CN116473240A - 大豆肽联合乳酸菌在制备抑制肠道病原菌产品中的应用 - Google Patents

大豆肽联合乳酸菌在制备抑制肠道病原菌产品中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种大豆肽联合乳酸菌在制备抑制肠道病原菌产品中的应用，属于肠道调节技术领域。本发明所述大豆肽通过促进罗伊氏乳杆菌LR08活细胞数和产酸量的提升，与大肠杆菌ESS竞争氮源能力的提升，并协同其抑制大肠杆菌ESS的活性，以解决肠道菌群紊乱相关的潜在问题，达到调节肠道菌群、维护肠道健康的技术效果。

Description

大豆肽联合乳酸菌在制备抑制肠道病原菌产品中的应用
技术领域
本发明属于肠道调节技术领域，尤其涉及一种大豆肽联合乳酸菌在制备抑制肠道病原菌产品中的应用。
背景技术
肠道疾病是目前国内外频发的疾病，肠道疾病与不良的生活习惯有关，例如熬夜、抽烟酗酒、饮食不规律、长期服用药物等，都会引起肠道紊乱，导致益生菌减少，致病菌增多，严重时导致死亡。2019年欧盟报告了2621例人类李斯特菌病确诊病例。世界卫生组织报道每年约有42万人死于摄入被致病菌感染的食物。因此，维持肠道稳态，调节肠道菌群非常重要。
目前蛋白质类物质也被证明具有潜在的益生功能，能显著促进双歧杆菌、嗜酸乳杆菌、植物乳杆菌等益生菌的生长和代谢，从而起到调节肠道菌群的作用。大豆肽具有降血糖、降血压、调节免疫、缓解焦虑等功能的生物活性物质，具有潜在的益生功能。然而，关于大豆肽在肠道中主要发挥的作用尚不清楚，其是否能协同乳酸菌抑制致病菌目前也未有报道。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种大豆肽联合乳酸菌在制备抑制肠道病原菌产品中的应用。
为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：
本发明提供了大豆肽联合乳酸菌在制备抑制肠道病原菌产品中的应用。
优选的，所述大豆肽中相对分子质量低于1000Da的占总质量的85％以上。
优选的，所述大豆肽与乳酸菌协同抑制肠道病原菌。
优选的，所述乳酸菌为罗伊氏乳杆菌LR08。
优选的，所述肠道病原菌为大肠杆菌ESS。
优选的，所述大豆肽能提高乳酸菌的活性和产酸能力。
优选的，所述大豆肽能提高罗伊氏乳杆菌LR08利用氮源的速率从而提高与大肠杆菌ESS竞争营养的能力。
优选的，所述产品包括保健品、食品或者药品。
本发明还提供了一种含有大豆肽的培养基，以MRS为基础培养基，以大豆肽替换MRS培养基中的一半氮源；所述大豆肽为经体外模拟胃肠道消化后的大豆肽。
优选的，所述大豆肽在所述培养基中的浓度为12-14g/L。
相对于现有技术，本发明具有如下有益效果：
本发明提供了一种大豆肽联合乳酸菌在制备抑制肠道病原菌产品中的应用，所述大豆肽通过促进罗伊氏乳杆菌LR08活细胞数和产酸量的提升，其与大肠杆菌ESS竞争氮源能力的提升，并协同其抑制大肠杆菌ESS的活性，以解决肠道菌群紊乱相关的潜在问题，达到调节肠道菌群、维护肠道健康的技术效果。
附图说明
图1为不同处理对罗伊氏乳杆菌LR08和大肠杆菌ESS形态、活菌数和有机酸的影响；
图2不同处理对罗伊氏乳杆菌LR08抑制大肠杆菌ESS作用的影响；
图3不同处理对罗伊氏乳杆菌LR08和大肠杆菌ESS利用氮源的影响。
具体实施方式
本发明提供了大豆肽联合乳酸菌在制备抑制肠道病原菌产品中的应用。
在本发明中，所述大豆肽中相对分子质量低于1000Da优选占总质量的85％以上。
本发明对所述大豆肽的制备方法没有特殊限定，采用本领域常用方法即可。作为一种可实施方式，优选包括：1)将大豆清洗、烘干、粉碎、过筛，得到大豆粉；2)采用碱提酸沉法提取所述大豆粉中的大豆蛋白；3)将所述大豆蛋白用复合酶进行酶解，得到大豆蛋白酶解产物；4)采用不同分子量的膜分离所述富硒大豆蛋白酶解产物，得到大豆肽。该优选制备方法为申请号为201610021384.4专利实施例1中的技术方案。本发明所述大豆肽中相对分子质量低于1000Da占总质量的85％以上，含3-5个氨基酸残基的肽占69.3％，且其中73.6％具有亲水性，超过5个氨基酸的肽多为疏水性的，占82.3％。此外，其中一些肽还具有碳末端为精氨酸或碳末端第二位为脯氨酸的特点，分别占14.18％和51.34％。
