CN102653725B - 一种凝结芽孢杆菌及其在混合发酵产l-乳酸中的应用 - Google Patents
一种凝结芽孢杆菌及其在混合发酵产l-乳酸中的应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN102653725B CN102653725B CN201210172600.7A CN201210172600A CN102653725B CN 102653725 B CN102653725 B CN 102653725B CN 201210172600 A CN201210172600 A CN 201210172600A CN 102653725 B CN102653725 B CN 102653725B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- bacillus coagulans
- mixing
- water
- fermentation
- lactic acid
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
- JVTAAEKCZFNVCJ-REOHCLBHSA-N L-lactic acid Chemical compound C[C@H](O)C(O)=O JVTAAEKCZFNVCJ-REOHCLBHSA-N 0.000 title claims abstract description 74
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 title claims abstract description 62
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 title claims abstract description 62
- 241000193749 Bacillus coagulans Species 0.000 title claims abstract description 58
- 229940054340 bacillus coagulans Drugs 0.000 title claims abstract description 57
- 239000008103 glucose Substances 0.000 claims abstract description 31
- 238000011218 seed culture Methods 0.000 claims abstract description 21
- 244000199866 Lactobacillus casei Species 0.000 claims abstract description 6
- 235000013958 Lactobacillus casei Nutrition 0.000 claims abstract description 6
- 229940017800 lactobacillus casei Drugs 0.000 claims abstract description 6
- 239000002609 medium Substances 0.000 claims description 46
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Chemical compound OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 claims description 38
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 35
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims description 33
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims description 33
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 claims description 32
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 claims description 32
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 claims description 32
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 claims description 32
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 claims description 32
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 26
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 claims description 26
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims description 25
- 229910017053 inorganic salt Inorganic materials 0.000 claims description 24
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 claims description 24
- QJGQUHMNIGDVPM-UHFFFAOYSA-N nitrogen group Chemical group [N] QJGQUHMNIGDVPM-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 24
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 23
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 claims description 16
- 239000008272 agar Substances 0.000 claims description 16
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims description 14
- 238000011534 incubation Methods 0.000 claims description 14
- WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M Potassium chloride Chemical compound [Cl-].[K+] WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 12
