CN108841884A - 一种高效生产l-异亮氨酸的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种高效生产L‑异亮氨酸的方法,属于微生物发酵技术领域。本发明以乳糖发酵短杆菌(Brevibacterium lactofermentation)作为L‑异亮氨酸的生产菌株,将乳糖发酵短杆菌(Brevibacterium lactofermentation)与北京棒杆菌(Corynebacterium pekinense)进行共培养,使得乳糖发酵短杆菌(Brevibacterium lactofermentation)的产酸能力显著提升,从13g/L提高到21g/L,已可满足工业化生产需求。
Description
技术领域
本发明涉及一种高效生产L-异亮氨酸的方法,属于微生物发酵技术领域。
背景技术
L-异亮氨酸是人体必需的八种氨基酸之一,同时又是三种支链氨基酸之一,是合成人体激素、酶类的原料,具有促进蛋白质合成和抑制其分解的效果,在人体生命活动中起着重要作用,现已被广泛运于生物医药、组织工程、光化学、电化学、食品工业、化妆品等领域。在国外,L-异亮氨酸还被其大量用于乳牛催乳、制备饲料添加剂以及生产功能饮料。
目前,常用微生物发酵法生产L-异亮氨酸,而在微生物发酵法中,菌种起着至关重要的作用。
现有的L-异亮氨酸生产菌主要有谷氨酸棒杆菌、黄色短杆菌、大肠杆菌、乳糖发酵短杆菌、以钝齿棒杆菌以及粘滞赛氏杆菌,其中,除谷氨酸棒杆菌、黄色短杆菌外,其余均的产酸能力均十分低下,只有谷氨酸棒杆菌与黄色短杆菌的三分之一到二分之一。
为提高乳糖发酵短杆菌、以钝齿棒杆菌以及粘滞赛氏杆菌等的产酸水平,已经有许多学者从突变菌株、基因工程菌的角度,试图得到产酸水平提高的乳糖发酵短杆菌、以钝齿棒杆菌以及粘滞赛氏杆菌等。
但是,由于突变菌株的正向突变率极低、基因工程菌的构建也具有不确定性,因此,急需找到新的提高乳糖发酵短杆菌、以钝齿棒杆菌以及粘滞赛氏杆菌等菌产酸水平的思路。
发明内容
为解决上述问题,一种高效生产L-异亮氨酸的方法。此方法是以乳糖发酵短杆菌(Brevibacterium lactofermentation)作为L-异亮氨酸的生产菌株,将乳糖发酵短杆菌(Brevibacterium lactofermentation)与北京棒杆菌(Corynebacterium pekinense)进行共培养,使得乳糖发酵短杆菌(Brevibacterium lactofermentation)的产酸能力显著提升。
本发明的技术方案如下:
本发明提供了一种高效生产L-异亮氨酸的方法,所述方法为将乳糖发酵短杆菌(Brevibacterium lactofermentation)进行菌种培养;将北京棒杆菌(Corynebacteriumpekinense)进行菌种培养;将菌种培养得到的乳糖发酵短杆菌与北京棒杆菌进行共培养,即得L-异亮氨酸。
在本发明的一种实施方式中,所述将乳糖发酵短杆菌(Brevibacteriumlactofermentation)进行菌种培养的条件为温度29~33℃、时间14~20h、转速200~300rpm、通风量3~5M3/h。
在本发明的一种实施方式中,所述将乳糖发酵短杆菌(Brevibacteriumlactofermentation)进行菌种培养的条件为温度31℃、时间18h、转速270rpm、通风量4M3/h。
在本发明的一种实施方式中,所述将乳糖发酵短杆菌(Brevibacteriumlactofermentation)进行菌种培养的培养基A的成分包含葡萄糖90~100g/L、硫酸铵12~20g/L、玉米浆90~100g/L、磷酸二氢钾3~4g/L以及硫酸镁1~2g/L。
在本发明的一种实施方式中,所述将乳糖发酵短杆菌(Brevibacteriumlactofermentation)进行菌种培养的培养基A的成分包含葡萄糖96g/L、硫酸铵16g/L、玉米浆96g/L、磷酸二氢钾3.2g/L以及硫酸镁1.6g/L。
在本发明的一种实施方式中,所述培养基A的pH为6~7。
在本发明的一种实施方式中,所述培养基A的pH为6.8。
在本发明的一种实施方式中,所述将北京棒杆菌(Corynebacterium pekinense)进行菌种培养的条件为温度29~33℃、时间14~20h、转速200~300rpm。
在本发明的一种实施方式中,所述将北京棒杆菌(Corynebacterium pekinense)进行菌种培养的条件为温度30℃、时间16h、转速250rpm。
