CN111979161B - 一株可降低血管平滑肌细胞内活性氧水平的长双歧杆菌 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一株可降低血管平滑肌细胞内活性氧水平的长双歧杆菌，属于微生物技术领域以及医药技术领域。本发明提供了一株长双歧杆菌CCFM752，此长双歧杆菌CCFM752能够缓解高血压，具体体现在：(1)显著降低AngiotensinⅡ刺激后A7R5细胞内O2 ·‑水平；(2)显著降低AngiotensinⅡ刺激后A7R5细胞内H2O2水平；(3)显著抑制AngiotensinⅡ刺激后A7R5细胞内NADPH氧化酶活力；(4)显著提升A7R5细胞内CAT酶活力，可见，长双歧杆菌CCFM752在制备预防和/或治疗高血压的产品(如食品或药品等)中具有巨大的应用前景。

Description

一株可降低血管平滑肌细胞内活性氧水平的长双歧杆菌
技术领域
本发明涉及一株可降低血管平滑肌细胞内活性氧水平的长双歧杆菌，属于微生物技术领域以及医药技术领域。
背景技术
高血压是发病人群最为广泛的慢性病之一，为社会医疗体系带来了沉重的负担。目前，全球已有超过30％的人患有高血压，且近年来高血压患病人数仍旧呈逐年递增趋势。在高血压患者中，超过90％属原发性高血压。原发性高血压发病周期长且难以治愈，患者需依赖药物控制血压，易形成药物依赖性。此外，高血压的发生将大大增加动脉粥样硬化、卒中、心衰等其他心血管疾病的发生风险，严重威胁患者的生命健康。
原发性高血压的发生主要依赖于环境因素及生活习惯，其成因复杂，具体机制至今仍旧难以解释。近年来，研究表明活性氧(ROS)是促进高血压等心血管疾病的发生发展的重要因素。机体最核心的血压调控系统为肾素-血管紧张素-醛固酮系统(RAAS)，其中包含血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)与醛固酮两种重要的升血压激素。AngⅡ和醛固酮能够激活血管壁NADPH氧化酶，产生O2 ·-、H2O2等ROS使血压升高。在原发性高血压患者及动物模型体内均存在RAAS失调的现象，使得体内AngⅡ和/或醛固酮水平升高。当AngⅡ、醛固酮等刺激因子持续刺激血管壁将产生过多的ROS，使血管持续收缩，引起高血压，而持续产生的ROS还将激活与细胞增殖相关丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)通路以及胶原质合成相关的Smad通路与TGF-β通路等，造成血管壁增厚与纤维化，引起血管壁结构病变与血管功能异常。此外，血管壁ROS还可能激活与炎症相关的IL-1β、IL-17、TNF-α等免疫通路，造成血管炎症，加速高血压与动脉粥样硬化的形成。因此，清除血管壁内过多的ROS将有助于预防高血压等心血管疾病的发生发展。
目前，临床干预高血压的方法主要为药物干预。不同种类的降压药物均有不同程度的毒副作用，如引起电解质紊乱、损害肾脏功能及引起血管水肿等，长期服用将损害患者健康。辅助干预方法主要为膳食干预。膳食干预虽然有利于改善患者健康状况，但见效慢且效果不显著。
近年来益生菌的健康功效已被大量报道，并且，适量摄入益生菌也不会对宿主产生副作用。研究表明，部分乳杆菌属的益生菌具有降低血压的功效。因此，将益生菌作为膳食补充剂将有助于改善患者健康状况，增强非药物干预的效果。但是，现有的具有抗高血压功能的益生菌作用靶点较为单一，主要通过抑制血管紧张素转换酶(ACE)活性而降低血压，并不适用于干预醛固酮等其他因子引起的高血压。因此，基于ROS在高血压发病通路中的重要性，急需筛选出能够降低血管壁内ROS水平的益生菌，作为具有预防高血压潜力的益生菌菌株。
发明内容
[技术问题]
本发明要解决的技术问题是提供一株可降低血管平滑肌细胞内活性氧水平的长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)。
[技术方案]
为解决上述问题，本发明提供了一株长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)CCFM752，所述长双歧杆菌CCFM752保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCCNo.61157，保藏日期为2020年08月21日，保藏地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼。
所述长双歧杆菌CCFM752来源于婴儿粪便样本，该菌株经测序分析，其16S rDNA序列如SEQ ID NO.1所示，将测序得到的序列在GeneBank中进行核酸序列比对，结果显示菌株为长双歧杆菌，命名为长双歧杆菌CCFM752。
所述长双歧杆菌CCFM752的菌体呈短杆状；菌落呈圆形、凸起、湿润、白色有光泽。
本发明还提供了上述长双歧杆菌在制备预防和/或治疗心血管疾病的产品中的应用。
本发明的一种实施方式中，所述心血管疾病为高血压。
本发明的一种实施方式中，所述产品中，上述长双歧杆菌CCFM752的活菌数为不低于1×106CFU/mL或1×106CFU/g。
