CN103409476A

CN103409476A - 一种l-异亮氨酸的发酵及分离纯化方法

Info

Publication number: CN103409476A
Application number: CN2013103865390A
Authority: CN
Inventors: 杨旭锦; 石慧
Original assignee: BEIJING MINGGAO HI-TECH DEVELOPMENT Co Ltd
Current assignee: Zhongke Medical Industry Productivity and Promotion Center Co., Ltd.
Priority date: 2013-08-30
Filing date: 2013-08-30
Publication date: 2013-11-27
Anticipated expiration: 2033-08-30
Also published as: CN103409476B

Abstract

本发明公开了一种L-异亮氨酸的发酵及分离纯化工艺。本工艺以乳糖发酵短杆菌(Brevibacterium lactofermentum)JHI3-156为出发菌种，经N⁺注入、紫外线复合诱变及乙硫氨酸抗性筛选获得高产乳糖发酵短杆菌JHI4-102(保藏编号：8091)，经优化培养基发酵、壳聚糖预处理和超滤等分离纯化方法后获得L-异亮氨酸。本发明所采用的方法制取的L-异亮氨酸的产酸率≥31.0g/L、纯度≥98.5％，同时能有效降低发酵成本和提取成本，适合于产业化生产。

Description

一种L-异亮氨酸的发酵及分离纯化方法

技术领域

本发明涉及诱变选育L-异亮氨酸高产菌株及利用该菌株发酵制备L-异亮氨酸的方法，属于生化工程领域。

背景技术

1901年，Fischer在由蛋白水解液分离的亮氨酸组分中发现了旋光度较亮氨酸更大的物质，此为有关L-异亮氨酸的最早报道。L-异亮氨酸(L-Isoleucine)化学名为β-甲基-a-氨基戊酸。由于在a位和β位具有两个不对称碳原子，因而存在D、L、D别、L别四种旋光异构体，自然界中主要是L-异亮氨酸，研究表明，其余三种均无营养价值。此外，L-异亮氨酸是人体八种必需氨基酸之一，同时又是三种支链氨基酸之一，在人体的生长代谢中占有十分重要的地位，若人体中长期缺乏异亮氨酸，可影响到机体的生理机能，导致代谢紊乱、机体抵抗力下降等。L-异亮氨酸作为畜禽必需氨基酸对动物有特殊营养作用，主要是由于其具有特殊的生理功能如：调节蛋白质代谢，增强免疫机能，改善泌乳性能，氧化供能，神经调节功能，所以作为支链氨基酸的研究倍受关注。L-异亮氨酸等氨基酸和高级脂肪酸制成的表面活性剂、抗菌剂具有毒性低、刺激小、柔软、抗静电、杀菌等性能，可用于制成护肤品、护发剂等化妆品。

L-异亮氨酸生产方法有提取法、合成法和生物发酵法三类。提取法是应用离子交换技术从混合氨基酸中分离L-异亮氨酸，分离效率高，提取操作简单，生产周期短，但是成本高且不易提取分离，没有应用于现代化大工业生产。合成法主要有化学合成法或化学合成与酶法相结合的方法，但是由于异亮氨酸在a位和β位具有两个不对称碳原子，且存在这四种旋光异构体，故很难廉价制造纯度高的L-异亮氨酸，大多数合成法所得均为外消旋体，须经外消旋拆分，生产成本高，反应复杂，步骤多，且有许多副产物。但近年来，通过甘氨酸酯Schiff碱衍生物羟基化反应，合成a-氨基酸的研究工作引人注目。以甘氨酸为原料，与无水乙醇及氯化亚砜作用，制得甘氨酸乙醋盐酸盐。再在二氯甲烷介质中，与三乙胺、苯甲醛反应生成苯亚甲氨基乙酸乙酯(以下简称Schiff碱)。再采用微波辐射，相转移催化技术，使苯亚甲氨基乙酸乙酯与仲溴丁烷形成烷基化产物。酸性水解，分离纯化后得异亮氨酸。合成的异亮氨酸产率为56.2％，纯品产率为23.7％，纯度为89.1％。采用6mol/L盐酸代替稀、浓盐酸两步水解法，简化烷基化物后处理步骤，使该合成法具备工业应用前景。微生物发酵法生产L-异亮氨酸具有原料成本低，反应条件温和、环境污染较小及易实现大规模生产等优点，故目前在工业生产上被广泛实施。生物发酵法包括添加前体物发酵法和直接发酵法等。添加前体物发酵法又称微生物转化法，是以葡萄糖作为发酵碳源、能源，再添加a-氨基丁酸、a-羟基丁酸、a-酮基丁酸和D-苏氨酸等前体物质，经微生物作用将其有效转化为目的氨基酸，由于前体物质稀少且价格昂贵，目前已很少被采用。直接发酵法是借助于微生物具有合成自身所需氨基酸的能力，通过对特定微生物的诱变处理，选育出营养缺陷型及氨基酸结构类似物抗性突变株，以解除代谢调节中的反馈抑制和反馈阻遏，从而达到过量积累某种氨基酸的目的。国内外大多数厂家均采用直接发酵法生产L-异亮氨酸。目前，国内尚处于研究与小规模生产阶段，菌株产酸水平不高，生产水平和产量远不能满足市场需求。

