CN104711217B - 一种新型的促进乳酸菌生长的生物活性肽 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种蚕豆来源的小分子肽的结构鉴定及其促进乳酸菌生长的应用。本发明所提供的蚕豆肽结构为Ser‑Ala‑Gln三肽(lactic acid bacteria growth‑stimulating peptide(LGSP))。通过如下步骤的方法制备得到的：以蚕豆蛋白为原料，采用单一碱性蛋白酶进行控制水解，采用pH‑stat法监控DH值，并利用葡聚糖凝胶Sephadex G‑25和高效液相色谱法分离纯化，得到单一组分。利用基质辅助激光解吸飞行时间质谱MOLDI‑TOF‑MS进行分子量分析和氨基酸序列鉴定。鉴定出蚕豆促生长肽序列为Ser‑Ala‑Gln。本发明所制备的蚕豆来源的促乳酸菌生长肽，分子量小，容易被肠道直接吸收，提升肠道中有益菌的数量；发现了蚕豆肽的新功能和营养特性，提高了蚕豆利用的附加值。

Description

一种新型的促进乳酸菌生长的生物活性肽

技术领域：

本发明涉及一种蚕豆来源的小分子肽及其促进乳酸菌生长的应用。

背景技术：

乳酸菌和双歧杆菌皆为肠道有益菌，可在人体肠道中生长、繁殖。调节肠道菌群平衡，抑制并清除肠道中对人体具有潜在危害的细菌。同时，乳酸菌广泛应用于食品生产中，常用于制造酸奶、乳酪、酸菜等发酵食品。在牛奶中加入乳酸菌经发酵后牛奶中的成分被转化为短肽、氨基酸等小分子物质更容易被人体吸收。经乳酸菌发酵的牛奶，能够促进胃液分泌，促进消化，对胃具有保养功能，抑制肠道内腐败菌的生产，其保健价值远远高于牛奶。但是乳酸菌由于缺乏各种生物合成途径，对营养要求十分苛刻，限制了乳酸菌的高密度生长。目前用于促进乳酸菌增殖的生物活性肽包括大豆水解物、乳清蛋白水解物、酪蛋白水解物。但对其他来源的促进乳酸菌生长的生物活性肽的研究则较少。

蚕豆是人类最早栽培的豆类作物之一，蚕豆中含有丰富的营养物质。其主要成分是淀粉，含量高达45～47％；蚕豆中蛋白质含量在豆类中仅次于大豆，含量高达25～30％，并且其氨基酸组成也接近于人体和动物所需要的理想比例，所以蚕豆被誉为植物蛋白质的新来源；但我国蚕豆主要用于生产粉丝、粉皮，这仅仅利用其中的淀粉部分，而作为重要的营养成分的蛋白质未被利用或部分回收作为饲料，这不仅是一种巨大的浪费，而且还会造成环境的污染。

目前，虽然人们承认蚕豆的营养价值和经济价值，但对其保健食品和医药等方面开发利用不够，因此充分挖掘我国蚕豆资源潜力，不仅可以解决植物蛋白资源缺乏，同时可提高蚕豆利用的附加值。

因此，为解决上述不足，本发明利用酶解的方法生产促进乳酸菌生长的活性肽，并得到促进乳酸菌生长的活性肽氨基酸序列。本发明所制备的蚕豆来源的促乳酸菌生长肽，分子量小，容易被肠道直接吸收，提升肠道中有益菌的数量：同时提高了蚕豆蛋白利用的附加值。

发明内容：

本发明所提供的小分子促乳酸菌生长生物活性肽肽，是通过如下步骤的方法制备得到的：

1、一种新型促乳酸菌生长活性肽，其结构为Ser-Ala-Gln。

2、该活性肽的制备方法采用酶法水解蚕豆蛋白制备，其特征在于，以蚕豆为原料，提取蚕豆蛋白，采用单一碱性蛋白酶进行控制水解，采用pH-stat法监控DH值。获得蚕豆蛋白水解物。

3、根据权利要求1、2所述蚕豆蛋白水解物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)蚕豆蛋白的预处理及碱性蛋白酶对蚕豆蛋白的水解作用，采用pH-stat法监控DH值达到15～18％。