- 239000001103 potassium chloride Substances 0.000 claims description 12
- 235000011164 potassium chloride Nutrition 0.000 claims description 12
- 159000000000 sodium salts Chemical class 0.000 claims description 12
- 159000000003 magnesium salts Chemical class 0.000 claims description 11
- 150000003016 phosphoric acids Chemical class 0.000 claims description 11
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 claims description 9
- 239000008107 starch Substances 0.000 claims description 9
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 claims description 9
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 claims description 8
- 240000007594 Oryza sativa Species 0.000 claims description 4
- 235000007164 Oryza sativa Nutrition 0.000 claims description 4
- 235000009566 rice Nutrition 0.000 claims description 4
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 claims description 3
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 claims description 3
- 239000000843 powder Substances 0.000 claims description 3
- 210000000582 semen Anatomy 0.000 claims description 3
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 claims description 3
- 239000012531 culture fluid Substances 0.000 claims description 2
- 238000012216 screening Methods 0.000 abstract description 24
- 239000004310 lactic acid Substances 0.000 abstract description 20
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N nitrogen Substances N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract description 18
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 abstract description 10
- KDYFGRWQOYBRFD-UHFFFAOYSA-N succinic acid Chemical compound OC(=O)CCC(O)=O KDYFGRWQOYBRFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract 2
- 238000002347 injection Methods 0.000 abstract 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 abstract 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 abstract 1
- 239000001384 succinic acid Substances 0.000 abstract 1
- JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-N lactic acid Chemical compound CC(O)C(O)=O JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 40
- CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L Magnesium sulfate Chemical compound [Mg+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 32
- 235000014655 lactic acid Nutrition 0.000 description 19
- 235000019341 magnesium sulphate Nutrition 0.000 description 16
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 15
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 14
- 238000005468 ion implantation Methods 0.000 description 11
- 238000000034 method Methods 0.000 description 11
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 11
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 11
- VTYYLEPIZMXCLO-UHFFFAOYSA-L Calcium carbonate Chemical compound [Ca+2].[O-]C([O-])=O VTYYLEPIZMXCLO-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 8
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 8
- 239000000047 product Substances 0.000 description 8
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 5