目前国际上日本生产L-异亮氨酸占有垄断地位，厂家有味之素、协和发酵和田边制药三家，均以发酵法生产，产酸率达30～35g/L，提取率60～70％。目前全世界合计年产量400～500吨。鉴于L-异亮氨酸生产的高难度，L-异亮氨酸～直是高价氨基酸，国际市场医药级价格高达60～80美元/kg。国内售价由于日本向中国倾销而逐年下降，目前医药级价格约650元/kg。我国的L-异亮氨酸发酵研究始于20世纪70年代，90年代初正式工业化生产。目前，传统一次投糖分批发酵大罐产酸率为20～22g/L，总得率为40～50％。江西省鹰潭生物化学制品厂是采用无锡轻工大学(现江南大学)技术最早生产L-异亮氨酸的厂家。目前国内生产L-异亮氨酸的厂家还有湖北省宜昌三峡药业有限责任公司、无锡晶海氨基酸有限公司、江苏张家港亚太氨基酸有限公司等。与日本相比较，我国的L-异亮氨酸生产水平还较低。

本发明通过N+注入、紫外线复合诱变及乙硫氨酸抗性筛选获得了生产L-异亮氨酸的高产菌株——乳糖发酵短杆菌(Brevibacterium lactofermentum)JHI4-102，建立了一种利用该菌株发酵和分离提取L-异亮氨酸的生产工艺，具有产酸率高、提取收率高，产品质量好、纯度高的优点。该菌株已于2013年8月30日由中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号：CGMCCNo.8091。

发明内容

本发明的目的之一是提供一种新的短杆菌属的乳糖发酵短杆菌(Brevibacterium lactofermentum)，该菌具有提高L-异亮氨酸产率的能力。

本发明需要解决的技术问题之二是提供一种利用上述菌种发酵及分离提取L-异亮氨酸的生产方法，通过如下技术方案实现，具体步骤顺序如下：

1、高产菌株筛选

液体完全培养基中接种斜面保存的新鲜乳糖发酵短杆菌JHI3-156，摇瓶培养至指数中后期，大约10h时取发酵液20mL于无菌的大离心管中离心一次，再加入等体积的PBS缓冲液及无菌玻璃珠，充分振荡，使菌体尽可能分散成单细胞态的PBS菌悬液。平皿中加入制备的菌悬液0.2mL，涂布均匀，无菌操作台中自然晾干，形成菌膜，镜检。将样品培养皿放入低能加速器(离子注入机)小靶室，打开培养皿盖，靶室抽真空，用氮离子(N⁺)进行注入。离子注入后，加入无菌PBS缓冲液，用橡胶块充分擦洗(重复两次)，将洗脱液置入含玻璃珠的大离心管中，充分振荡，待用。按注入剂量，分别取0.1mL处理后菌悬液稀释同样的倍数，分别涂布在0.8％Eth基本培养基平板上，然后放入28℃的恒温培养箱中培养，通过生长圈法初筛和摇瓶发酵复筛得到菌株JHN224。

