CN116622553B - 松乳菇菌根促生菌及其制备方法和其应用 - Google Patents

松乳菇菌根促生菌及其制备方法和其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种松乳菇菌根促生菌，所述松乳菇菌根促生菌为蜡样芽孢杆菌Bacillus cereus(GDMCC No.63270)、高山芽孢杆菌Bacillus altitudinis(GDMCC No.63269)、辣椒芽孢杆菌Bacillus zanthoxyli(GDMCC No.63271)中的任一种或组合。本发明的松乳菇促生菌，对松乳菇菌丝生长有明显的促进作用，松乳菇菌丝生长浓密，生长速度快。同时可用于进一步促进松乳菇菌根合成，提高了接种效率，缩短了菌根形成时长，提高整体的菌根合成率，降低杂菌污染率。

Description

松乳菇菌根促生菌及其制备方法和其应用
技术领域
本发明涉及微生物领域，具体涉及一种松乳菇菌根促生菌及其制备方法和其应用。
背景技术
松乳菇(Lactarius deliciosus)属红菇科真菌。其肉质细嫩，味道鲜美独特，营养丰富，可食用也可药用，被视为山中珍品，价格昂贵。松乳菇营养价值高，矿质元素和氨基酸含量丰富，各项氨基酸含量均高于香菇，尤其富含谷氨酸、天冬氨酸。研究表明，松乳菇还具有抑制肿瘤及免疫调节活性等功能。
松乳菇为菌根食用菌，比非菌根型担子菌(灵芝、香菇、杏鲍菇等)的栽培技术更为复杂，松乳菇的栽培仅能依靠人工合成菌根后移栽室外进行人工管理后出菇。现有的松乳菇人工合成菌根存在接种效率低、菌根合成率低、菌根形成所需时间长、杂菌污染率高等缺陷，限制了其松乳菇人工栽培研究和松乳菇菌根在植树造林中的应用。
菌根促生菌(Mycorrhizal helper bacteria,MHB)，是指一类可与菌根真菌混合接种的微生物，可提高菌根合成率，对外生菌根真菌菌丝的特异定植、生长及子实体形成有重要作用，同时菌根促生菌还有助于增强植物的营养与健康。但目前，菌根促生菌的菌种资源比较匮乏，寻找具有菌根促生功能的菌株是目前亟待解决的问题。
发明内容
本发明的目的在于提供一种松乳菇菌根促生菌，所述松乳菇菌根促生菌为蜡样芽孢杆菌Bacillus cereus(GDMCC No.63270)、高山芽孢杆菌Bacillus altitudinis(GDMCCNo.63269)、辣椒芽孢杆菌Bacillus zanthoxyli(GDMCC No.63271)中的任一种或组合。
本发明的另一目的在于提供一种松乳菇菌根促生菌用于促进松乳菇菌丝生长的应用，所述松乳菇菌根促生菌为蜡样芽孢杆菌Bacillus cereus(GDMCC No.63270)、高山芽孢杆菌Bacillus altitudinis(GDMCCNo.63269)、辣椒芽孢杆菌Bacillus zanthoxyli(GDMCC No.63271)中的任一种或组合。
本发明优选的技术方案中，所述应用具体包括如下步骤：
(1)取保存于4℃的促生菌划线接种于LB固体培养基，35℃培养24-48h，得活化的促生菌，按接种量为1-5％(w/v)接种于牛肉膏蛋白胨液体培养基中，30-35℃、160-200r/min振荡培养48-60h后，得促生菌菌液；
(2)将步骤(1)制得的促生菌菌液用0.22μm细菌过滤器过滤，收集上清滤液，得促生物添加液，将促生物添加液按体积比1:15-20加入到PDA培养基中混合，制得促生培养基；
(3)取边长4-5mm大小的松乳菇菌丝块，接种于步骤(2)制得的促生培养基中，20-25℃恒温培养40-55天，即得。