- 229910000019 calcium carbonate Inorganic materials 0.000 description 4
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 4
- 239000006481 glucose medium Substances 0.000 description 4
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 4
- 230000003068 static effect Effects 0.000 description 4
- 235000013351 cheese Nutrition 0.000 description 3
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 3
- -1 feed Substances 0.000 description 3
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 description 3
- 239000008267 milk Substances 0.000 description 3
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 description 3
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 3
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 description 2
- 241000186660 Lactobacillus Species 0.000 description 2
- 244000061176 Nicotiana tabacum Species 0.000 description 2
- 235000002637 Nicotiana tabacum Nutrition 0.000 description 2
- 241001192924 Parna Species 0.000 description 2
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 238000002513 implantation Methods 0.000 description 2
- 229940039696 lactobacillus Drugs 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 2
- 231100000219 mutagenic Toxicity 0.000 description 2
- 230000003505 mutagenic effect Effects 0.000 description 2
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 2
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 2
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 238000003794 Gram staining Methods 0.000 description 1
- 208000002682 Hyperkalemia Diseases 0.000 description 1
- 108090000723 Insulin-Like Growth Factor I Proteins 0.000 description 1
- 241000235527 Rhizopus Species 0.000 description 1
- 240000005384 Rhizopus oryzae Species 0.000 description 1
- 235000013752 Rhizopus oryzae Nutrition 0.000 description 1
- 102000013275 Somatomedins Human genes 0.000 description 1
- 241000194017 Streptococcus Species 0.000 description 1
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 1
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 1
- 235000019504 cigarettes Nutrition 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 230000009514 concussion Effects 0.000 description 1
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 1
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 1
- 239000000796 flavoring agent Substances 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 235000013355 food flavoring agent Nutrition 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 230000002070 germicidal effect Effects 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 238000010884 ion-beam technique Methods 0.000 description 1
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 238000000386 microscopy Methods 0.000 description 1
- 230000000394 mitotic effect Effects 0.000 description 1
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 235000016709 nutrition Nutrition 0.000 description 1
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 1
- 150000007524 organic acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000005022 packaging material Substances 0.000 description 1
- 230000035479 physiological effects, processes and functions Effects 0.000 description 1
