上，菌悬液稀释的浓度控制在每皿菌落数30～50个。30℃培养一天，待刚刚长出针尖样菌落时，用内径6mm的打孔器，挑取突变死亡率在80％以上的平板上的突变株，连同下面的琼脂一起取出，转移到无菌空白平皿内；
(5)将30℃恒温培养2～3天的菌落，连同琼脂块转移到1/20TSA(参见Silo-Suh 1994年报道的方法，Biological activities of two fungistatic antibiotics produced by Bacillus cereusUW85.Ph.D.thesis.University of Wisconsin-Madison，Madison)检定平板上，于28℃培养24h，挑选出抑菌圈直径明显大于出发菌株的菌株；
(6)选抑菌圈直径明显大于出发菌株抑菌圈的菌株采用H8液体培养基进行摇瓶发酵复筛。测定晶体蛋白和Zwittermicin A的含量，选两者含量都高的菌株以甜菜夜蛾为供试昆虫，进行生物效价测定，选对甜菜夜蛾最高毒力的菌株确定为本发明所需要的高效突变菌株；
(7)H8固体培养基配方为：玉米淀粉20克/升、黄豆饼粉20克/升、玉米浆10克/升、工业蛋白胨5克/升、酵母粉2克/升、CaCO3 1-2克/升、琼脂20克/升，其余是水。按照报道的常规方法灭菌，灭菌前调pH为8.0。
(8)H8液体培养基配方为：玉米淀粉20克/升、黄豆饼粉20克/升、玉米浆10克/升、工业蛋白胨5克/升、酵母粉2克/升、CaCO3 1-2克/升，其余是水，按照报道的常规方法灭菌，灭菌前调pH为8.0。
(9)1/20 TSA培养基配方为：胰蛋白胨0.85g，大豆蛋白胨0.15g，NaCl 0.25g，葡萄糖0.125g，KH2PO4 0.125g，琼脂15g，补充水至1000mL，按报道的常规方法灭菌，灭菌前调pH 7.0～7.2。
利用本发明得到的苏云金芽胞杆菌突变株D1-23，按照苏云金芽胞杆菌的常规液体深层发酵的方法进行发酵生产微生物杀虫剂产品，并按照报道的方法进行制剂化生产不同剂型的苏云金芽胞杆菌制剂(或称菌剂)，进行了田间防治甜菜夜蛾和棉铃虫的防治应用。
D1-23菌株的生物学及遗传特性描述：
生物学特征：菌体直杆状，营养体呈链状或单生，长3-5微米，宽1-1.2微米，革兰氏染色阳性，芽孢呈圆柱状或近似椭圆，偏端生，芽孢囊不膨大，在牛肉膏蛋白胨培养基上菌落圆形，边缘平滑，菌苔丰满呈蜡质状，生长温度10-45℃，最适生长温度26-32℃，适宜pH6.5-7.5，兼性嫌氧，在含7％NaCl的牛肉蛋白胨培养基中生长，在核糖、葡萄糖、果糖、麦芽糖和可溶性淀粉培养基中产酸，甲基红反应阳性，伴胞晶体长、宽均比YBT-1520的伴胞晶体增加32％，呈双金字塔型。在发酵培养中，可以在以多种农副产品为原料的培养基中旺盛生长，产生大量伴胞晶体和Zwittermicin A，对棉铃虫的毒力效价在4000IU/mg-6000IU/mg之间，对甜菜夜蛾LC50为0.2-4μL/mL。
遗传学特性：D1-23菌株鞭毛抗原血清型为H3ab，伴胞晶体有130KDa和65KDa晶体蛋白组成。
D1-23菌株的保藏：D1-23菌株可以在LB培养基斜面上于30℃培养。可于4℃下作短期保藏。若长期保藏，按照常规方法以冷冻管或沙土管保藏菌株比较合适。
D1-23菌株在制备苏云金芽胞杆菌制剂中的应用(即通常所说的制剂化生产)，可参照本申请人的先前专利(专利号为ZL 01128475.7)的操作程序进行，具体步骤如下：
(1)将保藏号CCTCC NO：M206064菌株D1-23接种于LB试管斜面培养基上，于30℃培养24小时进行活化，然后转接于茄子瓶斜面，30℃培养48～72小时，即为生产用斜面菌种；
(2)种子液培养：将步骤(1)培养好的茄子瓶斜面菌种接种于LB液体培养基中，于30℃，200-250rpm条件下培养6～8小时，然后以0.5～1％的接种量接入发酵罐培养；
(3)按发酵罐容积60-80％投入步骤(6)所示的培养基，采用常规的高压蒸汽灭菌，即在121℃，搅拌200-250rpm条件下，维持30分钟灭菌，冷却至30-33℃后按发酵罐投料体积的0.5～1％移入种子液；