本发明优选的技术方案中，步骤(2)中，当促生菌为两种菌时，将各自的上清滤液按混合比例1-2:1-2混合得到促生物添加液，优选混合比例为1-1.5:1-1.5，更优选混合比例为1:1。
本发明优选的技术方案中，步骤(2)中，当促生菌为三种菌时，将各自的上清滤液按混合比例1-2:1-2:1-2混合得到促生物添加液，优选混合比例为1-1.5:1-1.5:1-1.5，更优选混合比例为1:1:1。
本发明优选的技术方案中，所述PDA培养基含有20-25％的土豆，0.5-1％的葡萄糖，1-5％的琼脂，其余为蒸馏水。
本发明的另一目的在于提供一种松乳菇菌根促生菌用于促进松乳菇菌根合成的应用，所述松乳菇菌根促生菌为蜡样芽孢杆菌Bacillus cereus(GDMCC No.63270)、高山芽孢杆菌Bacillus altitudinis(GDMCCNo.63269)、辣椒芽孢杆菌Bacillus zanthoxyli(GDMCC No.63271)中的任一种或组合。
本发明优选的技术方案中，所述应用具体包括如下步骤：
(1)选取侧根发达的松属植株幼苗，每株松属植株幼苗根部表面放置2份10-15×5-10mm的松乳菇菌丝块，同时添加1-5ml促生菌菌液；
(2)将步骤(1)处理后的松属植株幼苗置于根菌育苗盒中，用培养基质覆盖根部，于18-20℃，光照10000-20000lx，相对湿度90-95％下培养14-30d，即得。
本发明优选的技术方案中，所述根菌育苗盒体积为5cm×5cm×20cm。
本发明优选的技术方案中，所述松属植株幼苗的培养方法为，将松属植株种子清水浸泡36-48h后，再将种子浸泡在浓度为30％的双氧水中处理30-60min，过滤，种子用无菌水冲洗后，将其均匀置于培养筐中，种子表面覆盖1-3cm厚的种子萌发基质，定期浇水，设定昼长14-16h和夜长8-10h、16-20℃条件下培养50-60天，即得松属植物幼苗，所述种子培养基质由珍珠岩︰蛭石按照体积比1-3︰1均匀混合而成。
本发明优选的技术方案中，所述培养基质由泥炭土：蛭石按照体积比为0.5-2：1均匀混合而成。
本发明优选的技术方案中，松乳菇菌根合成率大于95％，优选大于99％，更优选为100％。
本发明优选的技术方案中，所述松乳菇菌丝块的制备方法包括如下步骤：
(1)取保存于4℃的促生菌划线接种于LB固体培养基，35℃培养24-48h，得活化的促生菌，按接种量为1-5％(w/v)接种于牛肉膏蛋白胨液体培养基中，30-35℃、160-200r/min振荡培养48-60h后，得促生菌菌液；
(2)将步骤(1)制得的促生菌菌液用0.22μm细菌过滤器过滤，收集上清滤液，得促生物添加液，将促生物添加液按体积比1:15-20加入到PDA培养基中混合，制得促生培养基；
(3)取边长4-5mm大小的松乳菇菌丝块，接种于20-25ml的步骤(2)制得的促生培养基中，20-25℃恒温培养40-55天，即得。
本发明优选的技术方案中，步骤(2)中，当促生菌为两种菌时，将各自的上清滤液按混合比例1-2:1-2混合得到促生物添加液，优选混合比例为1-1.5:1-1.5，更优选混合比例为1:1。
本发明优选的技术方案中，步骤(2)中，当促生菌为三种菌时，将各自的上清滤液按混合比例1-2:1-2：1-2混合得到促生物添加液，优选混合比例为1-1.5:1-1.5:1-1.5，更优选混合比例为1:1:1。
本发明优选的技术方案中，所述PDA培养基含有20-25％的土豆，0.5-1％的葡萄糖，1-5％的琼脂，其余为蒸馏水。
除非另有说明，本发明涉及液体与液体之间的百分比时，所述的百分比为体积/体积百分比；本发明涉及液体与固体之间的百分比时，所述百分比为体积/重量百分比；本发明涉及固体与液体之间的百分比时，所述百分比为重量/体积百分比；其余为重量/重量百分比。
除非另行说明，本发明采用如下检测方法：
