CN103805593B - 低能n+注入诱变选育猴头菇菌株的方法及所选育的菌株 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种低能N⁺注入诱变选育猴头菇菌株的方法及所选育的菌株，菌株保藏编号为CGMCC No.8610；选育方法包括筛选进行诱变的猴头菇出发菌株、选择猴头菇出发菌株的原生质体作为低能氮离子注入诱变的材料、氮离子注入诱变、诱变菌株的筛选、遗传性状稳定性验证等步骤。本发明诱变出一株子实体产量高于原菌株的猴头菇新菌株，提高了猴头菇的产量，可以创造很好的经济效益。

Description

低能N+注入诱变选育猴头菇菌株的方法及所选育的菌株

技术领域

本发明涉及生物工程和食药用菌技术领域，具体涉及使用低能氮离子注入诱变选育猴头菇子实体高产菌株的方法，以及由上述方法得到的一株子实体产量高的诱变猴头菇菌株。

背景技术

猴头菇为属于真菌界、担子菌门、伞菌亚门、伞菌纲、红菇目、猴头菇科、猴头菇属猴头菇，学名：Hericium erinaceus，其子实体是产品进行深加工的主要原料之一。现在众多研究已经证实猴头菇具有具提高免疫力、抗肿瘤、抗衰老、降血脂等多种生理功能，尤其是其具有独特的抗溃疡作用。它对胃黏膜上皮的再生和修复起重要作用，能增强胃黏膜屏障机能，对胃胀、嗳气、泛酸、大便隐血、食欲不振以及消化道类疾病等均有良好的治疗作用，临床广泛应用于对消化系统等各种疾病的治疗之中。猴头菇子实体的市场需求量很大，虽然目前猴头菇品种不少，但缺乏产量高、生物性状优良的菌种。因此，菌种的选育方面的研究就显得尤为重要了，自然选育的效率较低，而采取人工选育的方法效果较好，经过多年的研究实践，以子实体产量和农艺性状为主要目标的菌种选育己从最初的选择育种、杂交育种发展到人工诱变育种、原生质体融合育种、以及运用分子生物学技术进行育种等，在食用菌育种方法上推陈出新、不断改进，育种效率不断提高。目前猴头菇方面的菌种选育研究开展的不多，有利用紫外诱变选育猴头菇的报道，但是诱变选育效率不高，新菌种产量提升不明显，效果不显著，本发明采用低能氮离子注入诱变猴头菇高产菌株有别于其它诱变育种方法，大大提高了猴头菇等食用菌菌种选育的效率。

离子束作为一种应用于生物育种的研究始于上世纪80年代，离子束具有质量、能量双重诱变效应的特征，不同于以往的射线辐射，离子注入引发的生物效应，既有能量沉积、动量传递，又有元素质量沉积，首先有能量沉积，即注入离子与生物大分子发生一系列碰撞，生物大分子获得能量时，生物基因键断裂，DNA分子击出原位，留下断键或缺陷，注入元素有一定几率同基因断键或DNA被打出的缺位相结合，伴随各种元素的生化反应，产生基因突变和染色体变异；注入离子和靶细胞的电荷交换，可导致细胞表面被刻蚀，引起细胞膜透性和膜电位的改良；离子束打入生物体产生Braag峰，具有较强的电离作用，还能产生活性较高的自由基间接损伤作用，因此它对生物体的作用可导致较高的突变率，另外由于注入离子的不同电荷数、质量数、能量、剂量组合，提供了众多诱变条件，通过这种电、能、质的联合作用，强烈影响生物细胞的生理生化特性，以引起基因突变，所以变异幅度大，有较高的突变率，较广的突变谱，突变体的遗传性能比较稳定，回复突变率低。

