CN102067788B - 低能n+注入诱变选育灵芝菌株的方法及所选育的菌株 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种低能N⁺注入诱变选育灵芝菌株的方法及所选育的菌株，菌株保藏编号为CGMCC No.4191；其诱变选育步骤包括：收集原灵芝孢子粉制成悬液，涂布于培养皿中，风干，以一定的剂量对材料进行N⁺离子注入诱变，将诱变后的孢子制成悬液，涂布于培养基上进行培养，灵芝孢子萌发后形成菌落，对其进行筛选培养和灵芝栽培试验，最后得到一株新灵芝菌株，子实体产量高于原菌株15.9％，子实体多糖和三萜含量分别比出发菌株高6.41％、19.99％。

Description

低能N+注入诱变选育灵芝菌株的方法及所选育的菌株

技术领域：

本发明涉及涉及生物工程和食药用菌技术领域，具体涉及使用低能N⁺离子注入诱变选育灵芝子实体高产菌株的方法，以及由上述方法得到的一株子实体产量高的诱变灵芝菌株。 

背景技术

灵芝为担子菌纲多孔菌科灵芝属真菌，其中目前开发应用最广的是赤芝，其子实体则是进行深加工的主要原料之一。现在众多研究已经证实灵芝具有调节免疫、抗氧化、抗缺氧、抗放射、抗化疗、抗心肌缺血作用和抗衰老作用以及镇静作用、强心、调节血脂作用、降血糖、平喘、保肝、等作用，广泛应用于临床对各种疾病的治疗之中。而产量高、生物性状优异的灵芝菌种是保障灵芝生产和促进灵芝产业发展的先决条件，从野外分离的灵芝菌种大多产量不高，需要经过人工驯化和不断的选育，以提高灵芝的产量和生产性状，因此，菌种的选育方面的研究就显得尤为重要了。自然选育的效率较低，而采取人工选育的方法效果较好，经过多年的研究实践，以子实体产量和农艺性状为主要目标的菌种选育已从最初的选择育种、杂交育种发展到人工诱变育种、原生质体融合育种、以及运用分子生物学技术进行育种等，在食用菌育种方法上推陈出新、不断改进，育种效率不断提高。如山东微生物技术国家重点实验室2002年对原“山大1号”平菇菌株进行紫外诱变育种获得成功， 新菌株株型美观，抗杂能力强，转潮快，生物学效率较原始菌株得到显著提高。目前灵芝方面的菌种选育研究开展的不多，有利用紫外诱变选育灵芝的报道，但是诱变选育效率不高，新菌种产量提升不明显，效果不显著，本发明采用低能N⁺离子注入诱变灵芝高产菌株有别于其它诱变育种方法，提高了灵芝等食用菌菌种选育的效率。 

离子束作为一种应用于生物育种的研究始于上世纪80年代，离子束具有质量、能量双重诱变效应的特征，不同于以往的射线辐射，离子注入引发的生物效应，既有能量沉积、动量传递，又有元素质量沉积，首先有能量沉积，即注入离子与生物大分子发生一系列碰撞，生物大分子获得能量时，生物基因键断裂，DNA分子击出原为，留下断键或缺陷，注入元素有一定几率同基因断键或DNA被打出的缺位相结合，伴随各种元素的生化反应，产生基因突变和染色体变异；注入离子和靶细胞的电荷交换，可导致细胞表面被刻蚀，引起细胞膜透性和膜电位的改良；离子束打入生物体产生Braag峰，具有较强的电离作用，还能产生活性较高的自由基间接损伤作用，因此它对生物体的作用可导致较高的突变率，另外由于注入离子的不同电荷数、质量数、能量、剂量组合，提供了众多诱变条件，通过这种电、能、质的联合作用，强烈影响生物细胞的生理生化特性，以引起基因突变，所以变异幅度大，有较高的突变率，较广的突变谱，突变体的遗传性能比较稳定，回复突变率低。 

目前尚未见到有关采用低能N⁺离子注入技术诱变灵芝菌株的任何报道。 

发明内容：

本发明的目的在于提供一种可选育出高产菌株的低能N⁺注入诱变选育灵芝菌株的方法及所选育的菌株。 

本发明的技术解决方案是： 

一种低能N⁺离子注入技术诱变灵芝子实体菌株，其特征是：保藏编号为CGMCC No.4191；分类命名：灵芝，拉丁文学名：lucidum，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期2010年10月9日。 

一种低能N⁺注入诱变选育灵芝菌株的方法，其特征是：依次包括下列步骤： 

(1)筛选要诱变的灵芝出发菌株：选择多种不同的灵芝生产菌种，进行灵芝栽培，挑选灵芝子实体产量最高的灵芝菌株作为诱变的出发菌株； 

(2)选择灵芝孢子作为低能N⁺离子注入诱变的材料：收集出发菌株的新鲜灵芝孢子粉，用氯胺T溶液处理，再用无菌水洗涤稀释成孢子悬液，涂布于培养皿中进行N⁺离子注入诱变； 