1.菌丝与菌根鉴定：用真菌基因组DNA提取试剂盒提取菌丝或菌根DNA，用ITS4和ITS5为引物进行PCR扩增，PCR产物测序后进行Blast比对，确认培养菌丝为松乳菇、合成菌根为松乳菇菌根。
2.松乳菇菌根合成率＝形成松乳菇菌根的松属植株幼苗数量/所有接种松乳菇菌丝的松属植株幼苗数量×100％。
3.杂菌菌根污染率＝合成杂菌菌根的松属植株幼苗数量/所有接种松乳菇菌丝的松属植株幼苗数量×100％。
与现有技术相比，本发明有益的技术效果包括：
1、本发明科学筛选松乳菇促生菌，对松乳菇菌丝生长有明显的促进作用，松乳菇菌丝生长浓密，生长速度快。同时可用于进一步促进松乳菇菌根合成，提高了接种效率，缩短了菌根形成时长，提高整体的菌根合成率，降低杂菌污染率。
2、本发明操作简单，成本低廉，适合大规模生产。
生物材料保藏
本发明所述的松乳菇菌根促生菌蜡样芽孢杆菌Bacillus cereus(GDMCCNo.63270)、高山芽孢杆菌Bacillus altitudinis(GDMCCNo.63269)、辣椒芽孢杆菌Bacillus zanthoxyli(GDMCC No.63271)中，已于2023年3月13日提交保藏，保藏单位：广东省微生物菌种保藏中心，保藏地址为广东省广州市先烈中路100号大院59号楼5楼。
附图说明
图1实施例1-7和对照例的菌落直径比较。
图2菌落照片比较，(a)实施例3、(b)实施例4，(c)实施例5，(d)对照例。
具体实施方式
以下参照实施例说明本发明。但本发明不局限于实施例。
供试菌株：美味乳菇(Ld-1)来自新西兰达尼丁茵沃梅研究中心。
松属植物种子：意大利石松(Pinus pinea，Pp)购自新西兰达尼丁。
泥炭土、珍珠岩和蛭石：商购。
培养筐：上口宽25cm、长35cm；下口宽20cm、长30cm，高度19cm的聚丙烯容器，底面打孔25个，孔直径为4mm。
PDA基础培养基：10g土豆，5g葡萄糖，10g琼脂，1L蒸馏水。用直径9cm培养皿在22℃下按培养2个月备用。
松属植物幼苗：松属植物种子用清水浸泡48h，再将种子浸泡在30％双氧水中，30min后用无菌水冲洗3遍。将处理好的种子埋于种子萌发培养基质距表面1cm深处；按照植物光周期昼16h，23℃；夜8h，18℃设定光源和温度，定期浇水，育苗培养3个月，得到松属植物幼苗。种子萌发培养基质按照珍珠岩：蛭石体积比1：1混匀，混合基质121℃灭菌2h后冷却备用。
菌根培养基质按照泥炭土：蛭石体积比3：1混匀，将混合基质按121℃灭菌2h，冷却后备用。
实验中的松苗菌根均在体视显微镜(Leica M165FC，德国徕卡显微系统有限责任公司)下观察和测量。
参考例1：松乳菇菌根促生菌的筛选
1.土壤样品采集
采集四川省凉山州会东县野生松乳菇菌柄下方1cm左右土壤200g，带回实验室4℃保藏备用。
2.制备培养基
(1)LB培养基：胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化钠10g/L，琼脂20g/L。
(2)TSA培养基：酪蛋白胰酶消化物15g/L，大豆粉木瓜蛋白酶消化物5g/L，氯化钠5g/L，琼脂15g/L，最终pH值调至7.3左右。
(3)NA培养基：牛肉浸膏3.0g/L、蛋白胨5.0g/L、葡萄糖2.5g/L、琼脂18g/L，pH值调至7.0左右。
3.菌株的筛选
将取来的土壤样品混匀，称取1.5g样品置于试管中，用10mL蒸馏水制成菌悬液(用振荡器充分震荡)，再稀释成浓度分别为10-3、10-4、10-5、10-6的菌悬液。取各个浓度的土壤悬液0.1mL分别涂布于LB、TSA和NA固体培养基上面，每个浓度涂三个平板，涂布完成后将其在37℃下培养适当时间，待长出菌落。菌落长出后用划线法进行纯化，得到菌株1、菌株2和菌株3。