本发明所述乳酸菌为罗伊氏乳杆菌LR08；所述肠道病原菌为大肠杆菌ESS；本发明所述罗伊氏乳杆菌LR08与大肠杆菌ESS均来自于中国普通微生物菌种保藏管理中心；所述罗伊氏乳杆菌LR08的保藏编号为CGMCCNo.1.12733，大肠杆菌ESS的保藏编号为CGMCCNo.1.12881。
本发明所述大豆肽与乳酸菌协同抑制肠道病原菌；本发明所述大豆肽能提高乳酸菌的活性和产酸能力；所述大豆肽在病原菌存在的环境下仍能够提高乳酸菌活菌数；所述大豆肽能提高乳酸菌利用氮源能力。
本发明根据不同的培养基配方，分为四组：对照组、空白组、大豆肽组和大豆蛋白组，分别将罗伊氏乳杆菌LR08和大肠杆菌ESS接种于不同的培养基中，通过单培养和共培养的菌液检测相应的增殖和产酸情况。实验结果表明：大豆肽对单培养的罗伊氏乳杆菌LR08促进增殖和产酸的效果更为显著；共培养中大肠杆菌活菌数的减少率在大豆肽组和大豆蛋白组中高于空白组和对照组，大豆肽与罗伊氏乳杆菌LR08共同作用大肠杆菌时，其活菌数显著低于大豆肽单独作用，表明消化后的大豆肽协同罗伊氏乳杆菌LR08抑制了大肠杆菌ESS的增殖。
本发明所述大豆肽能提高罗伊氏乳杆菌LR08利用氮源的速率以及与大肠杆菌ESS竞争营养的能力。
本发明将罗伊氏乳杆菌LR08和大肠杆菌ESS接种到不同的处理组中，收集菌液，离心收集上清液，测量蛋白质浓度。实验结果表明：使用含有大豆肽的培养基后，罗伊氏乳杆菌LR084 h的氮源利用率提升了19.58％，而大肠杆菌ESS则下降了3.32％，并且直到16h罗伊氏乳杆菌LR08的氮源利用率仍比大肠杆菌ESS高18.36％，表明大豆肽显著提高了罗伊氏乳杆菌LR08对氮源的利用能力以及利用速率，从而在罗伊氏乳杆菌LR08与大肠杆菌ESS竞争过程中，仍能促进其活性，且抑制大肠杆菌ESS的增殖。
本发明所述产品优选包括保健品、食品或者药品。
本发明还提供了一种含有大豆肽的培养基，以MRS为基础培养基，添加大豆肽；所述大豆肽为经体外模拟胃肠道消化后的大豆肽。
本发明所述大豆肽在所述培养基中的浓度优选为12-14g/L，更优选为13.214g/L。
下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
大豆肽的制备
1)将大豆清洗、烘干、粉碎、过筛，得到大豆粉；
2)采用碱提酸沉法提取所述大豆粉中的大豆蛋白；
3)将所述大豆蛋白用复合酶进行酶解，得到大豆蛋白酶解产物；
4)采用膜分离所述富硒大豆蛋白酶解产物，得到大豆肽；
所述膜分离所用膜的材质为含有重量百分比的Cr：15～40％，W：5～15％，Ti：5～25％的金属膜。
制备得到的大豆肽含人体所需8种必需氨基酸，质量百分含量85％以上相对分子质量低于1000Da。
实施例2
模拟胃肠道消化
1、不同培养液的分组
(1)大豆肽培养液的制备
1)将实施例1的大豆肽进行体外模拟胃肠道消化，用5mol/L HCl调节pH至2.0后加入胃蛋白酶(酶底物比为1:35w/w)，在37℃水浴中搅拌1h后再用饱和NaHCO3溶液和5mol/LNaOH分别将pH调节至5.3和7.5，加入胰酶(酶底物比为1:25w/w)，在37℃下继续搅拌2h，然后在沸水中搅拌10min以终止消化，冷却后放入-40℃冰箱冷冻48h，再进行冷冻干燥36h后得到消化后的大豆肽；
2)将步骤1)中消化后的大豆肽进行凯氏定氮，测定其氮含量。
3)将步骤2)中消化后的大豆肽与乳酸杆菌所需的其他氮源及营养物质混合后进行溶解得到浅黄色溶液，浅黄色溶液中大豆肽和其他氮源为氮含量比为1:1复合物，其他氮源为重量比为10:5:4的蛋白胨、牛肉粉、酵母浸粉的混合物，营养物质由以下浓度的原料组成：磷酸氢二钾2g/L、无水乙酸钠5g/L、硫酸镁0.2g/L、柠檬酸三胺2g/L、硫酸锰0.05g/L、吐温80 1g/L；
4)将步骤3)浅黄色溶液进行高压灭菌，高压灭菌条件为121℃，15min，冷却后，加入过0.22无菌滤膜除菌的0.5g/mL的无菌葡萄糖溶液，得到大豆肽培养液，以体积分数计无菌葡萄糖溶液为浅黄色溶液的4％。