液体完全培养基中接种斜面保存的新鲜JHN224，摇瓶培养至指数中后期，大约10h时取发酵液20mL于无菌的大离心管中，离心三次，再加入等体积的PBS缓冲液及无菌玻璃珠，充分振荡，使菌体尽可能分散成单细胞态的PBS菌悬液。用无菌玻璃平皿装入10mL菌悬液，在磁力搅拌器作用下用紫外灯照射，取处理后菌悬液0.1mL，在红灯下用适量无菌PBS缓冲液稀释。稀释后的菌液涂皿，28℃培养箱过夜培养(避光)。培养一定时间后，在菌落计数器下计数，并将各照射时间下的单位体积存活菌数和照射0s(即原菌液)的单位体积菌数作对比，计算其各自的存活率。

取0.5mL紫外线诱变的菌液，无菌操作加入到含5mL0.6％Eth(乙硫氨酸)基本培养基的试管中黑暗培养36h，然后将菌液稀释到一定合适浓度，涂布在含0.6％Eth的基本培养基平板上，放置在28℃的培养箱中培养4天，通过生长圈法初筛和摇瓶发酵复筛得到L-异亮氨酸高产菌株——乳糖发酵短杆菌JHI4-102，遗传稳定性试验表明该菌株遗传性能稳定，甘油保存。

2、发酵罐发酵

挑取菌株制备成0.1mL菌悬液，经种子逐级扩大培养，按5～20％接种量转入50～70L自动控制发酵罐中，装液量30～70％，通风量100～300L/h，搅拌转速300～800r/min，培养温度28～32℃。采用补料分批发酵，发酵培养基组成为(g/L)：葡萄糖80，豆饼水解液20，硫酸铵10，磷酸二氢钾1.5，磷酸氢二钾3，硫酸镁0.5，硫酸锰0.015，蛋氨酸0.02，亮氨酸0.06，VB₁0.001，生物素130μg。在发酵32h开始，残糖浓度为5～15g/L时，补加0.5～1L480g/L葡萄糖补料液。每隔2h检测，当糖的浓度降低为5～15g/L时，就补加0.5～1L的补料液，直至10L补料液全部补完为止。在发酵32h开始补加5～10g/L硫酸铵，共计1L，补加方式为：在发酵32h补加500mL，72h补加500mL；在发酵32h补加333mL，60h补加333mL，72h补加333mL；在发酵32h补加250mL，60h补加250mL，72h补加250mL，84h补加250mL。在流加葡萄糖的同时，用氨水代替NaOH调节pH值同时持续供给氮源，氨水自动流加，维持pH值在6.8～7.2左右。

3、提取纯化

在发酵液中加入草酸并加热至80℃，保温，离心除去部分菌体和碳酸钙，上清液调节pH值1～3，用质量浓度为30～60mg/L絮凝剂壳聚糖处理，过滤。采用聚砜超滤膜(50000)、聚丙烯腈超滤膜(10000和30000)3种不同切割相对分子质量的超滤膜超滤，操作温度40～60℃，操作压力0.15～0.2MPa。超滤液真空浓缩，加入乙醇结晶，于4℃静置过夜，过滤晶体，再次加入乙醇重结晶，真空干燥12h，最后得到白色鳞片状的L-异亮氨酸精品。

本发明的创造性在于采用N⁺注入-紫外线复合诱变获得L-异亮氨酸高产菌株，通过优化高产菌株的发酵条件，L-异亮氨酸的产酸量达到31.0g/L以上；通过壳聚糖预处理和超滤分离纯化，L-异亮氨酸纯度≥98.5％。本发明具有操作简便、易于大规模生产，产品收率高、质量好等特点。