- 229920001432 poly(L-lactide) Polymers 0.000 description 1
- 229920000747 poly(lactic acid) Polymers 0.000 description 1
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 1
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 1
- 238000012827 research and development Methods 0.000 description 1
- 239000003206 sterilizing agent Substances 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 239000004753 textile Substances 0.000 description 1
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 description 1
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 description 1
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 description 1
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 description 1
- 150000003722 vitamin derivatives Chemical class 0.000 description 1
Landscapes
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
本发明公开一株凝结芽孢杆菌BC-N6242，保藏号登记号为：CCTCC M 2012156。本发明采用低能氮离子注入诱变凝结芽孢杆菌，分别利用高糖平板、琥珀酸平板、纯乳酸平板筛选，与干酪乳杆菌“混合发酵”筛选，直至最终筛选到目标菌株。将该菌株与干酪乳杆菌LC-N235按比例混合发酵。在5L发酵罐中按2∶1的比例接入种子培养液后发酵培养48h，产物L-乳酸的产量达到235g/L，较干酪乳杆菌LC-N235或凝结芽胞杆菌BC-3或凝结芽孢杆菌BC-N6242单独发酵分别提高了45.1%、57.7%、14.6%，且有效缩短凝结芽胞杆菌单独发酵时间24h，具有重大的社会意义和经济价值。
Description
技术领域
本发明涉及一种凝结芽孢杆菌及其在混合发酵产L-乳酸中的应用，属于微生物发酵技术领域。
背景技术
乳酸是一种古老且重要的有机酸，乳酸、乳酸盐及其衍生产物，被广泛应用于药品、医药、饲料、化工的等领域。在食品工业上广泛用作酸味剂、防腐剂和还原剂。乳酸，尤其是L-乳酸具有很强的杀菌作用，可直接用作手术室、病房、实验室等场所的消毒剂。L-乳酸、L-乳酸钠与葡萄糖、氨基酸等复合配制成输液，可治疗酸中毒及高钾血症。乳酸可添加至烟草中，能保持烟草的湿度，提高卷烟的质量。还可以用来处理纺织纤维，可使之易于着色，增加光泽等。L-乳酸经聚合可生成立链的或环状的聚乳酸，在人体内能被分解成L-乳酸为人体代谢，因此可用于生产缓释胶囊制剂、生物降解纤维、生物降筋塑料、生物植片等。聚L-乳酸在自然条件下缓慢分解，它不像PVC、PP塑料那样造成“白色污染”。因此在制造食品包装材料和农用薄膜等方面有很大的潜力。由此可见，L-乳酸的发展前景十分诱人。
乳酸可以通过化学合成法、微生物发酵法（同型乳酸发酵、异型乳酸发酵）及酶法几种方法合成得到。由于微生物发酵能够专业得到L-乳酸且无污染，因此发酵法被广泛应用于L-乳酸的生产。目前国内外多以米根霉、德氏乳杆菌等进行L-乳酸发酵生产。根霉属于异型乳酸发酵，营养要求简单，但转化率相对较低，且发酵产物光学纯度不高。乳酸细菌属于同型乳酸发酵，转化率高，产物光学纯度也较高，属于化能异养型微生物，必须由外界提供多种营养物质及生长因子，如氨基酸、维生素、核酸碱基等。
自然界中产L-乳酸能力强，并可应用于工业生产的菌种只有霉菌中德根霉属及细菌中的乳杆菌属、芽孢杆菌属、链球菌属。为了提高发酵产L-乳酸的产量，降低生产制备成本，提高生产质量，国内外对其生产过程进行了大量研究，主要包括：生产菌种诱变改良、低价原料的开发利用、发酵工艺的优化等方面。由此可见，提高L-乳酸发酵产物光学纯度、提高发酵糖酸转化率、提高产物耐高糖能力等已经成为发酵产L-乳酸的研究热点。
发明内容
本发明要解决的技术问题之一在于提供一种凝结芽孢杆菌及其诱变选育方法，使其发酵产物L-乳酸产量大幅度提高。
本发明要解决的技术问题之二在于提供所述凝结芽孢杆菌在混合发酵产L-乳酸中的应用。
为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：
一种凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)BC-N6242，已于2012年5月10日保藏于中国典型培养物保藏中心CCTCC，保藏编号：CCTCC M 2012156。
本发明所述的凝结芽孢杆菌BC-N6242的筛选方法是：凝结芽孢杆菌BC-3出发菌株经低能氮离子注入诱变后，利用高糖平板、琥珀酸平板、纯乳酸平板筛选得到耐高糖、EMP途径强化且不分解利用乳酸的菌株。然后将所得的菌株按一定比例与干酪乳杆菌LC-N235混合接入发酵培养基，经摇瓶发酵筛选出发酵产L-乳酸含量最高的凝结芽孢杆菌作为下一轮诱变筛选的出发菌株，重复上述过程，直至筛选到目标菌株，即凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)BC-N6242。
本发明诱变得到的凝结芽孢杆菌BC-N6242菌株的形态学及生理生化学特征如下：
菌落颜色：米白色；
需氧方式：兼性厌氧；
菌落大小：2~6mm；
适宜生长温度：40~45℃；
适宜生长pH：7.0~7.4；
菌落形态：圆形；
革兰氏染色：阳性；
本发明所提供的凝结芽孢杆菌BC-N6242的诱变方法，具体步骤如下：
(a)、单孢子悬浮液制备：将凝结芽孢杆菌BC-3出发菌株孢子制成孢子悬液，调整孢子浓度为106个/毫升。
(b)、低能氮离子注入诱变：取0.1mL的步骤(a)中孢子悬液均匀涂布于无菌平皿上，以无菌风吹干，在20KeV、注入剂量为180×1013ions/cm2下对其进行氮离子注入，离子注入完毕后，取出平皿，在无菌环境下用1mL无菌水洗脱，涂布到高糖平板培养基上；在40~45℃下倒置培养2~3d。
(c)、琥珀酸平板初筛：将步骤(b)筛选到的能生长良好且透明圈大的菌株挑接至琥珀酸平板培养基上，在40~45℃下倒置培养2~3d，筛选菌株。
(d)、纯乳酸平板初筛：将步骤(c)筛选到比出发菌株延迟出现菌落的单菌落挑接至纯乳酸平板培养基上，在40~45℃下倒置培养2~3d，筛选在纯乳酸平板上不能生长的菌株。