(2)蚕豆蛋白水解物的分离纯化采用葡聚糖凝胶Sephadex G-25及高效液相色谱法，得到单一的促生长活性组分。

(3)采用基质辅助激光解吸飞行时间质谱MOLDI-TOF-MS及肽段合成方法分析证明促乳酸菌生长活性肽的氨基酸序列为Ser-Ala-Gln。

4、根据权利1或2或3所述的蚕豆蛋白水解物及分离组分对乳酸菌(保加利亚乳杆菌、嗜热链球菌、嗜酸乳杆菌等)生长的促进作用试验方法如下：

a.所用菌种为实验室保存的乳酸菌，所用培养基为MRS培养基。

b.将保加利亚乳杆菌等按3～5％接种量接种于含有不同组分的MRS液体培养基中，37℃培养20h，在660nm下测量发酵液的OD值，检测对乳酸菌生长的促进作用。

本发明的效果是：

通过本发明，可得到蚕豆蛋白水解物及不同纯度的含有促进乳酸菌生长的蚕豆肽。可根据产品的不同需求进行配伍。

通过凝胶色谱和反相高效液相色谱等色谱分离方法，我们最终获得了单一多肽组分。根据基质辅助激光解吸飞行时间质谱MOLDI-TOF-MS测得分子量为304Da，氨基酸序列为Ser-Ala-Gln。并且合成的Ser-Ala-Gln多肽与提取的天然多肽具有相同的功效。

其目的意义在于：为发现一系列新的多肽产品提供思路和方法，同时为研究和开发多肽的新功效作用提供数据，有助于满足人们日益提高的生活水平的需要。

总之，本发明工艺简单，应用范围广；对今后开发利用含有蚕豆多肽成分进行药品、保健品等各种产品的生产奠定了基础。

附图说明：

附图1是促乳酸菌生长生物活性肽制备流程图

附图2是基质辅助激光解吸飞行时间质谱MOLDI-TOF-MS谱图。

附图3是分离蚕豆促生长肽对保加利亚乳杆菌生长促进作用。

附图4是Ser-Ala-Gln(SAQ)合成肽对保加利亚乳杆菌生长促进作用。

具体实施方式：

实施例1：基质辅助激光解吸飞行时间质谱MOLDI-TOF-MS测定单一活性组分分子量及氨基酸序列。

将分离纯化得到的单一活性组分利用基质辅助激光解吸飞行时间质谱MOLDI-TOF-MS测定其分子量及氨基酸序列，操作步骤如下：

1.实验仪器：

2.实验试剂：

3.操作步骤：

a清洗样品板；

b校正仪器标准品的配制、点样、检测；

c点样、检测：

①将0.4μL样品加0.3μL的基质点到样品板上，室温晾干

②打开4000Series software，将样品板放入质谱仪

③新建一个spotset，打开校正仪器的采集方法和处理模式，校正仪器

④打开测试未知样品的采集方法和处理模式，进行样品分析。一级激光强度3200，检测分子量范围300-1000Da，选用正离子反射模式进行质谱分析。

⑤将样品谱图与基质谱图进行对比分析，得出样品m/z。

⑥将得到的样品峰进行二级质谱分析，确定氨基酸序列。

通过比对确定样品的m/z为305，由此确定目的多肽分子量为304Da(图2a)，根据二级质谱谱峰(图2b)分析得到蚕豆促乳酸菌生长肽的氨基酸序列为Ser-Ala-Gln。该成分对保加利亚乳杆菌的生长具有促进作用(图3)。

实施例2：对鉴定的蚕豆促生长肽进行肽段合成，合成序列为Ser-Ala-Gln。合成后利用RP-HPLC检测其纯度大于95％，同时通过质谱检测确定多肽合成质量。样品以冻干状态保存。将冻干样品分别制备成0.008～0.02mg/mL添加到MRS培养基中，将保加利亚乳杆菌等按3～5％接种量接种于含有不同组分的MRS液体培养基中，37℃培养20h，在660nm下测量发酵液的OD值，检测对乳酸菌生长的促进作用。添加量为0.008mg/mL时，与对照组相比OD值提升了0.3(图4)。

Claims (2)

1.一种促乳酸菌生长活性肽，其结构为Ser-Ala-Gln，分子量为304Da，制备方法为：合成。

2.一种利用权利要求1所述活性肽促进保加利亚乳杆菌生长的试验方法，其特征在于：将保加利亚乳杆菌按3～5％接种量接种于含有不同组分的MRS液体培养基中，37℃培养20h，在660nm下测量发酵液的OD值，检测对乳酸菌生长的促进作用；所用菌为实验室保存的乳酸菌，所用培养基为MRS培养基。