本发明的一种实施方式中，所述产品包含食品或药品。
本发明的一种实施方式中，所述药品含有上述长双歧杆菌CCFM752、药物载体和/或药用辅料。
本发明的一种实施方式中，所述药物载体包含微囊、微球、纳米粒和/或脂质体。
本发明的一种实施方式中，所述药用辅料包含赋形剂和/或附加剂。
本发明的一种实施方式中，所述赋形剂包含溶剂、抛射剂、增溶剂、助溶剂、乳化剂、着色剂、吸收剂、稀释剂、絮凝剂、反絮凝剂、助滤剂和/或释放阻滞剂。
本发明的一种实施方式中，所述附加剂包含微晶纤维素、羟丙基甲基纤维素和/或精制卵磷脂。
本发明的一种实施方式中，所述药品的剂型为粉剂、颗粒剂、胶囊剂、片剂、丸剂或口服液。
本发明的一种实施方式中，所述食品为保健食品；或所述食品为使用含有上述长双歧杆菌CCFM752的发酵剂生产得到的乳制品、豆制品或果蔬制品；或所述食品为含有上述长双歧杆菌CCFM752的饮料或零食。
本发明的一种实施方式中，所述发酵剂的制备方法为将上述长双歧杆菌CCFM752按照占培养基总质量2～4％的接种量接种到培养基中，于37℃下培养36h，得到培养液；将培养液离心，得到菌体；将菌体用pH为7.2～7.4的磷酸盐缓冲液清洗2～4次后用冻干保护剂重悬，得到重悬液；将重悬液用真空冷冻法进行冻干，得到发酵剂。
本发明的一种实施方式中，所述冻干保护剂和菌体的质量比为2:1。
在本发明的一种实施方式中，所述培养基包含占培养基总质量87.7％的水、10％的酶水解脱脂乳、0.5％的葡萄糖、1.5％的胰蛋白胨以及0.3％的酵母浸膏。
在本发明的一种实施方式中，所述培养基的pH为6.8。
在本发明的一种实施方式中，所述保护剂包含100g/L脱脂奶粉、150g/L海藻糖以及10g/L L-谷氨酸钠。
本发明还提供了一种用于预防和/或治疗心血管疾病的产品，所述产品含有上述长双歧杆菌CCFM752。
本发明的一种实施方式中，所述心血管疾病为高血压。
本发明的一种实施方式中，所述产品中，上述长双歧杆菌CCFM752的活菌数为不低于1×106CFU/mL或1×106CFU/g。
本发明的一种实施方式中，所述产品包含食品或药品。
本发明的一种实施方式中，所述药品含有上述长双歧杆菌CCFM752、药物载体和/或药用辅料。
本发明的一种实施方式中，所述药物载体包含微囊、微球、纳米粒和/或脂质体。
本发明的一种实施方式中，所述药用辅料包含赋形剂和/或附加剂。
本发明的一种实施方式中，所述赋形剂包含溶剂、抛射剂、增溶剂、助溶剂、乳化剂、着色剂、吸收剂、稀释剂、絮凝剂、反絮凝剂、助滤剂和/或释放阻滞剂。
本发明的一种实施方式中，所述附加剂包含微晶纤维素、羟丙基甲基纤维素和/或精制卵磷脂。
本发明的一种实施方式中，所述药品的剂型为粉剂、颗粒剂、胶囊剂、片剂、丸剂或口服液。
本发明的一种实施方式中，所述食品为保健食品；或所述食品为使用含有上述长双歧杆菌CCFM752的发酵剂生产得到的乳制品、豆制品或果蔬制品；或所述食品为含有上述长双歧杆菌CCFM752的饮料或零食。
本发明的一种实施方式中，所述发酵剂的制备方法为将上述长双歧杆菌CCFM752按照占培养基总质量2～4％的接种量接种到培养基中，于37℃下培养36h，得到培养液；将培养液离心，得到菌体；将菌体用pH为7.2～7.4的磷酸盐缓冲液清洗2～4次后用冻干保护剂重悬，得到重悬液；将重悬液用真空冷冻法进行冻干，得到发酵剂。
本发明的一种实施方式中，所述冻干保护剂和菌体的质量比为2:1。
在本发明的一种实施方式中，所述培养基包含占培养基总质量87.7％的水、10％的酶水解脱脂乳、0.5％的葡萄糖、1.5％的胰蛋白胨以及0.3％的酵母浸膏。
在本发明的一种实施方式中，所述培养基的pH为6.8。
在本发明的一种实施方式中，所述保护剂包含100g/L脱脂奶粉、150g/L海藻糖以及10g/L L-谷氨酸钠。
有益效果：
1、本发明提供了一株长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)CCFM752，此长双歧杆菌CCFM752能够缓解高血压，具体体现在：
(1)显著降低AngiotensinⅡ刺激后A7R5细胞内O2 ·-水平；
(2)显著降低AngiotensinⅡ刺激后A7R5细胞内H2O2水平；
(3)显著抑制AngiotensinⅡ刺激后A7R5细胞内NADPH氧化酶活力；
(4)显著提升A7R5细胞内CAT酶活力，
可见，长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)CCFM752在制备预防和/或治疗高血压的产品(如食品或药品等)中具有巨大的应用前景。
2、长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)是益生菌的一种，目前已被纳入卫生部下发的《可用于食品的菌种名单》，具有调节肠道健康的功效，因此，本发明得到的长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)CCFM752对人体而言，相对健康，无副作用。
生物材料保藏