目前尚未见到有关采用低能氮离子注入技术诱变猴头菇菌株的任何报道。

发明内容：

本发明的目的在于提供一种可选育出高产猴头菇菌株的低能N⁺注入诱变选育猴头菇菌株的方法及所选育的菌株。

本发明的技术解决方案是：

一种低能N⁺注入诱变选育猴头菇菌株的方法，其特征是：依次包括下列步骤：

(1)筛选进行诱变的猴头菇出发菌株：选择多种不同的猴头菇生产菌种，进行猴头菇栽培，选择猴头菇子实体产量最高的猴头菇菌株作为诱变的出发菌株；

(2)选择猴头菇出发菌株的原生质体作为低能氮离子注入诱变的材料：制成浓度为10⁵个/ml级的猴头菇原生质体悬液，取0.1ml的原生质体悬液涂布于无菌培养皿中，涂匀风干；

(3)氮离子注入诱变：对步骤(2)涂布于培养皿中的材料立即进行氮离子注入诱变，然后用用0.6mol/l的蔗糖溶液洗脱，涂布于猴头菇再生培养基上培养；

(4)诱变菌株的筛选：待菌落长成后，挑选菌丝粗壮浓密、生长快的菌丝进行液体发酵试验，然后进行菌丝生物量的测定，选择生物量高于出发菌株5％以上的菌株保存于试管中作为初筛后的诱变菌种；然后将经过上述筛选后得到的菌种与出发菌株同时进行猴头菇栽培试验，选择生物转化率高于对照菌株5%以上的菌株作为复筛后的诱变菌株；

(5)遗传性状稳定性验证：将经过上述诱变筛选后得到的菌株连续传代20代，然后进行栽培试验，选择产量稳定、性状无明显变化的菌株，最终确定为用于生产的猴头菇高产新菌株。

所述的氮离子注入条件为注入能量为20KeV，注入剂量为9×10¹⁴ions/cm²。，靶室真空度为10^-3pa，以5s脉冲式注入，间隔为l5s。

液体培养基：马铃薯汁200g，葡萄糖20g，蛋白胨5g，酵母膏1g，MgSO₄ 0.5g，KH₂PO₄1g，水1000ml，pH5.5。

原生质体再生培养基：麦芽糖10g,葡萄糖4g,蛋白胨5g,酵母粉4g,琼脂20g，0.6mol/l蔗糖溶液1000ml，pH5.0。

一种低能N⁺注入诱变选育猴头菇菌株的方法所选育的菌株，其特征是：保藏编号为 CGMCC No.8610；分类命名：猴头菇，拉丁文学名：Hericium erinaceus。保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路l号院3号，保藏日期2013年12月19日。

本发明的优点及积极效果是：

l、以往猴头菇等食用菌菌种的育种通常采用杂交育种和紫外诱变育种等手段进行，有诱变效率低、易导致负突变、遗传性状不稳定等缺点，而通过采用离子注入技术诱变猴头菇原生质体来进行菌株的选育，提高了诱变的效率和正突变的机率，并且诱变后的猴头菇菌株不易发生退化。采用本发明诱变出一株子实体产量高于原菌株的猴头菇新菌株，提高了猴头菇的产量，可以创造很好的经济效益。

2、本发明利用氮离子注入技术对猴头菇原生质体进行诱变，并经不同剂量的氮离子注入后，在最适剂量9×10¹⁴ions/cm²。下，筛选到一株遗传性状稳定的猴头菇子实体高产新菌株。其液体发酵菌丝体生物产量比原菌株高15.8%，子实体生物转化率比出发菌株提高了12.5%。结果表明，离子注入技术能够应用于猴头菇高产菌株的诱变选育中，并且具有较高的突变率和较宽的突变谱，诱变效果好，是一种比较理想的食用菌菌种选育方法。

下面结合实施例对本发明作进一步说明。

低能氮离子注入诱变猴头菇子实体菌株，保藏编号为CGMCC No.8610；分类命名：猴头菇，拉丁文学名：Hericium erinaceus，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路l号院3号，保藏日期20 l 3年1 2月19日。