(2)大豆蛋白培养液的制备
具体实施方式和步骤(1)相同，不同的是将大豆肽替换为大豆蛋白(山东御馨生物科技有限公司)。
(3)根据不同的培养基配方，分为四组：对照组、空白组、大豆肽组和大豆蛋白组：
空白组：缺少一半氮源的MRS培养基(LN)。
大豆蛋白组：用大豆蛋白替换MRS培养基中的一半氮源(dpro)。
大豆肽组：用大豆肽替换MRS培养基中的一半氮源(dpep)。
对照组：MRS培养基。
各组在氮源含量和种类上有区分，其他营养物质的种类和添加量均一致，具体成分见表1。
表1不同分组的培养基配方
2、乳酸菌和大肠杆菌的单培养
(1)罗伊氏乳杆菌LR08培养：
普通培养基：MRS；
冻存液：0.5mL菌液和0.5mL50％的甘油；
培养条件：37℃震荡；
传代：稳定期时以0.2％的接种量使用普通MRS培养基；
单培养：在普通MRS培养基中传代培养24h后，将1×108CFU的罗伊氏乳杆菌LR08分别移入表14种不同分组的50mL MRS培养基中培养，在非控制pH条件下，取四个时间点(4h,8h,12h,16h)进行稀释平板涂布，各分组重复三次。
(2)大肠杆菌ESS培养：
普通培养基：MRS；
冻存液：0.5mL菌液+0.5mL50％的甘油；
培养条件：37℃震荡；
传代：稳定期时以0.2％的接种量使用MRS培养基传代；
单培养：在普通LB培养基中传代培养24h后，将1×108CFU的大肠杆菌ESS分别移入表14种不同分组的50mL MRS培养基中培养，在非控制pH条件下，取四个时间点(4h,8h,12h,16h)进行稀释平板涂布，各分组重复三次。
3、乳酸菌和大肠杆菌的共培养
将罗伊氏乳杆菌LR08(中国普通微生物菌种保藏管理中心)与大肠杆菌ESS(中国普通微生物菌种保藏管理中心)共培养：首先分别在MRS培养基中37℃连续传代培养24h后，将1×108CFU的罗伊氏乳杆菌LR08和等量大肠杆菌ESS分别移入上述4种不同分组的50mLMRS培养基中共培养，在非控制pH条件下，取四个时间点(4h,8h,12h,16h)进行稀释平板涂布，各分组重复三次。
4、测定罗伊氏乳杆菌LR08产乳酸和乙酸产量
采用高效液相色谱法测定罗伊氏乳杆菌LR08产生乳酸和乙酸的量：取出单培养和共培养中不同培养时间的各组菌液2mL，10000rmp离心10min，取上清液放入液氮中速冻30s，于-80℃保存待用，采用Aminex HPX-87H(300mm×7.8mm,Bio-Rad,Richmond CA,USA)色谱柱，流动相为13mmol的硫酸，流速0.8mL/min，上样量10uL，柱温65℃，分别测定不同浓度标准品乳酸、乙酸的出峰时间和峰面积，用外标法得出菌液中乳酸和乙酸的含量，具体结果见图1。
由图1可知，大豆蛋白组和大豆肽组均会促进罗伊氏乳杆菌LR08各时期的增殖和乳酸及乙酸的产生量，且大豆肽对罗伊氏乳杆菌LR08促进增殖和产酸的效果更为显著；当罗伊氏乳杆菌LR08与大肠杆菌ESS共培养时，大豆蛋白组和大豆肽组仍能促进罗伊氏乳杆菌LR08的生长和产酸，大豆肽组和大豆蛋白组中罗伊氏乳杆菌LR08活菌数的减少率显著低于空白组和对照组，而共培养中大肠杆菌活菌数的减少率在大豆肽组和大豆蛋白组中高于空白组和对照组，大豆肽与罗伊氏乳杆菌LR08共同作用大肠杆菌时，其活菌数显著低于大豆肽单独作用，表明消化后的大豆肽协同罗伊氏乳杆菌LR08抑制了大肠杆菌ESS的增殖。
5、罗伊氏乳杆菌LR08对大肠杆菌ESS的抗菌活性
采用孔扩散法评估罗伊氏乳杆菌LR08对大肠杆菌ESS的抗菌活性。
将罗伊氏乳杆菌LR08在不同处理中培养4、8、12和16h，并通过在冷藏(4℃)下以10000rpm离心15min回收上清液。使用CV100-DNA浓缩真空离心机(JIAI MLI，中国)将每个处理的培养基和上清液浓缩5倍，以获得浓缩培养基和无菌上清液(CFS)。记录CFS的pH值。用1M NaOH将CFS pH调节至7，以获得经中和处理的无菌上清液(CNS)。CFS和CNS用0.22μm孔径的滤膜再次除菌，并在4℃下储存。