一株长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)CCFM752，分类学命名为Bifidobacterium longum，已于2020年08月21日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No.61157，保藏地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼。
附图说明
图1：不同组别A7R5细胞内O2 ·-水平对比。
图2：不同组别A7R5细胞内H2O2水平对比。
图3：不同组别A7R5细胞内NADPH氧化酶活力对比。
图4：不同组别A7R5细胞内CAT酶活力对比。
其中，“##”表示与Control组相比具有显著性差异(p<0.01)，“*”表示与Model组相比具有显著性差异(p<0.05)，“**”表示与Model组相比具有显著性差异(p<0.01)。
具体实施方式
下述实例中涉及的胰蛋白酶和HBSS缓冲液购自Thermo Fisher公司，AngiotensinⅡ购自MCE公司，，脱脂乳购自光明乳业股份有限公司，葡萄糖与酵母浸膏购自国药集团化学试剂有限公司，胰蛋白胨购自英国OXOID公司，DHE荧光探针、DCFH-DA荧光探针、BCA蛋白浓度测定试剂盒与蛋白酶抑制剂混合物购自碧云天生物技术研究所，CAT测定试剂盒购自南京建成生物工程研究所。
下述实施例中涉及的培养基如下：
MRS液体培养基：蛋白胨10g/L、牛肉膏10g/L、葡萄糖20g/L、乙酸钠2g/L、酵母粉5g/L、柠檬酸氢二铵2g/L、K2PO4·3H2O 2.6g/L、MgSO4·7H200.1 g/L、MnSO40.05 g/L、吐温-801ml/L，pH 7.0。
MRS固体培养基：蛋白胨10g/L、牛肉膏10g/L、葡萄糖20g/L、乙酸钠2g/L、酵母粉5g/L、柠檬酸氢二铵2g/L、K2PO4·3H2O 2.6g/L、MgSO4·7H200.1 g/L、MnSO40.05 g/L、吐温-801ml/L、琼脂20g/L、L-半胱氨酸盐酸盐0.05g/L，pH 7.0。
DMEM培养基：甘氨酸30mg/L、L-精氨酸盐酸盐84mg/L、L-半胱氨酸盐酸盐63mg/L、L-谷氨酰胺584mg/L、L-组氨酸盐酸盐42mg/L、L-异亮氨酸105mg/L、L-亮氨酸105mg/L、L-赖氨酸盐酸盐146mg/L、L-甲硫氨酸30mg/L、L-苯丙氨酸66mg/L、L-丝氨酸42mg/L、L-苏氨酸95mg/L、L-色氨酸16mg/L、L-酪氨酸二钠104mg/L、L-缬氨酸94mg/L、氯化胆碱4mg/L、D-泛酸钙4mg/L、叶酸4mg/L、烟酰胺4mg/L、盐酸吡哆醇4mg/L、核黄素0.4mg/L、盐酸硫胺素4mg/L、i-肌醇7.2mg/L、CaCl2200 mg/L、Fe(NO3)3·9H2O 0.1mg/L、MgSO4 97.67mg/L、KCl 400mg/L、NaHCO33700 mg/L、NaCl 6400mg/L、NaH2PO4·H2O 125mg/L、D-葡萄糖4500mg/L、酚红15mg/L。
下述实施例中涉及的检测方法如下：
活菌数的检测方法：采用国标《GB 4789.35-2016食品安全国家标准食品微生物学检测乳酸菌检测》。
下述实施例中涉及的乳酸菌培养上清的制备方法如下：
将乳酸菌划线于MRS固体培养基上，37℃条件下培养48h，得到单菌落；挑取单菌落接种于MRS液体培养基中，37℃条件下培养18h进行活化，连续活化两代，得到活化液；将活化液按2％(v/v)的接种量接种于MRS液体培养基中，37℃条件下培养18h，得到菌液；将菌液经8000g离心10min，取上清；将上清用浓度为1mol/L的NaOH溶液调pH值至7.0后经0.22μm滤膜过滤除菌，得到乳酸菌培养上清。
实施例1：长双歧杆菌的获取
具体步骤如下：
1、筛选
以婴儿粪便为样本，将样本经预处理后，在20％甘油中保存于-80℃冰箱，取出解冻后，混匀样本吸取0.5mL样本加到4.5mL，以含有0.05g/L半胱氨酸的9g/L生理盐水进行梯度稀释，选择合适的梯度稀释液涂布在MRS固体培养基上，于37℃培养48h，挑取长双歧杆菌的典型菌落至MRS固体培养基上划线纯化，挑取单菌落转接至MRS液体培养基(含有0.05g/L半胱氨酸)增菌，30％甘油保藏，得到菌株CCFM752和菌株CCFM666；其中，长双歧杆菌的典型菌落呈圆形、凸起、湿润、白色有光泽。
2、鉴定
提取菌株菌株CCFM752和菌株CCFM666的基因组，将菌株CCFM752和菌株CCFM666的16S rDNA进行扩增和测序(由苏州金唯智生物科技有限公司进行，CCFM752、CCFM666的16SrDNA核苷酸测定序列分别如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2所示，菌种鉴定的上游引物27F序列如SEQ ID NO.3所示，下游引物1492R序列如SEQ ID NO.4所示)，将该序列在NCBI中进行核酸序列比对，结果显示菌株CCFM752和菌株CCFM666均为长双歧杆菌，分别命名为长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)CCFM752和长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)CCFM666。