在本发明的一种实施方式中,所述将北京棒杆菌(Corynebacterium pekinense)进行菌种培养的培养基B的成分包含葡萄糖15~25g/L、硫酸铵3~8g/L、磷酸二氢钾0.5~1.5g/L、玉米浆25~35g/L、豆粕水解液2~4g/L、生物素95~105μg/L、硫胺素190~210μg/L。
在本发明的一种实施方式中,所述将北京棒杆菌(Corynebacterium pekinense)进行菌种培养的培养基B的成分包含葡萄糖20g/L、硫酸铵5g/L、磷酸二氢钾1g/L、玉米浆30g/L、豆粕水解液3g/L、生物素100μg/L、硫胺素200μg/L。
在本发明的一种实施方式中,所述将培养基B的pH为7~8。
在本发明的一种实施方式中,所述将培养基B的pH为7.4。
在本发明的一种实施方式中,所述共培养中乳糖发酵短杆菌与北京棒杆菌的接种比例为5~15:1。
在本发明的一种实施方式中,所述共培养中乳糖发酵短杆菌与北京棒杆菌的接种比例为10:1。
在本发明的一种实施方式中,所述共培养的条件为温度27~36℃、时间60~80h、转速100~150rpm、通风量80~260M3/h。
在本发明的一种实施方式中,所述共培养的条件为温度31℃、时间68h、转速135rpm、通风量180M3/h。
在本发明的一种实施方式中,所述共培养所用的培养基C的成分包含葡萄糖2430~3100g/L、硫酸铵0~400g/L、玉米浆400~700g/L、磷酸二氢钾0~20g/L、硫酸镁0~10g/L。
在本发明的一种实施方式中,所述共培养所用的培养基C的成分包含葡萄糖2800g/L、硫酸铵350g/L、玉米浆550g/L、磷酸二氢钾15g/L、硫酸镁5g/L。
在本发明的一种实施方式中,所述共培养所用的培养基C的pH为6~8。
在本发明的一种实施方式中,所述共培养所用的培养基C的pH为6.7。
本发明提供了应用上述一种高效生产L-异亮氨酸的方法生产得到的L-异亮氨酸。
本发明提供了上述一种高效生产L-异亮氨酸的方法在生产L-异亮氨酸方面的应用。
有益效果:
本发明以乳糖发酵短杆菌(Brevibacterium lactofermentation)作为L-异亮氨酸的生产菌株,将乳糖发酵短杆菌(Brevibacterium lactofermentation)与北京棒杆菌(Corynebacterium pekinense)进行共培养,使得乳糖发酵短杆菌(Brevibacteriumlactofermentation)的产酸能力显著提升,从13g/L提高到21g/L,已可满足工业化生产需求。
具体实施方式
下面结合实施例与对比例,对本发明进行进一步的阐述。
下述实施例中涉及的培养基如下:
培养基A:葡萄糖96g/L、硫酸铵16g/L、玉米浆96g/L、磷酸二氢钾3.2g/L以及硫酸镁1.6g/L,pH 6.8
培养基B:葡萄糖20g/L、硫酸铵5g/L、磷酸二氢钾1g/L、玉米浆30g/L、豆粕水解液3g/L、生物素100μg/L、硫胺素200μg/L,pH 7.4
培养基C:葡萄糖2800g/L、硫酸铵350g/L、玉米浆550g/L、磷酸二氢钾15g/L、硫酸镁5g/L,pH 6.7
下述实施例中涉及的检测方法如下:
L-异亮氨酸产量的检测方法如下:
纸层析法:
1、点样:用微量定样器,按纸色谱法检查,点样1ul,展开剂为正丁醇:冰醋酸:水=5:2:1;
2、展开:展开时间≥3h,结束后晾干色谱滤纸;
3、茚三酮显色:将晾干后的色谱滤纸在盛有2%茚三酮显色剂的瓷托盘中浸润,风干后置105℃烘箱中干燥5min即呈现蓝紫色斑点,按大小一致的面积剪下显色斑点,洗脱;
4、洗脱:将剪下的色斑置于具塞试管中用洗脱剂(75%乙醇:0.2%Cu5SO4·5H2O=39:1),各5ml进行洗脱;
5、吸光度测定:取洗脱液在520nm处测定吸光度,根据吸光度在标准曲线上查出相应的含量;
6、标准曲线绘制:根据发酵液的实际产酸率,选取相应的5个浓度的梯度标准样,同样品液一起点样、展开、显色、洗脱,测定520nm处吸光度,以标准样为横坐标,吸光度为纵坐标,绘制标准曲线。
实施例1
将乳糖发酵短杆菌(Brevibacterium lactofermentation)菌粉以0.1g/L的接种量接种于装液量为40%的培养基A中进行菌种培养,条件为温度31℃、时间18h、转速270rpm、通风量4M3/h,得到乳糖发酵短杆菌菌种;