(3)N⁺离子注入诱变：对步骤(2)涂布于培养皿中的材料进行N⁺离子注入诱变，然后用无菌水洗脱，涂布于PDA平面培养基上培养； 

(4)诱变菌株的筛选：诱变菌株的筛选：将经离子束注入后的平板用无菌水洗脱，涂布于PDA平板上，待菌落长成后，挑选菌丝粗壮浓密、生长较快的菌丝进行液体发酵试验，然后进行菌丝生物量的测定，并选择生物量高于出发菌株5％重量以上的菌株保存于试管中作为初筛的诱变菌种；然后将经过初筛后的菌种与出发菌株同时进行灵芝栽培试 验，选择生物转化率高于对照菌株5％以上的菌株作为诱变的高产菌株； 

(5)遗传性状稳定性验证：将上述诱变筛选后的菌株连续传代20代，然后进行栽培试验，产量稳定、性状无变化的最终确定为用于生产上的新的诱变灵芝子实体菌株。 

所述的N⁺离子注入条件为注入能量为20KeV，注入剂量为1.25×10¹⁶ions/cm²，靶室真空度为10^-3Pa，以5s脉冲式注入，间隔为15s。 

PDA培养基的为：马铃薯200g煮汁，葡萄糖20g，KH₂PO₄ 10g，MgSO₄5g，H₂O 1000ml； 

液体发酵培养基为：葡萄糖20g，玉米粉20g，豆饼粉20g，KH₂PO₄ 10g，MgSO₄ 5g，V_B1 100mg，H₂O 1000ml。 

步骤(1)所述的多种不同的灵芝生产菌种中包含有美国大灵芝，并选择美国大灵芝作为诱变的出发菌株。 

一种低能N⁺注入诱变选育灵芝菌株的方法所选育的菌株，其特征是：保藏编号为CGMCC No.4191；分类命名：灵芝，拉丁文学名：lucidum，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期2010年10月9日。 

本发明的优点及积极效果是： 

1、以往灵芝等食用菌菌种的育种通常采用杂交育种和紫外诱变育种等手段进行，有诱变效率低、易导致负突变、遗传性状不稳定等缺点，而通过采用离子注入技术诱变灵芝等食用菌孢子来进行菌株的选育，提高了诱变的效率和正突变的机率，并且诱变后的灵芝菌株不易发生退化。采用本发明诱变出一株子实体产量高于原菌株的灵芝诱变菌株，提 高了灵芝的产量，可以创造了很好的经济效益。 

2、本发明利用N⁺离子注入技术对灵芝孢子进行诱变，并经不同剂量的N⁺离子注入后，在最适剂量1.25×10¹⁶ions/cm²下，筛选到一株遗传性状稳定的灵芝子实体高产菌株，其子实体产量指标：比出发菌株提高了15.9％，子实体多糖和三萜含量分别比出发菌株高6.41％、19.99％。。结果表明，离子注入技术能够应用于灵芝高产菌株的诱变选育中，并且具有较高的突变率和较宽的突变谱，诱变效果好，是一种比较理想的食用菌菌种选育方法。 

下面结合实施例对本发明作进一步说明。 

低能N⁺离子注入技术诱变灵芝子实体菌株，保藏编号为CGMCCNo.4191；分类命名：灵芝，拉丁文学名：Ganoderma lucidum，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期2010年10月9日。 

具体实施方式：

一种低能N⁺注入诱变选育灵芝菌株的方法，其步骤是： 

1、出发菌株的筛选 

从国内各省灵芝主产区引进不同品种的灵芝菌种(包括美国大灵芝、泰山灵芝、韩国灵芝、信州灵芝、惠州灵芝、日本红芝、日本平芝、京大灵芝、甜芝、G-F1、G-F2、G-902、韩国红芝等)。接种于PDA斜面培养基上，28℃避光培养7天进行活化。将活化的菌株接种于装有PDA培养基培养皿的中央，记录灵芝菌丝萌发的时间，测定其生长速度，观 察菌丝的形态(菌丝粗细、浓密)。接着进行灵芝液体发酵试验，斜面菌种接种至液体培养基中(培养基配方见下)，140转/分旋转式摇床28℃避光培养7天，然后转接于发酵培养基中，140转/分旋转式摇床28℃避光培养3天，4000转/分离心5分钟，收集菌丝体，65℃烘干至恒重，测定其质量得灵芝液体发酵生物量。 

同时进行灵芝的栽培，其具体的过程为：将灵芝的斜面菌种接种于灵芝液体培养基中(液体培养基配方见下)，140转/分旋转式摇床，28℃避光培养7天，以2％的接种量接种于灭菌后的灵芝固体培养基，26℃避光培养约40天左右，待菌丝长满菌袋后，搬至出菇房进行出菇管理，空气相对湿度85％～95％，温度30℃，散射光处理，经常通风换气，菌丝形成原基，分化形成子实体，等灵芝子实体菌盖边缘由白转黄时，用牛皮纸袋套于灵芝子实体上收集灵芝孢子粉。同时进行管理，待灵芝子实体完全成熟时采收，统计灵芝的产量，计算灵芝的生物转化率，以灵芝子实体产量最高，生物转化率最高者作为灵芝出发菌株。同时通过统计发现，灵芝子实体的产量与灵芝菌丝在PDA平面培养基上的形态以及液体发酵生物量的大小有相关性。在PDA平面上菌丝粗壮浓密且生长速度快、液体发酵生物量越大者其灵芝子实体产量高。试验最后确定以美国大灵芝作为诱变的出发菌株。 