实施例2：长双歧杆菌对A7R5细胞内O2 ·-水平的影响
具体步骤如下：
大鼠胸主动脉平滑肌细胞A7R5购自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库，以含有10％(v/v)胎牛血清(FBS)、100U/mL青霉素、100mg/mL链霉素的DMEM培养基进行培养。细胞培养于37℃、气相含5％(v/v)CO2的细胞培养箱中。细胞生长至70％～80％密度时进行传代。
选取生长状态良好的A7R5细胞，将A7R5细胞经胰蛋白酶消化后离心、用DMEM培养基重悬，进行细胞计数，得到重悬液；将重悬液按照20000细胞/孔接种至24孔板中后，在24孔板中继续添加500μL含有10％(v/v)胎牛血清(FBS)、100U/mL青霉素、100mg/mL链霉素的DMEM培养基，于37℃、气相含5％(v/v)CO2的细胞培养箱中培养48h；培养48h后，将24孔板中的含有10％(v/v)胎牛血清(FBS)、100U/mL青霉素、100mg/mL链霉素的DMEM培养基替换为500μL含有0.1％(v/v)胎牛血清(FBS)的DMEM培养基，并将24孔板于37℃、气相含5％(v/v)CO2的细胞培养箱中静置24h；静置24h后，以24孔板中每个孔内细胞为单位，将细胞分为空白对照组(Control)、模型组(Model)、长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)CCFM752干预组(CCFM752)以及长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)CCFM666干预组(CCFM666)，每组3个孔，其中，在空白对照组与模型组的每个孔中分别加入15μL MRS液体培养基，在CCFM752干预组的每个孔中加入15μL长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)CCFM752培养上清，在CCFM666干预组的每个孔中加入15μL长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)CCFM666培养上清，将24孔板于37℃、气相含5％(v/v)CO2的细胞培养箱中干预12h；干预12h后，在模型组、CCFM752干预组以及CCFM752干预组的每个孔内分别添加AngiotensinⅡ至浓度为1×10-7M，同时，在空白对照组的每个孔内添加同样体积的DMEM培养基作为对照，将24孔板于37℃、气相含5％(v/v)CO2的细胞培养箱中静置4h；静置4h后，将24孔板从细胞培养箱中取出，吸去每孔内液体并在每孔中加入500μL含10μM DHE荧光探针的DMEM培养基，将24孔板于37℃、气相含5％(v/v)CO2的细胞培养箱中孵育30min；孵育30min后，将24孔板从细胞培养箱中取出，吸去每孔内液体并用HBSS缓冲液清洗每孔内细胞2遍；清洗结束后，在24孔板的每孔加入500μL HBSS缓冲液，通过倒置荧光显微镜进行观察，采用绿色波段激发光激发细胞产生红色荧光，选择合适的视野进行拍摄；采用Image pro plus计算图片荧光密度以表征胞内O2 ·-水平，以空白对照组为对比处理数据，结果如图1所示。
由图1可知，用1×10-7MAngiotensinⅡ刺激4h后，模型组A7R5细胞内O2 ·-水平显著升高至空白对照组的1.6倍(p<0.01)，CCFM752干预组A7R5细胞内O2 ·-水平较模型组降低27％(p<0.01)，而CCFM666干预组A7R5细胞内O2 ·-水平较模型组未发生明显变化。
可见，长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)CCFM752培养上清干预能够显著降低AngiotensinⅡ刺激后A7R5细胞内O2 ·-水平的上升。
实施例3：长双歧杆菌对A7R5细胞内H2O2水平的影响
具体步骤如下：
大鼠胸主动脉平滑肌细胞A7R5购自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库，以含有10％(v/v)胎牛血清(FBS)、100U/mL青霉素、100mg/mL链霉素的DMEM培养基进行培养。细胞培养于37℃、气相含5％(v/v)CO2的细胞培养箱中。细胞生长至70％～80％密度时进行传代。