附图说明

图1是本发明的工艺流程图。

具体实施方式

实施例1一种L-异亮氨酸的发酵及分离纯化方法，按以下步骤依次进行：

1、高产菌株筛选

①N⁺注入

菌悬液的制备：250mL三角瓶装25mL液体完全培养基，接种斜面保存的新鲜乳糖发酵短杆菌JHI3-156，200rpm，28℃摇瓶培养至指数中后期，大约10h时取发酵液20mL于无菌的大离心管中，5000rpm、10min离心一次，再加入等体积的PBS缓冲液及无菌玻璃珠，充分振荡5min，使菌体尽可能分散成单细胞态的PBS菌悬液。

注入前样品处理：无菌的直径为90mm平皿中加入制备的菌悬液0.2mL，涂布均匀，无菌操作台中自然晾干，形成菌膜，镜检。

不同剂量氮离子注入：将样品培养皿放入低能加速器(离子注入机)小靶室，打开培养皿盖，靶室抽真空。用氮离子(N⁺)进行注入，注入能量为30KeV，注入剂量依次为0(CK)，5×10¹⁴ions/cm²，1×10¹⁵ions/cm²，3×10¹⁵ions/cm²，7×10¹⁵ions/cm²，10×10¹⁵ions/cm²，靶室真空度为10^-3pa。

诱变后菌体的洗脱：离子注入后，每平皿加入4ml无菌PBS缓冲液，用橡胶块充分擦洗(重复两次)，将洗脱液置入含玻璃珠的大离心管中，充分振荡5min，待用。

诱变后菌株的液体培养及初步筛选：按注入剂量，分别取0.1mL处理后菌悬液稀释同样的倍数，分别涂布在0.8％Eth基本培养基平板上，然后放入28℃的恒温培养箱中培养4天，通过生长圈法初筛和摇瓶发酵复筛得到菌株JHN224。

②紫外线诱变

菌悬液的制备：250mL三角瓶装25mL液体完全培养基，接种斜面保存的新鲜JHN224，200rpm，28℃摇瓶培养至指数中后期，大约10h时取发酵液20mL于无菌的大离心管中，5000rpm、10min离心三次，再加入等体积的PBS缓冲液及无菌玻璃珠，充分振荡5min，使菌体尽可能分散成单细胞态的PBS菌悬液。

诱变：用无菌玻璃平皿装入10mL菌悬液，在磁力搅拌器作用下用紫外灯(20w，垂直照射距离30cm，紫外灯预先预热10min)照射，分别在照射0s，15s，30s，60s，90s，120s，150s时取菌液0.1mL，处理后菌悬液在红灯下用适量无菌PBS缓冲液稀释。

诱变后菌株平板培养：稀释后的菌液涂皿，28℃培养箱过夜培养(避光)。培养一定时间后，在菌落计数器下计数，并将各照射时间下的单位体积存活菌数和照射0s(即原菌液)的单位体积菌数作对比，计算其各自的存活率。

诱变后菌株的液体培养及初步筛选：取0.5mL紫外线诱变60s的菌液，无菌操作加入到含5mL0.6％Eth(乙硫氨酸)基本培养基的试管中黑暗培养36h，然后将菌液稀释到一定合适浓度，涂布在含0.6％Eth的基本培养基平板上，放置在28℃的培养箱中培养4天，通过生长圈法初筛和摇瓶发酵复筛得到L-异亮氨酸高产菌株——乳糖发酵短杆菌JHI4-102，遗传稳定性试验表明该菌株遗传性能稳定，甘油保存。

2、50～100L发酵罐发酵

挑取菌株制备成0.1mL菌悬液，经种子逐级扩大培养，按10％接种量转入70L自动控制发酵罐中，装液量40L，通风量200L/h，搅拌转速500r/min，培养温度30℃。采用补料分批发酵，发酵培养基组成为(g/L)：葡萄糖80，豆饼水解液20，硫酸铵10，磷酸二氢钾1.5，磷酸氢二钾3，硫酸镁0.5，硫酸锰0.015，蛋氨酸0.02，亮氨酸0.06，VB₁0.001，生物素130μg。在发酵32h开始，残糖浓度为5～15g/L时，补加1L480g/L葡萄糖补料液。每隔2h检测，当糖的浓度降低为5～15g/L时，就补加1L的补料液，直至10L补料液全部补完为止。在发酵32h开始补加10g/L硫酸铵，共计1L，补加方式为：在发酵32h补加250mL，60h补加250mL，72h补加250mL，84h补加250mL。在流加葡萄糖的同时，用氨水代替NaOH调节pH值同时持续供给氮源，氨水自动流加，维持pH值在7.0左右。采用以上参数发酵，L-异亮氨酸产量为32.7g/L。