将北京棒杆菌(Corynebacterium pekinense)菌粉以0.1g/L的接种量接种于装液量为40%的培养基B中进行菌种培养,条件为温度30℃、时间16h、转速250rpm,得到北京棒杆菌菌种;
将得到的两种菌种分别以0.2g/L、0.02g/L的接种量接种于装液量为40%的培养基C进行发酵培养,条件为温度31℃、时间68h、转速135rpm、通风量180M3/h,得到发酵液。
将发酵液进行L-异亮氨酸产量检测,L-异亮氨酸产量为21.4g/L。
实施例2
将乳糖发酵短杆菌(Brevibacterium lactofermentation)菌粉以0.1g/L的接种量接种于装液量为40%的培养基A中进行菌种培养,条件为温度31℃、时间18h、转速270rpm、通风量4M3/h,得到乳糖发酵短杆菌菌种;
将北京棒杆菌(Corynebacterium pekinense)菌粉以0.1g/L的接种量接种于装液量为40%的培养基B中进行菌种培养,条件为温度30℃、时间16h、转速250rpm,得到北京棒杆菌菌种;
将得到的两种菌种分别以0.2g/L、0.01g/L的接种量接种于装液量为40%的培养基C进行发酵培养,条件为温度31℃、时间68h、转速135rpm、通风量180M3/h,得到发酵液。
将发酵液进行L-异亮氨酸产量检测,L-异亮氨酸产量为19.2g/L。
实施例3
将乳糖发酵短杆菌(Brevibacterium lactofermentation)菌粉以0.1g/L的接种量接种于装液量为40%的培养基A中进行菌种培养,条件为温度31℃、时间18h、转速270rpm、通风量4M3/h,得到乳糖发酵短杆菌菌种;
将北京棒杆菌(Corynebacterium pekinense)菌粉以0.1g/L的接种量接种于装液量为40%的培养基B中进行菌种培养,条件为温度30℃、时间16h、转速250rpm,得到北京棒杆菌菌种;
将得到的两种菌种分别以0.2g/L、0.03g/L的接种量接种于装液量为40%的培养基C进行发酵培养,条件为温度31℃、时间68h、转速135rpm、通风量180M3/h,得到发酵液。
将发酵液进行L-异亮氨酸产量检测,L-异亮氨酸产量为20.1g/L。
对比例1
具体步骤如下:
将乳糖发酵短杆菌(Brevibacterium lactofermentation)菌粉以0.1g/L的接种量接种于装液量为40%的培养基A中进行菌种培养,条件为温度31℃、时间18h、转速270rpm、通风量4M3/h,得到乳糖发酵短杆菌菌种;将得到的菌种以0.2g/L的接种量接种于装液量为40%的培养基C进行发酵培养,条件为温度31℃、时间68h、转速135rpm、通风量180M3/h,得到发酵液。
将发酵液进行L-异亮氨酸产量检测,L-异亮氨酸产量为13.9g/L。
对比例2
将北京棒杆菌(Corynebacterium pekinense)菌粉以0.1g/L的接种量接种于装液量为40%的培养基B中进行菌种培养,条件为温度30℃、时间16h、转速250rpm,得到北京棒杆菌菌种;将得到的菌种以0.2g/L的接种量接种于装液量为40%的培养基C进行发酵培养,条件为温度31℃、时间68h、转速135rpm、通风量180M3/h,得到发酵液。
将发酵液进行L-异亮氨酸产量检测,L-异亮氨酸产量为0.8g/L。
对比例3
将乳糖发酵短杆菌(Brevibacterium lactofermentation)菌粉以0.1g/L的接种量接种于装液量为40%的培养基A中进行菌种培养,条件为温度31℃、时间18h、转速270rpm、通风量4M3/h,得到乳糖发酵短杆菌菌种;
将北京棒杆菌(Corynebacterium pekinense)菌粉以0.1g/L的接种量接种于装液量为40%的培养基B中进行菌种培养,条件为温度30℃、时间16h、转速250rpm,得到北京棒杆菌菌种;
将得到的两种菌种分别以0.2g/L、0.001g/L的接种量接种于装液量为40%的培养基C进行发酵培养,条件为温度31℃、时间68h、转速135rpm、通风量180M3/h,得到发酵液。
将发酵液进行L-异亮氨酸产量检测,L-异亮氨酸产量为14.5g/L。
对比例4
将乳糖发酵短杆菌(Brevibacterium lactofermentation)菌粉以0.1g/L的接种量接种于装液量为40%的培养基A中进行菌种培养,条件为温度31℃、时间18h、转速270rpm、通风量4M3/h,得到乳糖发酵短杆菌菌种;