选取生长状态良好的A7R5细胞，将A7R5细胞经胰蛋白酶消化后离心、用DMEM培养基重悬，进行细胞计数，得到重悬液；将重悬液按照20000细胞/孔接种至24孔板中后，在24孔板中继续添加500μL含有10％(v/v)胎牛血清(FBS)、100U/mL青霉素、100mg/mL链霉素的DMEM培养基，于37℃、气相含5％(v/v)CO2的细胞培养箱中培养48h；培养48h后，将24孔板中的含有10％(v/v)胎牛血清(FBS)、100U/mL青霉素、100mg/mL链霉素的DMEM培养基替换为500μL含有0.1％(v/v)胎牛血清(FBS)的DMEM培养基，并将24孔板于37℃、气相含5％(v/v)CO2的细胞培养箱中静置24h；静置24h后，以24孔板中每个孔内细胞为单位，将细胞分为空白对照组(Control)、模型组(Model)、长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)CCFM752干预组(CCFM752)以及长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)CCFM666干预组(CCFM666)，每组3个孔，其中，在空白对照组与模型组的每个孔中分别加入15μL MRS液体培养基，在CCFM752干预组的每个孔中加入15μL长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)CCFM752培养上清，在CCFM666干预组的每个孔中加入15μL长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)CCFM666培养上清，将24孔板于37℃、气相含5％(v/v)CO2的细胞培养箱中干预12h；干预12h后，在模型组、CCFM752干预组以及CCFM752干预组的每个孔内分别添加AngiotensinⅡ至浓度为1×10-7M，同时，在空白对照组的每个孔内添加同样体积的DMEM培养基作为对照，将24孔板于37℃、气相含5％(v/v)CO2的细胞培养箱中静置3h；静置3h后，将24孔板从细胞培养箱中取出，吸去每孔内液体并在每孔中加入500μL含8μM DCFH-DA荧光探针的DMEM培养基，将24孔板于37℃、气相含5％(v/v)CO2的细胞培养箱中孵育20min；孵育20min后，将24孔板从细胞培养箱中取出，吸去每孔内液体并用HBSS缓冲液清洗每孔内细胞2遍；清洗结束后，在24孔板的每孔加入500μLHBSS缓冲液，通过倒置荧光显微镜进行观察，采用蓝色波段激发光激发细胞产生绿色荧光，选择合适的视野进行拍摄；采用Image pro plus计算图片荧光密度以表征胞内H2O2水平，以空白对照组为对比处理数据，结果如图2所示。
由图2可知，用1×10-7MAngiotensinⅡ刺激3h后，模型组A7R5细胞内H2O2水平显著升高至空白对照组的1.8倍(p<0.001)，CCFM752干预组A7R5细胞内H2O2水平较模型组降低30％(p<0.01)，而CCFM666干预组A7R5细胞内H2O2水平较模型组未发生明显变化。
可见，长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)CCFM752培养上清干预能够显著降低AngiotensinⅡ刺激后A7R5细胞内H2O2水平的上升。
实施例4：长双歧杆菌对A7R5细胞内NADPH氧化酶活力的影响
具体步骤如下：
大鼠胸主动脉平滑肌细胞A7R5购自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库，以含有10％(v/v)胎牛血清(FBS)、100U/mL青霉素、100mg/mL链霉素的DMEM培养基进行培养。细胞培养于37℃、气相含5％(v/v)CO2的细胞培养箱中。细胞生长至70％～80％密度时进行传代。
选取生长状态良好的A7R5细胞，将A7R5细胞经胰蛋白酶消化后离心、用DMEM培养基重悬，进行细胞计数，得到重悬液；将重悬液按照2×105细胞/孔接种至6cm细胞培养皿中后，在细胞培养皿中继续添加4mL含有10％(v/v)胎牛血清(FBS)、100U/mL青霉素、100mg/mL链霉素的DMEM培养基，于37℃、气相含5％(v/v)CO2的细胞培养箱中培养48h；培养48h后，将细胞培养皿中的含有10％(v/v)胎牛血清(FBS)、100U/mL青霉素、100mg/mL链霉素的DMEM培养基替换为4mL含有0.1％(v/v)胎牛血清(FBS)的DMEM培养基，并将细胞培养皿于37℃、气相含5％(v/v)CO2的细胞培养箱中静置24h；静置24h后，以每皿细胞为单位，将细胞分为空白对照组(Control)、模型组(Model)、长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)CCFM752干预组(CCFM752)以及长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)CCFM666干预组(CCFM666)，每组3个皿，其中，在空白对照组与模型组的每个皿中分别加入120μL