(4)发酵罐培养：在温度28-32℃，罐压0.3-0.8kg/cm2，通气量1∶0.4-1∶1.2(V/V)，搅拌200-250rpm条件下培养26-36小时，用显微镜检查有20-40％的芽孢囊破裂，便可放罐；
(5)发酵控制：将发酵罐培养基在灭菌前调pH至7.5-9.0左右；灭菌后使培养基的pH值达到6.5-7.5左右，使芽胞萌发率达到最高。当菌体开始生长后pH下降至6.0-6.5，随后又回升至放罐时的pH值7.5-8.5左右。通气：在发酵过程中一般要求通气流量达到1∶0.4至1∶1.4(V/V)，发酵罐发酵6～8小时，保持其通气量为：1∶1-1∶1.4(VN)。随时检查温度值，控制温度变化在30±2℃；
(6)发酵罐培养基配方为：按重量/体积百分比计：黄豆饼粉3.5-5.0％(黄豆饼粉需要过80-100目筛)，玉米淀粉2.0-4.0％(每克玉米淀粉中添加0.0025g商品α-淀粉酶)，酵母粉0.1-1.0％，玉米浆1.0-3.0％，蛋白胨0.3-0.5％，KH2PO4 0.1-2.0％，泡敌0.05-0.1％，按照常规方法灭菌，灭菌前pH调为7.5-9.0，灭菌后pH调为6.5-7.5。
本发明的积极效果是：
与已有技术相比，本发明建立了一种快速高效选育高产Zwittermicin A和晶体蛋白且对夜蛾科昆虫高毒力的苏云金芽胞杆菌的筛选模型。采用该选育模型，一周可以选育1000余株突变株，而传统的生物测定方法选育不足50株，大大提高了育种效率，降低了工作量。本申请人选育得到高产Zwittermicin A和晶体蛋白且对夜蛾科昆虫高毒力的一系列菌株，与原始出发菌株相比，Zwittermicin A产量提高了2-3倍，对夜蛾科昆虫甜菜夜蛾和棉铃虫的生物测定效价分别提高了100％-300％和10％-20％。
经试验，本发明的高产Zwittermicin A和晶体蛋白且对夜蛾科昆虫高毒力的苏云金芽胞杆菌D1-23菌株的应用能够大大降低苏云金芽胞杆菌杀虫剂的生产和田间防治成本，延缓害虫抗性的发生。
附图说明
图1：是本发明的技术路线图。
具体实施方式
实施例1 利用YBT-1520菌株诱变获得高产Zwittermicin A和晶体蛋白的高毒力苏云金芽胞杆菌突变株D1-23
本发明出发菌株选自对棉铃虫有高毒力的YBT-1520菌株(菌株来源参见专利号为ZL95106749.4中国发明专利)，通过紫外线和硫酸二乙酯(DES)进行诱变育种。采用申请人自己建立的快速高效的选育模型(见图1)，对26000多株突变株进行了系统检测，得到一株高产Zwittermicin A和晶体蛋白且对甜菜夜蛾高毒力的突变株D1-23(表1)。
具体筛选步骤如下：
(1)采用专利菌株YBt-1520(专利号为ZL95106749.4)作出发菌株，该菌株对棉铃虫具有高毒力活性；
(2)紫外线诱变：将YBt-1520菌株在LB液体培养基培养6-8h，3000rpm离心15min，弃上清，制成菌悬液，调整细胞浓度为108个/mL，作为待处理菌液，取5mL加到直径11cm的无菌培养皿内，并放入无菌磁力搅拌器，15W，254nm紫外灯30cm处分别照射0、0.5、1、2、3、5min，在红灯下取1mL照射菌液加到装有4mL LB培养基的试管中进行活化，用黑布包好避光，30℃、180rpm恒温摇床中培养2h；
(3)将步骤(2)诱变后的活化菌悬液稀释，涂布在H8固体培养基(玉米淀粉20克、黄豆饼粉20克、玉米浆10克、工业蛋白胨5克、酵母粉2克、CaCO3 1-2克、琼脂20克，补充水至1升，按照报道的常规方法灭菌，灭菌前调pH为8.0)平板上，菌悬液稀释浓度控制在每皿约菌落数30～50个。30℃培养一天，待刚刚长出针尖样菌落时，用内径6mm的打孔器，挑取突变死亡率在80％以上的平板上的突变株共3345株，连同下面的琼脂一起取出，转移到无菌空白平皿内；
(4)将30℃恒温培养3天的菌落，连同琼脂块一起转移到1/20 TSA检定平板上(内含胰蛋白胨0.85g，大豆蛋白胨0.15g，NaCl 0.25g，葡萄糖0.125g，KH2PO4 0.125g，琼脂15g，补充水至1000mL，按照常规方法灭菌，灭菌前调pH为7.0～7.2)，于28℃培养24h，挑选出抑菌圈直径明显大于出发菌株的菌株共95株；