菌种保藏：经鉴定，菌株1、2和3均为芽孢杆菌，将其依次命名为蜡样芽孢杆菌Bacillus cereus(GDMCC No.63270)、高山芽孢杆菌Bacillus altitudinis(GDMCCNo.63269)、辣椒芽孢杆菌Bacillus zanthoxyli(GDMCC No.63271)中，已于2023年3月13日提交保藏，保藏单位：广东省微生物菌种保藏中心，保藏地址为广东省广州市先烈中路100号大院59号楼5楼。
促生菌菌液1：取保存于4℃的促生菌高空芽胞杆菌Bacillus altitudinis划线接种于LB固体培养基，35℃培养48h，得活化的促生菌，再按1％(w/v)接种量，接种于50mL牛肉膏蛋白胨液体培养基中，30℃、160r/min振荡培养48h，即得。
促生菌菌液2：取保存于4℃的促生菌蜡状芽孢杆菌Bacillus cereus划线接种于LB固体培养基，35℃培养48h，得活化的促生菌，再按1％(w/v)接种量，接种于50mL牛肉膏蛋白胨液体培养基中，30℃、160r/min振荡培养48h，即得。
促生菌菌液3：取保存于4℃的促生菌辣椒芽孢杆菌Bacillus zanthoxyli划线接种于LB固体培养基，35℃培养48h，得活化的促生菌，再按1％(w/v)接种量，接种于50mL牛肉膏蛋白胨液体培养基中，30℃、160r/min振荡培养48h，即得。
实施例1
本发明松乳菇促生菌促进菌根生长的方法，包括以下步骤：
(1)取促生菌菌液1用0.22μm细菌过滤器过滤，获得滤液，即为促生物添加液；取0.5ml促生物添加液，加入到20ml PDA培养基中混合，得促生培养基；
(2)取边长4-5mm大小的松乳菇菌丝块，转入步骤(1)制备得到的促生培养基中，于25℃、120r/min条件下培养30天后，即得生长浓密的松乳菇菌丝，菌落直径详见图1。
实施例2
本发明松乳菇促生菌促进菌根生长的方法，包括以下步骤：
(1)取促生菌菌液2用0.22μm细菌过滤器过滤，获得滤液，即为促生物添加液，取0.5ml促生物添加液，加入到20ml PDA培养基中混合，得促生培养基；
(2)取边长4-5mm大小的松乳菇菌丝块，转入步骤(1)制备得到的促生培养基中，于25℃、120r/min条件下培养30天后，即得生长浓密的松乳菇菌丝，菌落直径详见图1。
实施例3
本发明松乳菇促生菌促进菌根生长的方法，包括以下步骤：
(1)取促生菌菌液3用0.22μm细菌过滤器过滤，获得滤液，即为促生物添加液，取0.5ml促生物添加液，加入到20ml PDA培养基中混合，得促生培养基；
(2)取边长4-5mm大小的松乳菇菌丝块，转入步骤(1)制备得到的促生培养基中，于25℃、120r/min条件下培养30天后，即得生长浓密的松乳菇菌丝，菌落直径详见图1。
实施例4
本发明松乳菇促生菌促进菌根生长的方法，包括以下步骤：
(1)取促生菌菌液3用0.22μm细菌过滤器过滤，获得滤液，即为促生物添加液，取1ml促生物添加液，加入到20ml PDA培养基中混合，得促生培养基；
(2)取边长4-5mm大小的松乳菇菌丝块，转入步骤(1)制备得到的促生培养基中，于25℃、120r/min条件下培养30天后，即得生长浓密的松乳菇菌丝，菌落直径详见图1。
实施例5
本发明松乳菇促生菌促进菌根生长的方法，包括以下步骤：
(1)取促生菌菌液3用0.22μm细菌过滤器过滤，获得滤液，即为促生物添加液，取1.5ml促生物添加液，加入到20ml PDA培养基中混合，得促生培养基；
(2)取边长4-5mm大小的松乳菇菌丝块，转入步骤(1)制备得到的促生培养基中，于25℃、120r/min条件下培养30天后，即得生长浓密的松乳菇菌丝，菌落直径详见图1。