MRS液体培养基，在CCFM752干预组的每个孔中加入120μL长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)CCFM752培养上清，在CCFM666干预组的每个孔中加入120μL长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)CCFM666培养上清，将细胞培养皿于37℃、气相含5％(v/v)CO2的细胞培养箱中干预12h；干预12h后，在模型组、CCFM752干预组以及CCFM752干预组的每个皿内分别添加AngiotensinⅡ至浓度为1×10-7M，同时，在空白对照组的每个皿内添加同样体积的DMEM培养基作为对照，将细胞培养皿于37℃、气相含5％(v/v)CO2的细胞培养箱中静置4h；静置4h后，将细胞培养皿从细胞培养箱中取出，吸去每皿内液体并置于冰上，用冰浴预冷的PBS缓冲液清洗5遍；清洗5遍后，将每皿细胞转移至不同的15mL离心管中，以冰浴预冷的PBS缓冲液清洗2遍；清洗2遍后，在离心管中添加含有2.0％(v/v)蛋白酶抑制剂混合物的PBS缓冲液(1mL/管细胞)重悬细胞，得到细胞悬液；将细胞悬液转移至新的无菌1.5mL离心管中，置于冰浴上超声破碎(超声功率：300W，单次破碎时长：3～5秒，间隔30秒，重复3～5次)，得到细胞破碎液；将细胞破碎液于显微镜下观察，无完整细胞即可确认破碎完全，完成细胞匀浆的制备；采用碧云天BCA蛋白浓度测定试剂盒进行细胞匀浆蛋白浓度测定，细胞匀浆中NADPH氧化酶活力测定采用化学发光法进行：在96孔板中加入180μL 50mM磷酸盐缓冲液(pH 7.0)，在缓冲液中添加1mmol/LEGTA、150mmol/L蔗糖、500μmol/L光泽精以及100μmol/LNADPH，每个细胞匀浆样品分别设置5个检测平行，于96孔板的每个孔中分别加入20μL细胞匀浆，加入细胞匀浆后立即采用酶标仪进行化学发光测定，检测反应开始后30～120s间的化学发光强度，将每孔测定的发光强度与该匀浆蛋白浓度的比值用以表征该细胞匀浆的相对NADPH氧化酶活力，以Control组为对比处理数据，结果如图3所示。
由图3可知，用1×10-7MAngiotensinⅡ刺激4h后，模型组A7R5细胞内NADPH氧化酶活性显著升高，提升为空白对照组的2.4倍(p<0.001)，CCFM752干预组A7R5细胞内NADPH氧化酶活力较模型组降低18％(p<0.05)，而CCFM666干预组A7R5细胞内NADPH氧化酶活力较模型组未发生明显变化。
可见，长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)CCFM752培养上清干预能够显著抑制AngiotensinⅡ刺激后A7R5细胞内NADPH氧化酶的活性，减少ROS的产生。
实施例5：长双歧杆菌对A7R5细胞内CAT酶活力的影响
具体步骤如下：
大鼠胸主动脉平滑肌细胞A7R5购自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库，以含有10％(v/v)胎牛血清(FBS)、100U/mL青霉素、100mg/mL链霉素的DMEM培养基进行培养。细胞培养于37℃、气相含5％(v/v)CO2的细胞培养箱中。细胞生长至70％～80％密度时进行传代。
选取生长状态良好的A7R5细胞，将A7R5细胞经胰蛋白酶消化后离心、用DMEM培养基重悬，进行细胞计数，得到重悬液；将重悬液按照2×105细胞/孔接种至6cm细胞培养皿中后，在细胞培养皿中继续添加4mL含有10％(v/v)胎牛血清(FBS)、100U/mL青霉素、100mg/mL链霉素的DMEM培养基，于37℃、气相含5％(v/v)CO2的细胞培养箱中培养48h；培养48h后，将细胞培养皿中的含有10％(v/v)胎牛血清(FBS)、100U/mL青霉素、100mg/mL链霉素的DMEM培养基替换为4mL含有0.1％(v/v)胎牛血清(FBS)的DMEM培养基，并将细胞培养皿于37℃、气相含5％(v/v)CO2的细胞培养箱中静置24h；静置24h后，以每皿细胞为单位，将细胞分为空白对照组(Control)、模型组(Model)、长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)CCFM752干预组(CCFM752)以及长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)CCFM666干预组(CCFM666)，每组3个皿，其中，在空白对照组与模型组的每个皿中分别加入120μL MRS液体培养基，在CCFM752干预组的每个孔中加入120μL长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)CCFM752培养上清，在CCFM666干预组的每个孔中加入120μL长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)CCFM666培养上清，将细胞培养皿于37℃、气相含5％(v/v)CO2的细胞培养箱中干预12h；干预12h后，将细胞培养皿从细胞培养箱中取出，吸去每皿内液体并置于冰上，用冰浴预冷的PBS缓冲液清洗5遍；清洗5遍后，将每皿细胞转移至不同的15mL离心管中，以冰浴预冷的PBS缓冲液清洗2遍；清洗2遍后，在离心管中添加含有2.0％(v/v)蛋白酶抑制剂混合物的PBS缓冲液(1mL/管细胞)重悬细胞，得到细胞悬液；将细胞悬液转移至新的无菌1.5mL离心管中，置于冰浴上超声破碎(超声功率：300W，单次破碎时长：3～5秒，间隔30秒，重复3～5次)，得到细胞破碎液；将细胞破碎液于显微镜下观察，无完整细胞即可确认破碎完全，完成细胞匀浆的制备；采用碧云天BCA蛋白浓度测定试剂盒进行细胞匀浆蛋白浓度测定，细胞匀浆CAT酶活力采用南京建成过氧化氢酶测定试剂盒进行测定，胞内CAT酶活力以测定匀浆CAT活力除以匀浆蛋白浓度表示，以对照组为对比处理数据，结果如图4所示。