3、提取纯化

①发酵液预处理：在发酵液中加入草酸并加热至80℃，保温3min，离心除去部分菌体和碳酸钙，上清液调节pH值到2，用质量浓度为40mg/L絮凝剂壳聚糖处理，过滤。

②超滤：超滤条件为：采用的超滤膜为聚丙烯腈超滤膜(10000)，操作温度45℃，操作压力0.2MPa。

③结晶：超滤液真空浓缩，加入乙醇结晶，于4℃静置过夜，过滤晶体，再次加入乙醇重结晶，真空干燥12h，最后得到白色鳞片状的L-异亮氨酸精品，纯度为99.2％。

实施例2一种L-异亮氨酸的发酵及分离纯化方法，按以下步骤依次进行：

1、同实施例1。

2、70L发酵罐发酵

挑取菌株制备成0.1mL菌悬液，经种子逐级扩大培养，按15％接种量转入70L自动控制发酵罐中，装液量30L，通风量300L/h，搅拌转速600r/min，培养温度32℃。采用补料分批发酵，发酵培养基组成为(g/L)：葡萄糖80，豆饼水解液20，硫酸铵10，磷酸二氢钾1.5，磷酸氢二钾3，硫酸镁0.5，硫酸锰0.015，蛋氨酸0.02，亮氨酸0.06，VB₁0.001，生物素130μg。在发酵32h开始，残糖浓度为5～15g/L时，补加0.5L480g/L葡萄糖补料液。每隔2h检测，当糖的浓度降低为5～15g/L时，就补加0.5L的补料液，直至10L补料液全部补完为止。在发酵32h开始补加8g/L硫酸铵，共计1L，补加方式为：在发酵32h补加500mL，72h补加500mL。在流加葡萄糖的同时，用氨水代替NaOH调节pH值同时持续供给氮源，氨水自动流加，维持pH值在7.2左右。采用以上参数发酵，L-异亮氨酸产量为31.5g/L。

3、提取纯化

①发酵液预处理：在发酵液中加入草酸并加热至80℃，保温3min，离心除去部分菌体和碳酸钙，上清液调节pH值到1，用质量浓度为50mg/L絮凝剂壳聚糖处理，过滤。

②超滤：超滤条件为：采用的超滤膜为聚砜超滤膜(50000)，操作温度40℃，操作压力0.18MPa。

③结晶：超滤液真空浓缩，加入乙醇结晶，于4℃静置过夜，过滤晶体，再次加入乙醇重结晶，真空干燥12h，最后得到白色鳞片状的L-异亮氨酸精品，纯度为98.5％。

实施例3一种L-异亮氨酸的发酵及分离纯化方法，按以下步骤依次进行：

1、同实施例1。

2、70L发酵罐发酵

挑取菌株制备成0.1mL菌悬液，经种子逐级扩大培养，按20％接种量转N70L自动控制发酵罐中，装液量50L，通风量100L/h，搅拌转速800r/min，培养温度28℃。采用补料分批发酵，发酵培养基组成为(g/L)：葡萄糖80，豆饼水解液20，硫酸铵10，磷酸二氢钾1.5，磷酸氢二钾3，硫酸镁0.5，硫酸锰0.015，蛋氨酸0.02，亮氨酸0.06，VB₁0.001，生物素130μg。在发酵32h开始，残糖浓度为5～15g/L时，补加1L480g/L葡萄糖补料液。每隔2h检测，当糖的浓度降低为5～15g/L时，就补加1L的补料液，直至10L补料液全部补完为止。在发酵32h开始补加6g/L硫酸铵，共计1L，补加方式为：在发酵32h补加333mL，60h补加333mL，72h补加333mL。在流加葡萄糖的同时，用氨水代替NaOH调节pH值同时持续供给氮源，氨水自动流加，维持pH值在6.8左右。采用以上参数发酵，L-异亮氨酸产量为31.3g/L。