具体实施方式：

一种低能氮离子注入诱变选育猴头菇菌株的方法，其步骤是：

l、出发菌株的筛选

从国内各猴头菇主产区引进不同品种的猴头菇菌种(包括猴头菇CAHHFT-703，CAHHFT-705，CAHHFT-706，CAHHFT-707，CAHHFT-7010，CAHHFT-708，江苏省苏微微生物研究有限公司保藏品种He12，以及由山东金乡真菌研究所引进的猴头菇)。接种于猴头菇固体斜面培养基上(培养基配方见下)，26℃避光培养9天进行活化。将活化后的菌株接种于固体培养基平面的中央，记录猴头菇菌丝萌发的时间，用十字交叉法测定菌丝生长速度，观察菌丝的形态(菌丝粗细、浓密)。接着进行猴头菇液体发酵试验，斜面菌种接种至液体培养基中(培养基配方见下)，140转/分旋转式摇床，28℃避光培养9天，4000转/分钟离心10分钟，收集菌丝体，90℃烘干至恒重，测定其质量，即为猴头菇液体发酵生物量。

同时进行猴头菇的栽培，其具体的过程为：将猴头菇的斜面菌种接种于猴头菇种子液培养基中(种子液培养基配方见下)，l40转/分旋转式摇床，26℃避光培养7天，以2%的接种量接种于灭菌后的猴头菇栽培培养基中，25℃避光培养约40天左右，待菌丝长满菌袋后，搬至出菇房进行出菇管理。室温控制在18～22℃，湿度80%，定时通风，光照强度200lx左右，待原基分化扭结形成幼菇长至1～2cm高时，进行出菇管理。这时湿度提高至85%-90%，增加通风，每天通风2～3次，每次1小时左右。等到猴头菇肉质团块的表面出现菌刺，长度约0.5厘米左右开始采收。统计鲜菇产量，计算生物学效率。

计算猴头菇的生物转化率，以猴头菇子实体产量最高，生物转化率最高者作为猴头菇出发菌株。同时通过统计发现，猴头菇子实体的产量与猴头菇菌丝在固体平面培养基上的形态以及液体发酵生物量的大小有相关性。在猴头菇固体培养基上菌丝粗壮浓密且生长速度快、液体发酵生物量越大者其猴头菇子实体产量高。试验最终确定以猴头菇CAHHFT-7010作为氮离子注入诱变的出发菌株。

2、低能氮离子注入诱变

(1)样品前处理 将猴头菇菌块接种于液体培养基中(放置适量玻璃珠)26℃静置培养7天，并定时摇晃。用灭菌后的250目铜网筛，过滤收集猴头菇菌丝，用2%的溶壁酶，以500mg湿菌丝加入5ml酶液，28℃酶解4小时，8层擦镜纸过滤收集滤液，0.6mol/l的蔗糖溶液洗涤离心3次，然后用0.6mol/l的蔗糖配制成浓度为10⁵个/ml级的猴头菇原生质体悬液。吸取0.1ml的原生质体悬液于无菌培养皿中，立即快速涂匀风干；经镜检无孢子重叠后，立即进行低能氮离子注入。

(2)离子注入条件：注入能量为20KeV，注入剂量为0、30、60、90、120、l50、l80、200×10¹³ions/cm²，靶室真空度为l0^-3Pa，以5s脉冲式注入，间隔为15s。计算其在各剂量下的存活率曲线。结果显示随着注入剂量的增加，存活量呈现先降低、后升高再降低的“马鞍型”变化趋势。可能是由于低剂量离子注入细胞的射程较短，离子只对细胞表面进行损伤和刻蚀，因而存活率较高；随着剂量的增加，细胞表面的刻蚀严重，离子损及细胞内部并产生大量的自由基等，致使存活率急剧下降；但下降到一定值时出现饱和现象，当剂量累积到一定值时，细胞某种修复机制被激活，存活率有所回升；当剂量继续增加时，细胞损伤将无法修复。