由图4可知，长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)CCFM752培养上清干预能够提高A7R5细胞内CAT酶活力至空白对照组的1.9倍左右(p<0.01)，而长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)CCFM666培养上清干预未能显著改变A7R5细胞内CAT酶活力。
可见，长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)CCFM752培养上清干预能够通过提升A7R5细胞内CAT酶活力，帮助清除胞内ROS。
实施例6：长双歧杆菌的应用
长双歧杆菌CCFM752可用于制备固体饮料，固体饮料的具体制备过程如下：
将长双歧杆菌CCFM752按照占培养基总质量2～4％的接种量接种到培养基中，于37℃下培养36h，得到培养液；将培养液离心，得到菌体；将菌体用pH为7.2～7.4的磷酸盐缓冲液清洗2～4次后用冻干保护剂重悬，得到重悬液；将重悬液用真空冷冻法进行冻干，得到菌粉；冻干保护剂和菌体的质量比为2:1；培养基包含占培养基总质量87.7％的水、10％的酶水解脱脂乳、0.5％的葡萄糖、1.5％的胰蛋白胨以及0.3％的酵母浸膏，pH为6.8；保护剂包含100g/L脱脂奶粉、150g/L海藻糖以及10g/L L-谷氨酸钠。
将含有1010CFU长双歧杆菌CCFM752的菌粉与1g麦芽糊精混合，得到含长双歧杆菌CCFM752的固体饮料。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
序列表
<110> 江南大学
<120> 一株可降低血管平滑肌细胞内活性氧水平的长双歧杆菌
<160> 4
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 1048
<212> DNA
<213> 长双歧杆菌
<400> 1
gcttaaacat gcagtcgaac gggatccatc gggctttgct tggtggtgag agtggcgaac 60
gggtgagtaa tgcgtgaccg acctgcccca tacaccggaa tagctcctgg aaacgggtgg 120
taatgccgga tgctccagtt gatcgcatgg tcttctggga aagctttcgc ggtatgggat 180
ggggtcgcgt cctatcagct tgacggcggg gtaacggccc accgtggctt cgacgggtag 240
ccggcctgag agggcgaccg gccacattgg gactgagata cggcccagac tcctacggga 300
ggcagcagtg gggaatattg cacaatgggc gcaagcctga tgcagcgacg ccgcgtgagg 360
gatggaggcc ttcgggttgt aaacctcttt tatcggggag caagcgagag tgagtttacc 420
cgttgaataa gcaccggcta actacgtgcc agcagccgcg gtaatacgta gggtgcaagc 480
gttatccgga attattgggc gtaaagggct cgtaggcggt tcgtcgcgtc cggtgtgaaa 540
gtccatcgct taacggtgga tccgcgccgg gtacgggcgg gcttgagtgc ggtaggggag 600
actggaattc ccggtgtaac ggtggaatgt gtagatatcg ggaagaacac caatggcgaa 660
ggcaggtctc tgggccgtta ctgacgctga ggagcgaaag cgtggggagc gaacaggatt 720
agataccctg gtagtccacg ccgtaaacgg tggatgctgg atgtggggcc cgttccacgg 780
gttccgtgtc ggagctaacg cgttaagcat cccgcctggg gagtacgggc cgcaaggcta 840
aaactcaaga aattgacggg ggcccgcaca agcggcggag catgcggatt atttcgatgc 900
aacgcgaaga accttacctg ggcttgacat gttcccgacg atcgtagaga tacggcttcc 960