(5)将步骤(4)中抑菌圈直径明显大于出发菌株的95株菌株采用H8液体培养基(玉米淀粉20克、黄豆饼粉20克、玉米浆10克、工业蛋白胨5克、酵母粉2克、CaCO3 1-2克，补充水至1升，按照报道的常规方法灭菌，灭菌前调pH为8.0)进行摇瓶发酵复筛。测定晶体蛋白和Zwittermicin A的含量，两者含量都高的菌株以甜菜夜蛾为供试昆虫，进行生物效价测定，初选得到对甜菜夜蛾最高毒力的苏云金芽胞杆菌候选菌株，该候选菌株被命名为BtU3-17，进行下一步硫酸二乙酯诱变。
(6)硫酸二乙酯诱变：将步骤(5)得到的BtU3-17菌株在LB液体培养基培养6-8h，3000rpm离心15min，弃上清，制成菌悬液，使每毫升菌悬液约含苏云金芽胞杆菌108个，取4mL上述菌悬液加入16mL pH7.025mM磷酸钠缓冲液，再加5mL5％的DES乙醇溶液(使DES的终浓度为0.01g/mL)，分别震荡处理20、40、60min后加入0.5mL 25％的硫代硫酸钠溶液终止反应，取1mL诱变的菌液加到装有4mL LB培养基的试管中进行活化，30℃、180rpm恒温摇床中培养2h；
(7)将步骤(6)诱变后的活化菌悬液稀释，涂布在H8的固体培养基(玉米淀粉20克、黄豆饼粉20克、玉米浆10克、工业蛋白胨5克、酵母粉2克、CaCO3 1-2克、琼脂20克，补充水至1升，按照报道的常规方法灭菌，灭菌前调pH为8.0)的平板上，菌悬液稀释浓度控制在每皿菌落数约30～50个。于30℃培养一天，待刚刚长出针尖样菌落时，用内径6mm的打孔器，挑取突变死亡率在80％以上的平板上的突变株2541株，连同下面的琼脂一起取出，转移到无菌空白平皿内；30℃恒温培养3天，将琼脂块转移到1/20 TSA检定平板上，28℃培养24h，挑选出抑菌圈直径明显大于出发菌株的菌株共计121株；
(8)将抑菌圈直径明显大于出发菌株共121株菌株采用H8液体培养基进行摇瓶发酵复筛。测定晶体蛋白和Zwittermicin A的含量，两者含量都高的菌株以甜菜夜蛾为供试昆虫，进行生物效价测定，选育到对甜菜夜蛾最高毒力的菌株D1-23。
表1 本发明诱变和筛选得到高产Zwittermicin A和晶体蛋白的的突变株
aDES：硫酸二乙酯法；UV：紫外线法
b挑选突变死亡率在80％以上的平板上的突变株。
实施例2
本发明的D1-23菌株与对照菌株YBT-1520应用于100L发酵罐发酵工艺试验
采用通用的液体深层发酵工艺(参见中国发明专利ZL 95106749.4)，具体步骤如下：
一、菌种的准备：
1、试验用菌种分别采用本发明的菌株D1-23和授权专利菌株YBT-1520，在制备后的培养基上分别接种进行比较试验；
2、斜面菌种的制备：
斜面培养基的制备：斜面培养基为LB培养基。将该培养基分装入试管或茄子瓶，按照报道的常规方法灭菌，灭菌后待温度降至50℃左右摆成斜面，如果温度太高，冷凝水多，可将斜面置37℃培养一天，待用。
斜面菌种的培养：将上述D1-23菌株和YBT-1520菌株分别接种子上述灭过菌的试管斜面培养基上，于30℃培养24小时(活化)，然后转接于茄子瓶斜面，30℃培养72小时，肉眼观察菌苔丰满，表面乳白色，无噬菌斑，显微镜观察无杂菌，90％以上芽孢脱落方可用于生产，供生产用斜面菌种，在冰箱内保存最多不超过一周。
二、发酵工艺的建立
1)种子液培养：将上述培养好的茄子瓶斜面菌种接种于LB液体培养基中，于30℃，200-250rpm条件下培养6～8小时，然后以1％的接种量接入发酵罐培养；
2)按发酵罐容积70％投入发酵罐培养基，该培养基按照报道的常规方法灭菌，搅拌200-250rpm条件下，维持30分钟灭菌，冷却至30-33℃后按投料体积的1％移入种子液；
3)发酵罐培养基配方：按照每70L的量加入下列组分及量：黄豆饼粉3150g，玉米淀粉2800g(添加0.0025g商品α-淀粉酶/每克玉米淀粉)，酵母粉210g，玉米浆1750g，蛋白胨350g，KH2PO4 700g，泡敌35ml，余量为水，黄豆饼粉需要过80-100目筛，灭菌前pH为8.0，灭菌后pH为7.10。
3)发酵培养：按发酵罐容积70％投入培养基(按步骤3的配方)，按照报道的常规方法灭菌，冷却至30-33℃后按投料体积的1％移入种子液。在温度28-32℃，通气量1∶0.4-1∶1.2(V/V)，搅拌200-250rpm条件下培养26-36小时，用显微镜检查有20-40％的芽胞囊破裂，便可放罐。