实施例6
本发明松乳菇促生菌促进菌根生长的方法，包括以下步骤：
(1)取促生菌菌液1用0.22μm细菌过滤器过滤获得滤液1，取促生菌菌液3用0.22μm细菌过滤器过滤获得滤液3，将滤液1和滤液3按体积比1:1混合，即为促生物添加液；取0.5ml促生物添加液，加入到20ml PDA培养基中混合，得促生培养基；
(2)取边长4-5mm大小的松乳菇菌丝块，转入步骤(1)制备得到的促生培养基中，于25℃、120r/min条件下培养30天后，即得生长浓密的松乳菇菌丝，菌落直径详见图1。
实施例7
本发明松乳菇促生菌促进菌根生长的方法，包括以下步骤：
(1)取促生菌菌液1用0.22μm细菌过滤器过滤获得滤液1，促生菌菌液2用0.22μm细菌过滤器过滤获得滤液2，取促生菌菌液3用0.22μm细菌过滤器过滤获得滤液3，将滤液1、滤液2和滤液3按体积比1:1：1混合，即为促生物添加液，取0.5ml促生物添加液，加入到20mlPDA培养基中混合，得促生培养基；
(2)取边长4-5mm大小的松乳菇菌丝块，转入步骤(1)制备得到的促生培养基中，于25℃、120r/min条件下培养30天后，即得生长浓密的松乳菇菌丝，菌落直径详见图1。
对照例
取边长4-5mm大小的松乳菇菌丝块，转入PDA培养基中，于25℃、120r/min条件下培养30天后，即得，菌落直径详见图1。
实施例8
本发明松乳菇菌根苗的人工合成方法包括以下步骤：选取侧根发达的松属植株幼苗，将实施例1制备得到的松乳菇菌丝分为10-15×5-10mm的菌丝块，每株松属植株幼苗根部表面分别放置2份菌丝块，同时添加5ml促生菌菌液1；将松属植株幼苗根部用培养基质包裹，置于根菌育苗盒中，于18-20℃，光照10000-20000lx，相对湿度90-95％的菌根苗培养室中培养14-30d，即得松乳菇菌根苗。
实施例9
本发明松乳菇菌根苗的人工合成方法包括以下步骤：选取侧根发达的松属植株幼苗，将实施例2制备得到的松乳菇菌丝分为边长10-15×5-10mm的菌丝块，每株松属植株幼苗根部表面分别放置2份菌丝块，同时添加5ml促生菌菌液2；将松属植株幼苗根部用培养基质包裹，置于根菌育苗盒中，于18-20℃，光照10000-20000lx，相对湿度90-95％的菌根苗培养室中培养14-30d，即得松乳菇菌根苗。
实施例10
本发明松乳菇菌根苗的人工合成方法包括以下步骤：选取侧根发达的松属植株幼苗，将实施例3制备得到的松乳菇菌丝分为边长10-15×5-10mm的菌丝块，每株松属植株幼苗根部表面分别放置2份菌丝块，同时添加5ml促生菌菌液3；将松属植株幼苗根部用培养基质包裹，置于根菌育苗盒中，于18-20℃，光照10000-20000lx，相对湿度90-95％的菌根苗培养室中培养14-30d，即得松乳菇菌根苗。
实施例11
本发明松乳菇菌根苗的人工合成方法包括以下步骤：选取侧根发达的松属植株幼苗，将实施例4制备得到的松乳菇菌丝分为边长10-15×5-10mm的菌丝块，每株松属植株幼苗根部表面分别放置2份菌丝块，同时添加5ml促生菌菌液3；将松属植株幼苗根部用培养基质包裹，置于根菌育苗盒中，于18-20℃，光照10000-20000lx，相对湿度90-95％的菌根苗培养室中培养14-30d，即得松乳菇菌根苗。
实施例12
本发明松乳菇菌根苗的人工合成方法包括以下步骤：选取侧根发达的松属植株幼苗，将实施例5制备得到的松乳菇菌丝分为边长10-15×5-10mm的菌丝块，每株松属植株幼苗根部表面分别放置2份菌丝块，同时添加5ml促生菌菌液3；将松属植株幼苗根部用培养基质包裹，置于根菌育苗盒中，于18-20℃，光照10000-20000lx，相对湿度90-95％的菌根苗培养室中培养14-30d，即得松乳菇菌根苗。