2、低能N⁺离子注入诱变 

(1)样品前处理取0.02克出发菌株的孢子粉，用5％的氯胺T溶液浸泡5ml处理5分钟，4000r/min离心，然后用无菌水洗涤离心3次，定容至10ml，稀释制成浓度为10⁴级的孢子悬液。取0.1ml涂布于培养 皿中，无菌风风干经镜检无孢子重叠后立即进行低能N⁺离子注入。 

(2)离子注入条件：注入能量为20KeV，注入剂量为0、25、50、100、125、150、175、200、250×10¹⁴ions/cm²，靶室真空度为10^-3Pa，以5s脉冲式注入，间隔为15s。计算其在各剂量下的存活率曲线。其结果见图1。图1显示，随着注入剂量的增加，存活量呈现先降低、后升高再降低的“马鞍型”变化趋势。可能是由于低剂量离子注入细胞的射程较短，离子只对细胞表面进行损伤和刻蚀，因而存活率较高；随着剂量的增加，细胞表面的刻蚀严重，离子损及细胞内部并产生大量的自由基和软射线等，致使存活率急剧下降；但下降到一定值时出现饱和现象，当剂量累积到一定值时，细胞某种修复机制被激活，存活率有所回升；当剂量继续增加时，细胞孙损伤将无法修复。 

(3)样品的后处理：将经过N⁺离子注入的培养皿和真空对照的培养皿用1ml无菌水洗脱，取0.1ml涂布于PDA平板上，28℃避光培养72h后计数，以计算存活量。存活量为经N⁺离子注入处理的存货菌落数。然后以注入剂量为横坐标，存活量为纵坐标，绘制存活量与注入剂量的关系曲线。 

3、子实体高产菌株的筛选 

(1)初筛：将经离子束注入后的平板用无菌水洗脱，取0.1ml涂布于PDA平板上，待菌落长成后，挑选菌丝粗壮浓密、生长较快的菌丝进行液体发酵试验，然后进行菌丝生物量的测定，并选择生物量高于出发菌株5％重量以上的菌株保存于试管中作为初筛的诱变菌种 

(2)复筛：将经过初筛后的菌种与出发菌株同时进行灵芝栽培试验， 方法参见1，计算灵芝菌株的生物转化率，选择生物转化率高于对照菌株5％以上的菌株作为诱变的高产菌株。 

4、N⁺离子注入对菌株突变率的影响 

以出发菌株作为对照，随机挑取接受离子注入诱变后形成的菌落分别进行液体发酵试验，每个剂量挑取20个菌株，考察菌株的生物量。高于对照5％以上的为正突变，低于对照5％以上的为负突变，正突变的菌落数占所取菌落总数的比值为正突变率，负突变的菌落数占所取菌落总数的比值为负突变率，结果发现在剂量1.0×10¹⁶ions.cm^-2～1.5×10¹⁶ions.cm^-2之内正突变率较高，在剂量1.25×10¹⁶ions.cm^-2，正突变率最高，因此选取剂量1.25×10¹⁶ions.cm^-2作为离子注入诱变的最适剂量。结果见表1。 

表1 N⁺离子注入剂量对灵芝菌株突变率的影响 

5、遗传稳定性验证 

1、将诱变筛选后得到的菌株进行20次传代，然后再进行灵芝栽培试验，与第一代比较，选择子实体产量稳定(即各代菌株的产量之间不存在显著性差异，统计学分析，方差p＞0.05)、性状无变化的作为最终的灵芝诱变高产菌株。最终筛选到一株子实体高产灵芝诱变菌株，比原菌株产量高15.9％，遗传性状稳定，保藏编号为CGMCC No.4191。 

培养基配方： 

PDA培养基：马铃薯200g煮汁，葡萄糖20g，KH₂PO₄ 10g，MgSO₄ 5g，H₂O1000ml。 

液体培养基：葡萄糖20g，玉米粉20g，豆饼粉20g，KH₂PO₄ 10g，MgSO₄ 5g，V_B1 100mg，H₂O 1000ml。 

发酵培养基：葡萄糖20g，玉米粉20g，豆饼粉20g，KH₂PO₄ 10g，MgSO₄ 5g，V_B1 100mg，H₂O 1000ml。 

固体栽培培养基：麸皮15％、蔗糖1％、石膏粉1％、水分微量(水分的含量以用手用力挤压可挤出1～2滴为宜)，余量(约83％)为棉籽壳。 

Claims (1)

1.一种低能N⁺注入诱变选育灵芝菌株的方法所选育的灵芝(Ganoderma lucidum)子实体菌株AHSWG No.1018，其特征是：保藏编号为CGMCC No.4191。