CN103865856A - 一株耐酸长双歧杆菌JDY1017dpH及其应用 - Google Patents
一株耐酸长双歧杆菌JDY1017dpH及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供了一株耐酸长双歧杆菌JDY1017dpH及其应用。长双歧杆菌JDY1017dpH的16S rRNA基因部分核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，保藏号为CGMCC No.8371。本发明的长双歧杆菌JDY1017dpH的获得，是从健康青年人粪便中分离并在pH3.5酸性条件下进一步筛选得到的菌种。发酵培养过程是，于BL液体培养基(含0.05％半胱氨酸盐酸盐)中37℃厌氧培养24h。本发明的长双歧杆菌JDY1017dpH对酸的耐受性能显著优于普通菌株，且耐酸性能具有遗传稳定性，具有与普通菌株不同的细胞膜脂肪酸含量百分比，平均碳链长度显著长于普通菌株，细胞膜流动性显著低于普通菌株。可用于日常发酵食品、保健食品和药品的生产领域中。
Description
技术领域
本发明涉及微生物，具体涉及一株耐酸长双歧杆菌及其应用。
背景技术
人体胃肠道定植着各种对人体有益生作用的益生细菌。其中双歧杆菌和乳杆菌是定植于人体胃肠道的最具代表性的益生菌。益生菌是指服用一定数量后对人体健康有益的活的微生物。当益生菌占人体胃肠道优势数量时常常有利于人体健康。
双歧杆菌属于革兰氏阳性菌，是一种专性厌氧菌，无运动属性，生长周期中不产生芽孢，无荚膜和鞭毛。
双歧杆菌对环境pH的变化非常敏感。其最适生长pH为6.7～7.0，一旦高于8.0或低于5.0，双歧杆菌将停止生长。当处于低pH条件下，会导致细菌细胞大量的死亡，特别是人源性双歧杆菌酸耐受力非常差。
双歧杆菌对环境温度的变化也很敏感。当温度介于37～41℃时，生长最为迅速，当温度高于43℃或低于28℃时，其生长极其缓慢或停止生长。在生产应用中，双歧杆菌的最适温度为35～40℃。
许多研究表明，双歧杆菌是重要的益生菌，对人体具有多种潜在的生理功能，如调节肠道茵群平衡、预防由抗生素引起的腹泻、降低胆固醇、缓解乳糖不耐症及增强机体免疫力等。
目前，随着双歧杆菌功能研究的深入，其在日常发酵食品、保健食品和药品等新产品开发中的应用越来越多。而双歧杆菌作为重要的益生菌，许多国家法规要求益生菌食品中的活菌数在保质期内必须达到106～108CFU／ml(g)。为了使其在人体胃肠道有效发挥益生功能，双歧杆菌必须具有良好的贮存稳定性和对胃肠道的耐受(如耐酸性等)性能。因此，对不利环境(如胃肠道环境)适应性更强的人源性双歧杆菌株是可应用的重要潜在菌株。
发明内容
本发明的目的，就是为了提供一株长双歧杆菌JDY1017dpH及其应用，长双歧杆菌JDY1017dpH具有优势的耐酸性能，且耐酸性具有遗传稳定性，以及具有不同的细胞膜脂肪酸含量百分比和低的细胞膜流动性，可作为潜在的益生菌菌株。
本发明的长双歧杆菌JDY1017dpH已于2013年10月18日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，地址：中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所；保藏登记号为CGMCC No.8371。其分类命名为：长双歧杆菌，拉丁名：Bifidobacterium longum。
为了实现上述目的，本发明的技术方案是：一株耐酸长双歧杆菌(Bifidobacteriumlongum)JDY1017dpH，其保藏登记号为CGMCC No.8371，其16S rRNA基因部分核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
所述长双歧杆菌JDY1017dpH具有以下特性：
(1)优势的耐酸性能
经pH3.5处理4h后，每毫升菌液活菌数的对数值log CFU／ml＝为7.53±0.41，其耐酸性能明显优于普通菌株；
(2)耐酸性能具有遗传稳定性
新筛选到的菌株JDY1017dpH经pH3.5处理4h后，其每毫升菌液活菌数的对数值log CFU／ml＝7.12±0.10，连续传代20次并经pH3.5处理4h后，其每毫升菌液活菌数的对数值log CFU／ml＝7.57±0.15；
(3)不同的细胞膜脂肪酸含量百分比
新筛选到的菌株JDY1017dpH的C16∶0和C16∶1脂肪酸含量百分比分别为24.786±1.162和5.460±0.908，显著低于普通菌株；而C18∶0、C18∶1和cycC19∶0脂肪酸含量百分比分别为4.281±0.521、44.066±1.844和11.342±0.996，显著高于普通菌株；平均碳链长度为17.085±0.049，显著长于普通菌株；
(4)具有更低的细胞膜流动性
新筛选到的菌株JDY1017dpH细胞膜的微粘度r＝0.135±0.006，明显高于普通菌株，即细胞膜流动性明显低于普通菌株。
上述长双歧杆菌JDY1017dpH的获取方法包括以下步骤：