将培养12h的大肠杆菌ESS悬浮液稀释至10-2，并将1mL稀释的细菌溶液接种到含有20mL LB培养基的培养皿中，使培养基在室温下硬化20min。用打孔器制作直径为8mm的孔，并用100μL CFS或CNS填充，在4℃下扩散12h，然后在37℃下孵育6-8h。使用菌落计数器拍摄并记录抑制圈的大小。通过测量孔周围的透明区得到抗菌活性。具体结果如图2和表2所示，
表2罗伊氏乳杆菌LR08的CFS pH值及对大肠杆菌ESS抑制区的直径(mm)
由图2和表2可知，在12h时，MRS组(30.24mm)和大豆肽组(29.23mm)的抑菌圈直径显著大于LN组(25.15)，大豆蛋白组(26.26)的抑菌圈直径也略高于LN组。且16h时MRS组(30.35mm)和大豆肽组(27.33mm)的抑菌圈直径仍然大于LN组(26.27mm)，但当浓缩菌液pH值调为7时，并没有出现抑菌圈，说明抑菌物质主要为罗伊氏乳杆菌LR08产生的短链脂肪酸。
6、罗伊氏乳杆菌LR08和大肠杆菌ESS的氮源利用率
将罗伊氏乳杆菌LR08和大肠杆菌ESS接种到不同的处理组中，在不同的时间段(0、2、4、6、8、10、12、14和16h)收集菌液，并在4℃下以10000rpm离心5min收集上清液，并在-40℃下储存。使用BCA试剂盒测量蛋白质浓度。利用每2小时的浓度差来计算利用率(UTIL)，并且利用率(UTE)基于每个时间点的蛋白质浓度来计算，方程式如下：
UTIL(％)＝(C0-Ct)/C0*100％；
UTE(％)＝UTIL/t；
其中，C0为0h上清蛋白含量；Ct为t h上清蛋白含量。
实验结果如图3所示。
由图3可知，在MRS培养基中，0-4h罗伊氏乳杆菌LR08对氮源的利用率低于大肠杆菌ESS，但在6-16h利用率明显升高并超过大肠杆菌ESS，这也与活菌数的结果一致。而使用大豆肽组培养基后，罗伊氏乳杆菌LR084h的氮源利用率提升了19.58％，而大肠杆菌ESS则下降了3.32％，并且直到16h罗伊氏乳杆菌LR08的氮源利用率仍比大肠杆菌ESS高18.36％，表明大豆肽组显著提高了罗伊氏乳杆菌LR08对氮源的利用能力以及利用速率，从而在罗伊氏乳杆菌LR08与其大肠杆菌ESS竞争过程中，仍能促进其活性，抑制大肠杆菌ESS的增殖。
综上可知，本发明大豆肽可以与罗伊氏乳杆菌LR08协同有效杀死或抑制致病菌，达到调节肠道菌群、维护肠道健康的技术效果。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (9)

1.大豆肽联合乳酸菌在制备抑制肠道病原菌产品中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述大豆肽中相对分子质量低于1000Da的占总质量的85％以上。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述大豆肽与乳酸菌协同抑制肠道病原菌。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述乳酸菌为罗伊氏乳杆菌LR08；所述肠道病原菌为大肠杆菌ESS。
5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述大豆肽能提高乳酸菌的活性和产酸能力。
6.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述大豆肽能提高罗伊氏乳杆菌LR08利用氮源的速率从而提高与大肠杆菌ESS竞争营养的能力。
7.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述产品包括保健品、食品或者药品。
8.一种含有大豆肽的培养基，其特征在于，以MRS为基础培养基，以大豆肽替换MRS培养基中的一半氮源；所述大豆肽为经体外模拟胃肠道消化后的大豆肽。
9.根据权利要求8所述的培养基，其特征在于，所述大豆肽在所述培养基中的浓度为12-14g/L。
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