cttcgggcgg gttcacaggt ggtgcatggt cgtcgtcagc tcgtgtcgtg agatgttggg 1020
ttaagtcccg caacgaggcg caacctcg 1048
<210> 2
<211> 960
<212> DNA
<213> 长双歧杆菌
<400> 2
taccatgcag tcgaacggga tccatcgggc tttgcttggt ggtgagagtg gcgaacgggt 60
gagtaatgcg tgaccgacct gccccataca ccggaatagc tcctggaaac gggtggtaat 120
gccggatgtt ccagttgatc gcatggtctt ctgggaaagc tttcgcggta tgggatgggg 180
tcgcgtccta tcagcttgac ggcggggtaa cggcccaccg tggcttcgac gggtagccgg 240
cctgagaggg cgaccggcca cattgggact gagatacggc ccagactcct acgggaggca 300
gcagtgggga atattgcaca atgggcgcaa gcctgatgca gcgacgccgc gtgagggatg 360
gaggccttcg ggttgtaaac ctcttttatc ggggagcaag cgtgagtgag tttacccgtt 420
gaataagcac cggctaacta cgtgccagca gccgcggtaa tacgtagggt gcaagcgtta 480
tccggaatta ttgggcgtaa agggctcgta ggcggttcgt cgcgtccggt gtgaaagtcc 540
atcgcttaac ggtggatccg cgccgggtac gggcgggctt gagtgcggta ggggagactg 600
gaattcccgg tgtaacggtg gaatgtgtag atatcgggaa gaacaccaat ggcgaaggca 660
ggtctctggg ccgttactga cgctgaggag cgaaagcgtg gggagcgaac aggattagat 720
accctggtag tccacgccgt aaacggtgga tgctggatgt ggggcccgtt ccacgggttc 780
cgtgtcggag ctaacgcgtt aagcatcccg cctggggagt acggccgcaa ggctaaaact 840
caaagaaatt gacgggggcc cgcacaagcg gcggagcatg cggattaatt cgatgcaacg 900
cgaagaacct tacctgggct tgacatgttc ccgacgatcc cagagatggg gtttcccttc 960
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
agagtttgat cctggctcag 20
<210> 4
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
ggttaccttg ttacgactt 19

Claims (10)

1.一株长双歧杆菌（Bifidobacterium longum），其特征在于，所述长双歧杆菌保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No.61157，保藏日期为2020年08月21日。
2.权利要求1所述长双歧杆菌在制备预防和/或治疗心血管疾病的药品中的应用。
3.一种产品，其特征在于，所述产品含有权利要求1所述长双歧杆菌。
4.如权利要求3所述的一种产品，其特征在于，所述产品中，权利要求1所述长双歧杆菌的活菌数为不低于1×106 CFU/mL或1×106 CFU/g。
5.如权利要求3或4所述的一种产品，其特征在于，所述产品是食品或药品。
6.如权利要求5所述的一种产品，其特征在于，所述药品含有权利要求1所述长双歧杆菌、药物载体和/或药用辅料。
7.如权利要求6所述的一种产品，其特征在于，所述药物载体是微囊、微球、纳米粒和/或脂质体。
8.如权利要求6或7所述的一种产品，其特征在于，所述药用辅料是赋形剂和/或附加剂。
9.如权利要求8所述的一种产品，其特征在于，所述赋形剂是溶剂、抛射剂、增溶剂、助溶剂、乳化剂、着色剂、吸收剂、稀释剂、絮凝剂、反絮凝剂、助滤剂和/或释放阻滞剂；所述附加剂包含微晶纤维素、羟丙基甲基纤维素和/或精制卵磷脂。
10.如权利要求5所述的一种产品，其特征在于，所述食品为保健食品；或所述食品为使用含有权利要求1所述长双歧杆菌的发酵剂生产得到的乳制品、豆制品或果蔬制品；或所述食品为含有权利要求1所述长双歧杆菌的零食。
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