将北京棒杆菌(Corynebacterium pekinense)菌粉以0.1g/L的接种量接种于装液量为40%的培养基B中进行菌种培养,条件为温度30℃、时间16h、转速250rpm,得到北京棒杆菌菌种;
将得到的两种菌种分别以0.2g/L、0.04g/L的接种量接种于装液量为40%的培养基C进行发酵培养,条件为温度31℃、时间68h、转速135rpm、通风量180M3/h,得到发酵液。
将发酵液进行L-异亮氨酸产量检测,L-异亮氨酸产量为16.7g/L。
对比例5
将乳糖发酵短杆菌(Brevibacterium lactofermentation)菌粉以0.1g/L的接种量接种于装液量为40%的培养基A中进行菌种培养,条件为温度31℃、时间18h、转速270rpm、通风量4M3/h,得到乳糖发酵短杆菌菌种;
将北京棒杆菌(Corynebacterium pekinense)菌粉以0.1g/L的接种量接种于装液量为40%的培养基B中进行菌种培养,条件为温度30℃、时间16h、转速250rpm,得到北京棒杆菌菌种;
将得到的两种菌种分别以0.2g/L、0.05g/L的接种量接种于装液量为40%的培养基C进行发酵培养,条件为温度31℃、时间68h、转速135rpm、通风量180M3/h,得到发酵液。
将发酵液进行L-异亮氨酸产量检测,L-异亮氨酸产量为15.9g/L。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上,但其并非用以限定本发明,任何熟悉此技术的人,在不脱离本发明的精神和范围内,都可做各种的改动与修饰,因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
Claims (10)
1.一种高效生产L-异亮氨酸的方法,其特征在于,所述方法为将乳糖发酵短杆菌(Brevibacterium lactofermentation)进行菌种培养;将北京棒杆菌(Corynebacteriumpekinense)进行菌种培养;将菌种培养得到的乳糖发酵短杆菌与北京棒杆菌进行共培养,即得L-异亮氨酸。
2.如权利要求1所述的一种高效生产L-异亮氨酸的方法,其特征在于,所述将乳糖发酵短杆菌(Brevibacterium lactofermentation)进行菌种培养的条件为温度29~33℃、时间14~20h、转速200~300rpm、通风量3~5M3/h。
3.如权利要求1或2所述的一种高效生产L-异亮氨酸的方法,其特征在于,所述将乳糖发酵短杆菌(Brevibacterium lactofermentation)进行菌种培养的培养基A的成分包含葡萄糖90~100g/L、硫酸铵12~20g/L、玉米浆90~100g/L、磷酸二氢钾3~4g/L以及硫酸镁1~2g/L。
4.如权利要求1-3任一所述的一种高效生产L-异亮氨酸的方法,其特征在于,所述将北京棒杆菌(Corynebacterium pekinense)进行菌种培养的条件为温度29~33℃、时间14~20h、转速200~300rpm。
5.如权利要求1-4任一所述的一种高效生产L-异亮氨酸的方法,其特征在于,所述将北京棒杆菌(Corynebacterium pekinense)进行菌种培养的培养基B的成分包含葡萄糖15~25g/L、硫酸铵3~8g/L、磷酸二氢钾0.5~1.5g/L、玉米浆25~35g/L、豆粕水解液2~4g/L、生物素95~105μg/L、硫胺素190~210μg/L。
6.如权利要求1-5任一所述的一种高效生产L-异亮氨酸的方法,其特征在于,所述共培养中乳糖发酵短杆菌与北京棒杆菌的接种比例为5~15:1。
7.如权利要求1-6任一所述的一种高效生产L-异亮氨酸的方法,其特征在于,所述共培养的条件为温度27~36℃、时间60~80h、转速100~150rpm、通风量80~260M3/h。
8.如权利要求1-7任一所述的一种高效生产L-异亮氨酸的方法,其特征在于,所述共培养所用的培养基C的成分包含葡萄糖2430~3100g/L、硫酸铵0~400g/L、玉米浆400~700g/L、磷酸二氢钾0~20g/L、硫酸镁0~10g/L。
9.应用权利要求1-8任一所述的一种高效生产L-异亮氨酸的方法生产得到的L-异亮氨酸。
10.权利要求1-8任一所述的一种高效生产L-异亮氨酸的方法在生产L-异亮氨酸方面的应用。
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