实施例13
本发明松乳菇菌根苗的人工合成方法包括以下步骤：选取侧根发达的松属植株幼苗，将实施例6制备得到的松乳菇菌丝分为10-15×5-10mm的菌丝块，每株松属植株幼苗根部表面分别放置2份菌丝块，同时添加5ml促生菌菌液(由促生菌菌液1和促生菌菌液3按体积比1:1混合得到)；将松属植株幼苗根部用培养基质包裹，置于根菌育苗盒中，于18-20℃，光照10000-20000lx，相对湿度90-95％的菌根苗培养室中培养14-30d，即得松乳菇菌根苗。
实施例14
本发明松乳菇菌根苗的人工合成方法包括以下步骤：选取侧根发达的松属植株幼苗，将实施例7制备得到的松乳菇菌丝分为边长10-15×5-10mm的菌丝块，每株松属植株幼苗根部表面分别放置2份菌丝块，同时添加5ml促生菌菌液(由促生菌菌液1、促生菌菌液2、促生菌菌液3按体积比1:1:1混合得到)；将松属植株幼苗根部用培养基质包裹，置于根菌育苗盒中，于18-20℃，光照10000-20000lx，相对湿度90-95％的菌根苗培养室中培养14-30d，即得松乳菇菌根苗。
试验例1
取实施例8-14制备得到的部分菌根，用真菌基因组DNA提取试剂盒提取菌根DNA，用ITS4和ITS5为引物进行PCR扩增，PCR产物测序后进行Blast比对，确认菌根为松乳菇菌根。制备得到的松乳菇菌根合成率均大于99％，杂菌与松属植株形成菌根的比例小于1％。
以上对本发明具体实施方式的描述并不限制本发明，本领域技术人员可以根据本发明作出各种改变或变形，只要不脱离本发明的精神，均应属于本发明权利要求保护的范围。

Claims (26)

1.松乳菇(Lactarius deliciosus)菌根促生菌，所述松乳菇菌根促生菌为蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)、保藏号为GDMCC No.63270，高山芽孢杆菌(Bacillus altitudinis)、保藏号为GDMCC No.63269，辣椒芽孢杆菌（Bacillus zanthoxyli）、保藏号为GDMCCNo.63271中的任一种或组合。
2.如权利要求1所述的松乳菇菌根促生菌用于促进松乳菇菌丝生长的应用。
3.如权利要求2所述的应用，具体包括如下步骤：
（1）取保存于4℃的促生菌划线接种于LB固体培养基，32-35℃培养24-48h，得活化的促生菌，再按照接种量为1-5%（w/v）接种于牛肉膏蛋白胨液体培养基中，30-35℃、160-200r/min振荡培养48-60h后，得促生菌菌液；
（2）将步骤（1）制得的促生菌菌液用0.22μm细菌过滤器过滤，收集上清滤液，得促生物添加液，将促生物添加液按体积比1:15-20加入到PDA培养基中混合，制得促生培养基；
（3）取边长4-5mm大小的松乳菇菌丝块，接种于20-25ml的步骤（2）制得的促生培养基中，20-25℃恒温培养40-55天，即得。
4.如权利要求3所述的应用，步骤（2）中，当促生菌为两种菌时，将各自的上清滤液按混合比例1-2:1-2混合得到促生物添加液。
5.如权利要求4所述的应用，步骤（2）中，当促生菌为两种菌时，将各自的上清滤液按混合比例1-1.5:1-1.5混合得到促生物添加液。
6.如权利要求5所述的应用，步骤（2）中，当促生菌为两种菌时，将各自的上清滤液按混合比例1:1混合得到促生物添加液。
7.如权利要求3所述的应用，步骤（2）中，当促生菌为三种菌时，将各自的上清滤液按混合比例1-2:1-2：1-2混合得到促生物添加液。
8.如权利要求7所述的应用，步骤（2）中，当促生菌为三种菌时，将各自的上清滤液按混合比例1-1.5:1-1.5:1-1.5混合得到促生物添加液。