4)发酵控制：将发酵罐培养基灭菌前的pH调至8.0左右；灭菌后的pH值为7.10，当菌体开始生长后pH下降至6.0-6.5，随后又回升至放罐时的pH值7.5-8.5左右。通气：在发酵过程中一般要求通气流量达到1∶0.4至1∶1.4(V/V)。温度：随时检查温度值，控制温度变化在30±2℃。
5)在发酵罐发酵6-8h，保持其通气量为：1∶1-1∶1.4(V/V)。
三、产品质量检测结果：
产品质量检测结果见表2。
表2 本发明的D1-23菌株与YBT-1520菌株对发酵液毒力的比较
以上数据是三次重复实验数据的平均值。
与对照菌株YBT-1520相比，本发明的D1-23菌株对甜菜夜蛾的生物测定LC50平均值为0.266μL/mL，平均毒力提高了213.78％；对棉铃虫的生物测定效价平均值6053IU/μL，平均生物效价提高了12.63％；Zwittermicin A产量平均值为163.33units/mL，平均产量提高了2.66倍；晶体蛋白产量平均值为5.91mg/mL。
实施例3：本发明的D1-23菌株在苏云金芽胞杆菌制剂生产(或称制剂化)中的应用
本实施例制剂化生产参照本申请人授权专利号为ZL 01128475.7文献所示的方法进行。产品质量检测结果见表3。
表3 本发明D1-23菌株发酵液毒力的测定
苏云金芽胞杆菌D1-23菌株采用专利号为ZL 01128475.7的方法进行培养，发酵液对甜菜夜蛾的生物测定LC50平均值为0.266μL/mL；对棉铃虫的生物测定效价平均值为6053IU/μL；Zwittermicin A产量平均值为163units/mL；晶体蛋白产量平均值为5.91mg/mL。
Claims (4)
1、一种能高产ZwittermicinA和晶体蛋白且对夜蛾科昆虫有高毒力的苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis)突变株D1-23，其保藏号为CCTCC NO：M206064。
2、权利要求1所述的突变株D1-23在制备苏云金芽胞杆菌制剂中的应用。
3、权利要求1所述的突变株D1-23在鳞翅目害虫防治中的应用。
4、权利要求1所述的突变株D1-23在夜蛾科害虫防治中的应用。
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| CNB2006101249337A CN100529056C (zh) | 2006-11-03 | 2006-11-03 | 高产Zwittermicin A和晶体蛋白的高毒力苏云金芽胞杆菌突变株D1-23及应用 |
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| 产Zwittermicin A 的苏云金芽孢杆菌菌株的筛选及抗性基因zmaR的克隆与表达. 邵铁梅等.中国农业科学，第38卷第9期. 2005 |
| 产Zwittermicin A 的苏云金芽孢杆菌菌株的筛选及抗性基因zmaR的克隆与表达. 邵铁梅等.中国农业科学，第38卷第9期. 2005 * |
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Assignee: Pucheng Lifecome Biochemistry Co., Ltd. Assignor: Huazhong Agricultural University Contract record no.: 2011350000168 Denomination of invention: High virulence Bacillus thuringiensis mutant D1-23 with high yield of ZwittermicinA and crystal protein and its application Granted publication date: 20090819 License type: Exclusive License Open date: 20070718 Record date: 20110713 |