(e)、发酵复筛：将步骤(d)筛选出的凝结芽孢杆菌接入斜面培养基，在40~45℃下培养1~2d，取斜面培养物接入种子培养基在40~45℃下扩培12~20h。取种子液与干酪乳杆菌LC-N235种子液按比例接入发酵培养基，接种量5%~15%（v/v），250mL摇瓶装液量20~50mL，发酵温度40~45℃，发酵30~50h后测定L-乳酸含量，筛选出发酵产L-乳酸含量最高的凝结芽孢杆菌作为下一轮诱变筛选的出发菌株，重复上述步骤直至筛选到目标菌株，即凝结芽孢杆菌BC-N6242。
在上述筛选方法中：步骤(b)所采用的高糖平板培养基包含如下质量百分数的组分：碳源25%~35%、氮源1.0%~2.0%、无机盐0.02%~0.08%、中和剂 2%~4%，琼脂1.0%~1.5%，其余为水，pH 7.0~7.4；其中所述碳源为葡萄糖和淀粉中的一种或两种的混合；氮源为蛋白胨、牛肉膏、酵母膏中的一种或几种的混合；无机盐为钠盐、钾盐、镁盐和磷酸盐中的一种或几种的混合；中和剂为重质碳酸钙。步骤(c)所采用的琥珀酸平板培养基以25%~35%的琥珀酸代替高糖培养基中碳源，其他成分不变。步骤(d)所采用的纯乳酸平板培养基以0.4%~0.6%的乳酸代替高糖培养基中碳源，其他成分不变。
在上述筛选方法中：步骤(b)所采用的斜面培养基包含如下质量百分数的组分：碳源0.4%~0.6%、氮源1.0%~2.0%、无机盐0.02%~0.08%、中和剂 0.2%~0.4%，琼脂1.0%~1.5%，其余为水，pH 7.0~7.4；其中所述碳源为葡萄糖和淀粉中的一种或两种的混合；氮源为蛋白胨、牛肉膏、酵母膏中的一种或几种的混合；无机盐为钠盐、钾盐、镁盐和磷酸盐中的一种或几种的混合；中和剂为重质碳酸钙。
在上述筛选方法中：步骤(e)所采用的种子培养基包含如下质量百分数的组分：碳源4%~8%、氮源1.0%~5.0%、无机盐0.02%~0.08%、中和剂 2%~4%，其余为水，pH 7.0~7.4；其中所述碳源为葡萄糖、淀粉中的一种或几种；氮源为蛋白胨、牛肉膏和酵母膏中的一种或多种；无机盐为钠盐、钾盐、镁盐、磷酸盐中的一种或几种混合；中和剂为重质碳酸钙。
在上述筛选方法中：步骤(e)所采用的发酵培养基包含如下质量百分数的组分：碳源10%~20%、氮源1.0%~3.0%、无机盐0.02%~0.08%、中和剂 5%~10%，其余为水，pH 7.0~7.4；其中所诉碳源为葡萄糖、玉米粉糖化液、大米糖化液、蔗糖中的一种或几种；氮源为蛋白胨、酵母膏、牛肉膏中的一种或几种混合；无机盐为钠盐、钾盐、镁盐磷酸盐中的一种或多种；中和剂为重质碳酸钙。
本发明混合发酵所用的干酪乳杆菌(Lactobacilluscasei)LC-N235，已于2012年5月10日，保藏于中国典型培养物保藏中心CCTCC，保藏编号：CCTCC M 2012157。
所述的凝结芽孢杆菌BC-N6242与干酪乳杆菌LC-N235在混合发酵产L-乳酸中的应用。包含如下步骤：
1)、平板培养：将凝结芽孢杆菌BC-N6242和干酪乳杆菌LC-N235分别接种至平板基本培养基上培养，培养温度为35~45℃，培养时间为2~3 d；
2)、斜面培养：将步骤1)平板培养的两种菌分别接种至斜面培养基培养，培养温度为35~45℃，培养时间1~2 d；
3)、种子培养：将步骤2)中的两种菌的斜面培养物分别接种至种子培养基中培养，培养温度为35~45℃，250ml摇瓶装液量10~30ml，培养时间12~20h；
4)、混合发酵：将步骤3)中的两种菌的种子培养液按凝结芽孢菌BC-N6242∶干酪乳杆LC-N235=(0.5~2):1的比例接种至发酵培养基中，接种量5~15%(v/v)，250ml摇瓶装液量20~50ml，发酵温度40~45℃，发酵培养30~50h。
所述步骤1)平板基本培养基包含如下质量百分数的组分：碳源4%~6%、氮源1.0%~2.0%、无机盐0.02%~0.08%、中和剂2%~4%，琼脂1.0%~1.5%、其余为水，pH 7.0~7.4；其中所述碳源为葡萄糖和淀粉中的一种或两种的混合；所述氮源为蛋白胨、牛肉膏、酵母膏中的一种或几种的混合；所述无机盐为钠盐、钾盐、镁盐和磷酸盐中的一种或几种的混合；所述中和剂为重质碳酸钙。
所述斜面培养基包含如下质量百分数的组分：碳源0.3%~0.6%、氮源1.0%~2.0%、无机盐0.02%~0.08%、中和剂0.2%~0.4%、琼脂1.0%~1.5%、其余为水，pH 7.0~7.4；其中所述碳源为葡萄糖和淀粉中的一种或两种的混合；所述氮源为蛋白胨、牛肉膏、酵母膏中的一种或几种的混合；所述无机盐为钠盐、钾盐、镁盐和磷酸盐中的一种或几种的混合；所述中和剂为重质碳酸钙。
所述种子培养基包含如下质量百分数的组分：碳源4%~8%、氮源1%~5%、无机盐0.02%~0.08%，中和剂 2%~4%，其余为水，pH 7.0~7.4；其中所述碳源为葡萄糖和淀粉中的一种或两种的混合；所述氮源为蛋白胨、牛肉膏、酵母膏中的一种或几种的混合；所述无机盐为钠盐、钾盐、镁盐、磷酸盐中的一种或几种的混合；所述中和剂为重质碳酸钙。
所述发酵培养基包含如下质量百分数的组分：碳源10%~20%、氮源1.0%~3.0%、无机盐0.02%~0.08%、中和剂 5.0%~10.0%，其余为水，pH 7.0~7.4；其中所述碳源为葡萄糖、玉米粉糖化液、大米糖化液、蔗糖中的一种或多种的混合；所述氮源为蛋白胨、牛肉膏、酵母膏中的一种或多种的混合；所述无机盐为钠盐、钾盐、镁盐和磷酸盐中的一种或几种的混合；所述中和剂为重质碳酸钙。
本发明的有益效果在于：本发明采用低能氮离子注入诱变凝结芽胞杆菌BC-3出发菌株，利用高糖平板、琥珀酸平板、纯乳酸平板筛选出能够耐高糖、EMP途径强化且不分解利用乳酸的菌株，再通过“混合发酵实验”筛选出高产菌株作为下一轮诱变的出发菌株，直至筛选到目标菌株，即凝结芽胞杆菌BC-N6242。最后将其与干酪乳杆菌LC-N235按2:1的比例混合接入发酵培养基，该混合菌株能高效地利用葡萄糖发酵产L-乳酸，糖酸转化率高，且能有效的缩短发酵时间。在5L发酵罐中，按凝结芽孢菌BC-N6242∶干酪乳杆LC-N235=2:1的比例，L-乳酸产量达到了235g/L，比同等培养条件下的干酪乳杆菌LC-N235或凝结芽胞杆菌BC-3原始出发菌株或凝结芽孢杆菌BC-N6242单独发酵分别提高了45.1%、57.7%、14.6%，具有重大的社会意义和经济价值。
具体实施方式
根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的具体的物料配比、工艺条件及其结果仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。
实施例1
本实施例说明将凝结芽孢杆菌原始菌株进行低能氮离子注入诱变筛选的方法。
进行第一步低能氮离子注入诱变筛选的具体步骤如下：
(a)、单孢子悬浮液制备：取40~45℃恒温培养2~3d的凝结芽孢杆菌BC-3原始出发菌株新鲜斜面加无菌水10mL，刮洗下孢子倾于带有一定玻璃珠的250mL三角瓶内震荡摇匀20min(250rpm)，打散孢子链，三层脱脂纱布过滤，滤液用血球计数板计数，调整孢子浓度106个/毫升。
(b)、低能氮离子注入诱变：取0.1mL步骤(a)中孢子悬液均匀涂布于无菌平皿上，镜检无细胞重叠者进行低能氮离子注入。本实验低能氮离子注入机为离子束生物工程装置。在20KeV的能量下对干酪乳杆菌进行离子注入。注入剂量为180×1013ions/cm2，靶室真空度为10-3Pa，以20S脉冲式注入，间隔15s，靶室内放置不接受注入的对照样。离子注入完毕后，取出平皿，在无菌环境下用1ml无菌水洗脱，涂布到高糖平板培养基上，在40~45℃下倒置培养2~3d。