(3)样品的后处理：将经过氮离子注入的培养皿和对照处理(离子注入时盖上培养皿盖子，其余条件相同)的培养皿用1mL0.6mol/L的蔗糖溶液洗脱，取0.1m1涂布于猴头菇再生培养基上，26℃避光培养120h后计数，以计算存活量。存活量为经氮离子注入处理后存活的菌落数。然后以注入剂量为横坐标，存活量为纵坐标，绘制存活量与注入剂量的关系曲线。

3、子实体高产菌株的筛选

(1)初筛：将经离子束注入后的培养皿用1mL0.6mol/L的蔗糖溶液洗脱，取0.1ml涂布于猴头菇再生平板上，待菌落长成后，挑选菌丝粗壮浓密、生长较快的菌丝进行液体发酵试验，4000r/min离心，收集菌丝体，90℃烘干至恒重，称量即为菌丝体生物量，然后进行菌丝生物量的比较，选择生物量高于出发菌株5%以上的菌株保存于试管中作为初筛的诱变菌种。

(2)复筛：将经过初筛后的菌种与出发菌株同时进行猴头菇栽培试验，方法参见步骤l，计算猴头菇菌株的生物转化率，选择生物转化率高于对照菌株5%以上的菌株作为复筛后的诱变高产菌株。

4、氮离子注入对菌株突变率的影响

以出发菌株作为对照，随机挑取接受离子注入诱变后形成的菌落分别进行液体发酵试验，每个剂量挑取20个菌株，考察菌株的生物量。高于对照5%以上的为正突变，低于对照5%以上的为负突变，正突变的菌落数占所取菌落总数的比值为正突变率，负突变的菌落数占所取菌落总数的比值为负突变率，结果发现在剂量0.6×l0¹⁵ions/cm²～1.2×l0¹⁵ions/cm²内正突变率较高，在剂量9×10 l0¹⁴ions/cm²，正突变率最高，因此选取剂量9×10 l0¹⁴ions/cm²作为离子注入诱变的最适剂量。结果见表1。

表l 氮离子注入剂量对猴头菇菌株突变率的影响

5、遗传稳定性验证：将经过上述诱变筛选后得到的菌株在固体培养基上进行20次传代，然后再进行猴头菇栽培试验，与第一代比较，选择子实体产量稳定(即各代菌株的产量之间不存在显著性差异，统计学分析，方差p>0.05)、性状无变化的菌株作为最终的猴头菇诱变高产菌株。最终筛选到一株子实体高产猴头菇诱变菌株，比原菌株产量高12.5％，遗传性状稳定，保藏编号为CGMCC No.8610。

培养基配方：

固体培养基：马铃薯200g(煮汁过滤)，G20g，蛋白胨5g，酵母膏1g，MgSO₄ 0.5g，KH₂PO₄ 1g，琼脂20g，水1000ml，pH5.5。

液体培养基：马铃薯200g(煮汁过滤)，G20g，蛋白胨5g，酵母膏1g，MgSO₄ 0.5g，KH₂PO₄ 1g，水1000ml，pH5.5。

原生质体再生培养基：麦芽糖10g,葡萄糖4g,蛋白胨5g,酵母粉4g,琼脂20g，0.6mol/L蔗糖溶液1000ml，pH5.0。

种子液配方：玉米粉20g，豆饼粉20g，葡萄糖20g，MgSO₄ 0.5g，KH₂PO₄ 1g，V_bl100mg，水1000ml，pH5.5。

栽培培养基：棉籽壳83%,，麸皮15%、蔗糖l%、石膏粉l%、料水比1：1.5， (水分的含量以用手用力挤压可挤出1～2滴为宜)。

Claims (1)

1.一种猴头菇菌株(Hericium erinaceus)，其特征是：保藏编号为CGMCC No.8610。