9.如权利要求8所述的应用，步骤（2）中，当促生菌为三种菌时，将各自的上清滤液按混合比例1:1:1混合得到促生物添加液。
10.如权利要求3-9任一项所述的应用，所述PDA培养基含有20-25%的土豆，0.5-1%的葡萄糖，1-5%的琼脂，其余为蒸馏水。
11.如权利要求1所述的松乳菇菌根促生菌用于促进松乳菇菌根合成的应用。
12.如权利要求11所述的应用，具体包括如下步骤：
（1）选取侧根发达的松属植株幼苗，每株松属植株幼苗根部表面放置2份边长为10-15×5-10mm的松乳菇菌丝块，同时添加1-5ml促生菌菌液；
（2）将步骤（1）处理后的松属植株幼苗置于根菌育苗盒中，用培养基质覆盖根部，于18-20℃，光照10000-20000lx，相对湿度90-95%下培养14-30d，即得。
13.如权利要求12所述的应用，所述根菌育苗盒体积为5 cm×5 cm×20 cm。
14.如权利要求12所述的应用，所述松属植株幼苗的培养方法为，将松属植株种子清水浸泡36-48 h后，再将种子浸泡在浓度为30%的双氧水中处理30-60 min，过滤，种子用无菌水冲洗后，将其均匀置于培养筐中，种子表面覆盖1-3cm厚的种子萌发基质，定期浇水，设定昼长14-16h和夜长8-10 h、16-20 ℃条件下培养50-60天，即得松属植物幼苗，所述种子培养基质由珍珠岩︰蛭石按照体积比1-3︰1均匀混合而成。
15.如权利要求12所述的应用，所述培养基质由泥炭土：蛭石按照体积比为0.5-2：1均匀混合而成。
16.如权利要求12-15任一项所述的应用，松乳菇菌根合成率大于95%。
17.如权利要求16所述的应用，松乳菇菌根合成率大于99%。
18.如权利要求17所述的应用，松乳菇菌根合成率大于100%。
19.如权利要求12所述的应用，所述松乳菇菌丝的制备方法包括如下步骤：
（1）取保存于4℃的促生菌划线接种于LB固体培养基，35℃培养24-48h，得活化的促生菌，再按照接种量为1-5%（w/v）接种于牛肉膏蛋白胨液体培养基中，30-35℃、160-200r/min振荡培养48-60h后，得促生菌菌液；
（2）将步骤（1）制得的促生菌菌液用0.22μm细菌过滤器过滤，收集上清滤液，得促生物添加液，将促生物添加液按体积比1:15-20加入到PDA培养基中混合，制得促生培养基；
（3）取边长4-5mm大小的松乳菇菌丝块，接种于20-25ml的步骤（2）制得的促生培养基中，20-25℃恒温培养40-55天，即得。
20.如权利要求19所述的应用，步骤（2）中，当促生菌为两种菌时，将各自的上清滤液按混合比例1-2:1-2混合得到促生物添加液。
21.如权利要求20所述的应用，步骤（2）中，当促生菌为两种菌时，将各自的上清滤液按混合比例1-1.5:1-1.5混合得到促生物添加液。
22.如权利要求21所述的应用，步骤（2）中，当促生菌为两种菌时，将各自的上清滤液按混合比例1:1混合得到促生物添加液。
23.如权利要求19所述的应用，步骤（2）中，当促生菌为三种菌时，将各自的上清滤液按混合比例1-2:1-2：1-2混合得到促生物添加液。
24.如权利要求23所述的应用，步骤（2）中，当促生菌为三种菌时，将各自的上清滤液按混合比例1-1.5:1-1.5:1-1.5混合得到促生物添加液。
25.如权利要求24所述的应用，步骤（2）中，当促生菌为三种菌时，将各自的上清滤液按混合比例1:1:1混合得到促生物添加液。
26.如权利要求19所述的应用，所述PDA培养基含有20-25%的土豆，0.5-1%的葡萄糖，1-5%的琼脂，其余为蒸馏水。
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