(c)、诱变菌株的筛选：
琥珀酸平板初筛：将步骤(b)筛选到的生长良好且透明圈大的单菌株挑接至琥珀酸平板培养基上，在40~45℃下倒置培养2~3d，筛选比出发菌株延迟出现菌落的菌株。
纯乳酸平板初筛：将琥珀酸平板上筛选到生长良好且透明圈大的单菌落挑接至高乳酸平板培养基上，在40~45℃下倒置培养2~3d，筛选在纯乳酸平板不生长的菌株。
发酵复筛：将初筛最终筛选到的菌株的单菌落和干酪乳杆菌LC-N235分别接至斜面培养基，在35~45℃条件下培养1~2d；将斜面培养物分别接入种子培养基在35~45℃、50~120rmp摇床转速下扩培12~20h。取筛选到的菌株的种子液与干酪乳杆菌LC-N235混合发酵复筛，即：初筛得到的所有凝结芽孢杆菌与干酪乳杆菌LC-N235按比例混合接入发酵培养基，接种量5%~15%（v/v），250mL摇瓶装液量20~50mL，发酵温度35~45℃，发酵发酵时间30~50h；测定混合发酵产L-乳酸的含量，筛选出混合发酵产L-乳酸含量最高的凝结芽孢杆菌作为下一轮诱变筛选的出发菌株，直至筛选到目标菌株，即凝结芽孢杆菌BC-N6242。
其中，所使用的培养基配方（%为质量百分比）：
步骤(b)中所用的高糖平板培养基为：葡萄糖 30%，蛋白胨1%，牛肉膏 0.3%，酵母膏0.3%，硫酸镁0.05%，碳酸钙 3%，琼脂1.2%，其余为蒸馏水，pH 7.0。步骤(c)中所用的琥珀酸平板培养基以8%琥珀酸代替高糖培养基中“葡萄糖 30%”，其他成分不变。所用的纯乳酸平板培养基以5%乳酸代替中高糖培养基中“葡萄糖 30%”， 其他成分不变。
步骤(a)和(c)中所用的斜面培养基为：葡萄糖 0.5%，蛋白胨1%，牛肉膏 0.3%，酵母膏0.3%，硫酸镁0.05%，碳酸钙 0.3%，琼脂1.2%，其余为蒸馏水，pH 7.0。
步骤(c)中所用的种子培养基为：葡萄糖6%，蛋白胨1%，酵母膏1.0%，硫酸镁0.05%，碳酸钙 3%，其余为蒸馏水，pH 7.0。
步骤(c)中所用的发酵培养基为：葡萄糖15%，蛋白胨0.05%，酵母膏1.5%，硫酸镁0.05%，碳酸钙 7.5%，其余为蒸馏水，pH 7.0。
发酵结束后检测各菌株L-乳酸含量如表1所示：
表1
经过平板组合筛选及单因素混合发酵筛选获得的凝结芽孢杆菌突变株在发酵过程中L-乳酸产量明显高于出发菌株。
实施例2
本实施例说明高产菌株凝结芽孢杆菌BC-N6262以及干酪乳杆菌LC-N235的遗传稳定性。传代发酵试验结果如表2所示：
表2
从实验结果可知，经过5次连续传代，突变株凝结芽孢杆菌BC-N6262 L-乳酸产量较稳定，具有较好的传代稳定性。此外，干酪乳杆菌LC-N235稳定性也较为理想。两者均可作为进一步研究和开发的生产菌株。
实施例3
本实施例说明凝结芽孢杆菌BC-N6242与干酪乳杆菌LC-N235混合发酵产L-乳酸。
本实施例所述的培养基配方（%为质量百分比）：
平板基本培养基：葡萄糖5.0%，蛋白胨1.0%，牛肉膏0.3%，酵母膏0.3%，七水合硫酸镁0.05%，重质碳酸钙3.0%，琼脂1.2%，其余为水，pH 7.0。
斜面培养基：葡萄糖0.5%，蛋白胨1.0%，牛肉膏0.3%，酵母膏0.3%，七水合硫酸镁0.05%，重质碳酸钙0.3%，琼脂1.2%，其余为水，pH 7.0。
种子培养基：葡萄糖6.0%，蛋白胨1.0%，酵母膏1.0%，七水合硫酸镁0.05%，重质碳酸钙3.0%，其余为水，pH 7.0。
发酵培养基：葡萄糖15%，蛋白胨0.05%，酵母膏1.5%，七水合硫酸镁0.05%，重质碳酸钙7.5%，其余为水，pH 7.0。
将筛选到得突变株凝结芽孢杆菌BC-N6242与干酪乳杆菌LC-N235分别接种至平板基本培养基上于42℃条件下倒置培养60h后，将其接种至斜面培养基培养，培养温度42℃，培养时间36h。将斜面培养物分别接种到种子培养基中，培养温度42℃，250mL摇瓶瓶装液量30mL，在80rmp摇床转速下培养时间16h；将两种种子液按1∶1（凝结芽孢菌BC-N6242∶干酪乳杆菌LC-N235）的比例接种到发酵培养基中，接种量10%(v/v)，发酵温度42℃，250mL摇瓶装液量40mL，静止发酵培养48h后检测发酵液中L-乳酸含量达到了226g/L，比同等培养条件下干酪乳杆菌LC-N235或凝结芽孢杆菌BC-3原始出发菌株或凝结芽孢杆菌BC-N6242单独发酵分别提高了39.5%、51.7%、10.3%。
实施例4
本实施例说明凝结芽孢杆菌BC-N6242与干酪乳杆菌LC-N235混合发酵产L-乳酸。
本实施例所述的培养基配方（%为质量百分比）：
平板基本培养基：葡萄糖5.0%，蛋白胨1.0%，牛肉膏0.3%，酵母膏0.3%，七水合硫酸镁0.05%，重质碳酸钙3.0%，琼脂1.2%，其余为水，pH 7.0。
斜面培养基：葡萄糖0.5%，蛋白胨1.0%，牛肉膏0.3%，酵母膏0.3%，七水合硫酸镁0.05%，重质碳酸钙0.3%，琼脂1.2%，其余为水，pH 7.0。
种子培养基：葡萄糖6%，蛋白胨1.0%，酵母膏1.0%，七水合硫酸镁0.05%，重质碳酸钙3%，其余为水，pH 7.0。
发酵培养基：葡萄糖15%，蛋白胨0.05%，酵母膏1.5%，七水合硫酸镁0.05%，重质碳酸钙7.5%，其余为水，pH 7.0。
将筛选到得突变株结芽孢杆菌BC-N6242与干酪乳杆菌LC-N235分别接种至平板基本培养基上于42℃条件下倒置培养60h后，将其接种至斜面培养基培养，培养温度42℃，培养时间36h。将斜面培养物分别接种到种子培养基中，培养温度42℃，250mL摇瓶瓶装液量30mL，在80rmp摇床转速下培养时间16h；将两种种子液按1∶2（凝结芽孢菌BC-N6242∶干酪乳杆菌LC-N235）的比例接种到发酵培养基中，接种量10%(v/v)，发酵温度42℃，250mL摇瓶装液量40mL，静止发酵培养48h后检测发酵液中L-乳酸含量达到了192g/L，比同等培养条件下的干酪乳杆菌LC-N235或凝结芽孢杆菌BC-3原始出发菌株单独发酵分别提高了18.5%、28.9%。比凝结芽孢杆菌BC-N6242单独发酵产量稍微偏低。
实施例5
本实施例说明突变株凝结芽孢杆菌BC-N6242和干酪乳杆菌LC-N235混合发酵产L-乳酸。
本实施例所述的培养基配方（%为质量百分比）：
平板基本培养基：葡萄糖5.0%，蛋白胨1.0%，牛肉膏0.3%，酵母膏0.3%，七水合硫酸镁0.05%，重质碳酸钙3.0%，琼脂1.2%，其余为水，pH 7.0。
斜面培养基：葡萄糖0.5%，蛋白胨1.0%，牛肉膏0.3%，酵母膏0.3%，七水合硫酸镁0.05%，重质碳酸钙0.3%，琼脂1.2%，其余为水，pH 7.0。
种子培养基：葡萄糖6%，蛋白胨1.0%，酵母膏1.0%，七水合硫酸镁0.05%，重质碳酸钙3%，其余为水，pH 7.0。
发酵培养基：葡萄糖15%，蛋白胨0.05%，酵母膏1.5%，七水合硫酸镁0.05%，重质碳酸钙7.5%，其余为水，pH 7.0。