3、提取纯化

①发酵液预处理：在发酵液中加入草酸并加热至80℃，保温3min，离心除去部分菌体和碳酸钙，上清液调节pH值到3，用质量浓度为30mg/L絮凝剂壳聚糖处理，过滤。

②超滤：超滤条件为：采用的超滤膜为聚丙烯腈超滤膜(30000)，操作温度50℃，操作压力0.15MPa。

③结晶：超滤液真空浓缩，加入乙醇结晶，于4℃静置过夜，过滤晶体，再次加入乙醇重结晶，真空干燥12h，最后得到白色鳞片状的L-异亮氨酸精品，纯度为99.0％。

Claims

1.一种L-异亮氨酸的发酵及分离纯化方法，主要通过以下步骤实现：

1)高产菌株筛选：新鲜乳糖发酵短杆菌JHI3-156用一定注入能量和注入剂量的氮离子(N⁺)注入，在0.8％Eth(乙硫氨酸)基本培养基平板上培养，通过生长圈法初筛和摇瓶发酵复筛得到菌株JHN224。新鲜的JHN224用紫外灯照射诱变，在含5mL0.6％Eth基本培养基的试管中黑暗培养后再在含0.6％Eth的基本培养基平板上培养，通过生长圈法初筛和摇瓶发酵复筛得到L-异亮氨酸高产菌株——乳糖发酵短杆菌JHI4-102(CGMCC No.8091)，具有良好的遗传稳定性。

2)发酵罐发酵：菌种经种子逐级扩大培养，一定条件下50L～100L发酵罐发酵。

3)提取纯化：发酵液经壳聚糖预处理后超滤，超滤液真空浓缩，乙醇结晶和重结晶，真空干燥，得到白色鳞片状的L-异亮氨酸精品。

2.根据权利要求1所述的N⁺注入-紫外线复合诱变方法，其特征在于：氮离子(N⁺)注入能量为30KeV，注入剂量依次为0(CK)、5×10¹⁴ions/cm²、1×10¹⁵ions/cm²、3×10¹⁵ions/cm²、7×10¹⁵ions/cm²、10×10¹⁵ions/cm²；紫外线20w，垂直照射距离30cm，照射时间为0s、15s、30s、60s、90s、120s、150s。

3.根据权利要求1所述的发酵条件，其特征在于：接种量5～20％，50～100L发酵罐装液量30％～70％，通风量100～300L/h，搅拌转速300～800r/min，培养温度28～32℃。采用补料分批发酵，在发酵32h开始，残糖浓度为5～15g/L时，补加0.5～1L480g/L葡萄糖补料液。每隔2h检测，当糖的浓度降低为5～15g/L时，就补加0.5～1L的补料液，直至10L补料液全部补完为止。在发酵32h开始补加5～10g/L硫酸铵，共计1L，补加方式为：在发酵32h补加500mL，72h补加500mL；在发酵32h补加333mL，60h补加333mL，72h补加333mL；在发酵32h补加250mL，60h补加250mL，72h补加250mL，84h补加250mL。在流加葡萄糖的同时，用氨水代替NaOH调节pH值同时持续供给氮源，氨水自动流加，维持pH值在6.8～7.2左右。

4.根据权利要求1所述的纯化方法，其特征在于：采用壳聚糖预处理后超滤的分离纯化方法。

5.根据权利要求1所述的分离纯化方法，其特征在于：在发酵液中加入草酸并加热、保温、离心后的上清液调节pH值1～3，壳聚糖质量浓度30～60mg/L；超滤膜采用聚砜超滤膜(50000)、聚丙烯腈超滤膜(10000和30000)，操作温度40～60℃，操作压力0.15～0.2MPa。