将筛选到得突变株凝结芽孢杆菌BC-N6242和干酪乳杆菌LC-N235分别接种至平板基本培养基上于42℃条件下倒置培养60h后，将其接种至斜面培养基培养，培养温度42℃，培养时间36h。将斜面培养物分别接种到种子培养基中，培养温度42℃，250mL摇瓶瓶装液量30mL，，在80rmp摇床转速下培养时间16h；将两种种子液按2∶1（凝结芽孢菌BC-N6242：干酪乳杆菌LC-N235:）的比例接种到发酵培养基中，接种量10%(v/v)，发酵温度42℃，250mL摇瓶装液量40mL，静止发酵培养48h后检测发酵液中L-乳酸含量达到了233g/L，比同等培养条件下的干酪乳杆菌LC-N235或凝结芽孢杆菌BC-3原始出发菌株或凝结芽孢杆菌BC-N6242单独发酵分别提高了43.8%、56.4%、13.7%。
实施例6
本实施例说明突变株凝结芽孢杆菌BC-N6242和干酪乳杆菌LC-N235在5L发酵罐中混合发酵产L-乳酸。
本实施例所述的培养基配方（%为质量百分比）：
平板基本培养基：葡萄糖5.0%，蛋白胨1.0%，牛肉膏0.3%，酵母膏0.3%，七水合硫酸镁0.05%，重质碳酸钙3.0%，琼脂1.2%，其余为水，pH 7.0。
斜面培养基：葡萄糖0.5%，蛋白胨1.0%，牛肉膏0.3%，酵母膏0.3%，七水合硫酸镁0.05%，重质碳酸钙0.3%，琼脂1.2%，其余为水，pH 7.0。
种子培养基：葡萄糖6%，蛋白胨1.0%，酵母膏1.0%，七水合硫酸镁0.05%，重质碳酸钙3%，其余为水，pH 7.0。
发酵培养基：葡萄糖15%，蛋白胨0.05%，酵母膏1.5%，七水合硫酸镁0.05%，重质碳酸钙7.5%，其余为水，pH 7.0。
将筛选到得突变株凝结芽孢杆菌BC-N6242与干酪乳杆菌LC-N235分别接种至平板基本培养基上于42℃条件下倒置培养60h后，将其接种至斜面培养基培养，培养温度42℃，培养时间36h。将斜面培养物分别接种到种子培养基中，培养温度42℃，250mL摇瓶瓶装液量30mL，，在80rpm摇床转速下培养时间16h；将两种种子液按2∶1（凝结芽孢菌BC-N6242∶干酪乳杆LC-N235）的比例接种到装有3L发酵培养基的5L发酵罐中，接种量为10%(v/v)，发酵温度为42℃，前期0~24h发酵罐搅拌转速100rpm，24~48h静止发酵培养。48h后检测发酵液中L-乳酸含量，达到235g/L，比同等培养条件下的干酪乳杆菌LC-N235或凝结芽胞杆菌BC-3原始出发菌株或凝结芽孢杆菌BC-N6242单独发酵分别提高了45.1%、57.7%、14.6%。
Claims (7)
1.一种凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)BC-N6242，已保藏于中国典型培养物保藏中心CCTCC，保藏编号：CCTCC M 2012156。
2.权利要求1所述的凝结芽孢杆菌BC-N6242与干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)LC-N235在混合发酵产L-乳酸中的应用，所述干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)LC-N235保藏于中国典型培养物保藏中心CCTCC，保藏编号：CCTCC M 2012157。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于包含如下步骤：
1)、平板培养：将凝结芽孢杆菌BC-N6242和干酪乳杆菌LC-N235分别接种至平板基本培养基上培养，培养温度为35~45℃，培养时间为2~3d；
2)、斜面培养：将步骤1)平板培养的两种菌分别接种至斜面培养基培养，培养温度为35~45℃，培养时间1~2 d；
3)、种子培养：将步骤2)中的两种菌的斜面培养物分别接种至种子培养基中培养，培养温度为35~45℃，250ml摇瓶装液量10~30ml，培养时间12~20h；
4)、混合发酵：将步骤3)中的两种菌的种子培养液按凝结芽孢杆菌BC-N6242∶干酪乳杆菌LC-N235=0.5~2:1的比例接种至发酵培养基中，接种量按5~15%的体积比接种，250ml摇瓶装液量20~50ml，发酵温度40~45℃，发酵培养30~50 h。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于所述步骤(1)平板基本培养基包含如下质量百分数的组分：碳源4%~6%、氮源1.0%~2.0%、无机盐0.02%~0.08%、中和剂2%~4%，琼脂1.0%~1.5%、其余为水，pH 7.0~7.4；其中所述碳源为葡萄糖和淀粉中的一种或两种的混合；所述氮源为蛋白胨、牛肉膏、酵母膏中的一种或几种的混合；所述无机盐为钠盐、钾盐、镁盐和磷酸盐中的一种或几种的混合；所述中和剂为重质碳酸钙。
5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于所述斜面培养基包含如下质量百分数的组分：碳源0.3%~0.6%、氮源1.0%~2.0%、无机盐0.02%~0.08%、中和剂0.2%~0.4%、琼脂1.0%~1.5%、其余为水，pH 7.0~7.4；其中所述碳源为葡萄糖和淀粉中的一种或两种的混合；所述氮源为蛋白胨、牛肉膏、酵母膏中的一种或几种的混合；所述无机盐为钠盐、钾盐、镁盐和磷酸盐中的一种或几种的混合；所述中和剂为重质碳酸钙。
6.根据权利要求3所述的应用，其特征在于所述种子培养基包含如下质量百分数的组分：碳源4%~8%、氮源1%~5%、无机盐0.02%~0.08%，中和剂2%~4%，其余为水，pH 7.0~7.4；其中所述碳源为葡萄糖和淀粉中的一种或两种的混合；所述氮源为蛋白胨、牛肉膏、酵母膏中的一种或几种的混合；所述无机盐为钠盐、钾盐、镁盐、磷酸盐中的一种或几种的混合；所述中和剂为重质碳酸钙。
7.根据权利要求3所述的应用，其特征在于所述发酵培养基包含如下质量百分数的组分：碳源10%~20%、氮源1.0%~3.0%、无机盐0.02%~0.08%、中和剂 5.0%~10.0%，其余为水，pH 7.0~7.4；其中所述碳源为葡萄糖、玉米粉糖化液、大米糖化液、蔗糖中的一种或多种的混合；所述氮源为蛋白胨、牛肉膏、酵母膏中的一种或多种的混合；所述无机盐为钠盐、钾盐、镁盐和磷酸盐中的一种或几种的混合；所述中和剂为重质碳酸钙。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201210172600.7A CN102653725B (zh) | 2012-05-30 | 2012-05-30 | 一种凝结芽孢杆菌及其在混合发酵产l-乳酸中的应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201210172600.7A CN102653725B (zh) | 2012-05-30 | 2012-05-30 | 一种凝结芽孢杆菌及其在混合发酵产l-乳酸中的应用 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN102653725A CN102653725A (zh) | 2012-09-05 |
| CN102653725B true CN102653725B (zh) | 2013-09-04 |
Family
ID=46729456
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201210172600.7A Expired - Fee Related CN102653725B (zh) | 2012-05-30 | 2012-05-30 | 一种凝结芽孢杆菌及其在混合发酵产l-乳酸中的应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN102653725B (zh) |
Families Citing this family (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103305437B (zh) * | 2013-05-17 | 2014-10-29 | 南京工业大学 | 一株l-乳酸铵耐受菌及其应用 |
| CN106190694A (zh) * | 2016-07-15 | 2016-12-07 | 华南农业大学 | 一种铁皮石斛酒的制备方法 |
| CN106906253A (zh) * | 2017-03-28 | 2017-06-30 | 南京工业大学 | 一种利用表面固定化技术发酵生产l‑乳酸的方法 |
| CN110272858B (zh) * | 2019-07-18 | 2020-09-04 | 江南大学 | 一种高产l-乳酸的凝结芽孢杆菌及其应用 |
| CN110960562B (zh) * | 2019-12-31 | 2020-10-16 | 广州市爱百伊生物技术有限公司 | 抗敏作用的益生菌组合物 |
| CN111235074B (zh) * | 2020-03-30 | 2020-09-18 | 广东锦玛绿色食品科技有限公司 | 一种酿酒酵母复合功能菌剂 |
| CN111494302B (zh) * | 2020-06-12 | 2020-11-20 | 洋浦吉商生物科技有限公司 | 益生元美白抗衰老发酵化妆品 |
| CN111826314B (zh) * | 2020-07-20 | 2023-04-07 | 上海交通大学 | L-乳酸的生产菌株凝结芽孢杆菌h-2及l-乳酸的生产方法 |
| CN114277065B (zh) * | 2021-12-30 | 2023-10-13 | 万华化学集团股份有限公司 | 一种混合发酵联产乳酸和丁二酸的方法 |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2010103548A2 (en) * | 2009-03-13 | 2010-09-16 | Godavari Biorefineries Ltd. | Improved method for producing lactic acid and derivative thereof |
| CN102174602A (zh) * | 2011-03-07 | 2011-09-07 | 南京林业大学 | 一种利用生物质发酵生产l-乳酸的方法 |
-
2012
- 2012-05-30 CN CN201210172600.7A patent/CN102653725B/zh not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2010103548A2 (en) * | 2009-03-13 | 2010-09-16 | Godavari Biorefineries Ltd. | Improved method for producing lactic acid and derivative thereof |
| CN102174602A (zh) * | 2011-03-07 | 2011-09-07 | 南京林业大学 | 一种利用生物质发酵生产l-乳酸的方法 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| 周剑等.产L－乳酸凝结芽孢杆菌发酵条件的初步研究.《氨基酸和生物资源》.2005,第27卷(第1期),第70-73页. * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN102653725A (zh) | 2012-09-05 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN102653725B (zh) | 一种凝结芽孢杆菌及其在混合发酵产l-乳酸中的应用 | |
| CN102653724B (zh) | 一株干酪乳杆菌及其在发酵产l-乳酸中的应用 | |
| CN101690545B (zh) | 一种菌剂与酶复合微生态制剂的生产方法 | |
| CN102660461B (zh) | 一种缩短烟叶发酵周期的微生物制剂及其应用 | |
| CN102409007B (zh) | 一种芽孢杆菌微生态制剂及其液固结合发酵制备工艺 | |
| CN102643770B (zh) | 利用合成培养基纯厌氧生长产丁二酸的大肠杆菌及其应用 | |
| CN102899377A (zh) | 金霉素预混剂的制备方法 | |
| CN104561154A (zh) | 一种辅酶q10发酵工艺及控制策略 | |
| CN101914478A (zh) | 一种枯草芽孢杆菌及其应用 | |
| CN110373359A (zh) | 一种白色链霉菌X-18及利用该菌生产ε-聚赖氨酸的方法 | |
| CN102864114B (zh) | 一种恩拉霉素高产菌株及其制备方法和应用 | |
| CN103409476A (zh) | 一种l-异亮氨酸的发酵及分离纯化方法 | |
| CN104726381A (zh) | 一株产l-赖氨酸的菌株及其生产l-赖氨酸的方法 | |
| CN103361289A (zh) | 一株产l-赖氨酸的菌株及其生产l-赖氨酸的方法 | |
| CN101748093B (zh) | 壮观链霉菌SpLE-16及其在生产大观霉素中的应用 | |
| CN105969702B (zh) | 粘质沙雷氏菌rz 21-c6及其应用 | |
| CN100455670C (zh) | 一株产l-丝氨酸的菌株及用该菌株生产l-丝氨酸的方法 | |
| CN102550294B (zh) | 一种姬菇菌种的液体发酵培养方法 | |
| CN104277989A (zh) | 一株面包酵母及其在发酵生产辅酶i中的应用 | |
| CN101880703B (zh) | 一种流加癸酸盐发酵达托霉素的方法 | |
| CN103849575B (zh) | 一种单细胞蛋白的生产方法 | |
| CN103305437B (zh) | 一株l-乳酸铵耐受菌及其应用 | |
| CN107641602A (zh) | 一株产朊假丝酵母及其在发酵产蛋白中的应用 | |
| CN107557311A (zh) | 一株嗜酸乳杆菌及其在发酵产抑菌多肽中的应用 | |
| CN101955895B (zh) | 玫瑰杆菌及其在制备琼胶寡糖中的应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20130904 Termination date: 20150530 |
|
| EXPY | Termination of patent right or utility model |