A、将新鲜的健康青年人粪便5克用50ml粪便稀释液振荡成粪便匀浆液，将1ml粪便匀浆液接入9ml新鲜的pH7.4BL液体培养基中，37℃厌氧培养24h，用接种环挑取菌液在pH6.5的TPY固体培养基平板上划线，37℃厌氧培养24h后，挑取单菌落接种于50ml新鲜的pH7.4BL液体培养基中，37℃厌氧过夜培养至平台期后，7600g离心10min获得菌体，再将菌体转移至pH3.5新鲜的BL液体培养基中，37℃厌氧过夜培养后，7600g离心10min获得菌体；
B、再用pH7.4的磷酸缓冲液洗涤两次后，重悬于500μl pH7.4的磷酸缓冲液中，然后涂布于pH6.5的TPY固体培养基中，37℃厌氧培养3～4天至生长出单菌落，挑取单菌落进行镜检，确认达到菌株纯种分离，并分子鉴定该菌株为长双歧杆菌，命名为长双歧杆菌JDY1017dpH；
C、将长双歧杆菌JDY1017dpH以1％接种量接种于新鲜的pH7.4BL液体培养基中，37℃厌氧培养24h，即得长双歧杆菌JDY1017dpH菌株的发酵液。
上述长双歧杆菌JDY1017dpH的获取方法，其中，所述BL液体培养基、TPY固体培养基和磷酸缓冲液中均含有重量百分含量为0.05％的半胱氨酸盐酸盐。
上述长双歧杆菌JDY1017dpH用于日常发酵食品、保健食品和药品的生产领域中。
本发明的长双歧杆菌JDY1017dpH的酸耐受性能显著优于普通菌株，且耐酸性能具有遗传稳定性，具有不同的细胞膜脂肪酸含量百分比和更低的细胞膜流动性。
附图说明
图1为长双歧杆菌JDY1017dpH优势的耐酸性能的遗传稳定性分析图表。
具体实施方式
本发明的长双歧杆菌JDY1017dpH的获得：从健康青年人新鲜粪便中分离并在pH3.5酸性条件下进一步筛选得到的菌种。革兰氏染色呈阳性，专性厌氧，无运动属性，生长周期中不产生芽孢，无荚膜和鞭毛。
该长双歧杆菌已于2013年10月18日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC(地址：中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所)保藏，保藏登记号为CGMCC No.8371。其分类命名为：长双歧杆菌，拉丁名：Bifidobacterium longum。
下面结合实施例和附图1进一步说明本发明：
实施例1：菌株的筛选及获得
将新鲜的健康青年人粪便5克用50ml粪便稀释液振荡成匀浆，将1ml粪便匀浆液接入9ml新鲜的pH7.4BL液体培养基(含0.05％的半胱氨酸盐酸盐)试管中，37℃厌氧培养24h，用接种环挑取菌液在pH6.5的TPY(含0.05％的半胱氨酸盐酸盐)固体培养基平板上划线，37℃厌氧培养24h后，挑取单菌落接种于50ml新鲜的pH7.4BL液体培养基(含0.05％半胱氨酸盐酸盐)中，37℃厌氧过夜培养至平台期后，7600g离心10min获得菌体，再将菌体转移至pH3.5新鲜的BL液体培养基(含0.05％半胱氨酸盐酸盐)中，37℃厌氧过夜培养后，7600g离心10min获得菌体，再用含0.05％半胱氨酸盐酸盐的磷酸缓冲液(pH7.4)洗涤两次后，重悬于500μl含0.05％半胱氨酸盐酸盐的磷酸缓冲液(pH7.4)中，然后涂布于pH6.5的TPY(含0.05％半胱氨酸盐酸盐)固体培养基中，37℃厌氧培养3～4天至生长出单菌落，挑取单菌落进行镜检，确认达到菌株纯种分离，并分子鉴定该菌株为长双歧杆菌，命名为长双歧杆菌JDY1017dpH。
实施例2：菌株的镜检
无菌条件下接种环挑取长双歧杆菌JDY1017dpH，涂于载玻片上，制片并革兰氏染色，在显微镜下观察菌体形态。
实施例3：菌株发酵
将长双歧杆菌JDY1017dpH以1％接种量接种于新鲜的pH7.4BL液体培养基(含0.05％半胱氨酸盐酸盐)中，37℃厌氧培养24h，即得长双歧杆菌JDY1017dpH菌株的发酵液。
实施例4：长双歧杆菌JDY1017dpH优势的耐酸性能
将待进行耐酸性评价的菌株以1％的接种量接种于新鲜的pH7.4BL液体培养基(含0.05％半胱氨酸盐酸盐)中，并传代2次，第3代发酵液在37℃厌氧培养18h至平台期，取1ml菌液转移至1.5ml离心管中，7600g离心10min获得菌体，将菌体转移至10ml pH值3.5新鲜的BL液体培养基(含0.05％半胱氨酸盐酸盐)中，分别于0h和3h，37℃厌氧培养后，取100μl菌液用含0.05％半胱氨酸盐酸盐的磷酸缓冲液(pH7.4)梯度稀释后取100μl的稀释菌液涂布于TPY(含0.05％半胱氨酸盐酸盐)固体培养基中，37℃厌氧培养3～4天后菌落计数，并统计在pH3.5BL液体培养基(含0.05％半胱氨酸盐酸盐)中培养0h和3h后的菌体浓度。本实施例采用实验室保存的分离自商业化产品的长双歧杆菌BLS作为对照菌株。长双歧杆菌的JDY1017dpH优势的耐酸性能如表1所示。
表1长双歧杆菌JDY1017dpH优势的耐酸性能(pH＝3.5处理4h)
由表1可见，本发明的长双歧杆菌JDY1017dpH与商业化产品长双歧杆菌BLS相比，其耐酸性能有明显优势。
实施例5：长双歧杆菌JDY1017dpH优势的耐酸性能具有遗传稳定性
对长双歧杆菌JDY1017dpH菌株连续传代20代，并从第3代后连续传代至第20代中每一代的耐酸性能进行评价。将待评价的菌株以1％接种量接种于10ml新鲜的pH7.4BL液体培养基(含0.05％半胱氨酸盐酸盐)中，37℃厌氧培养，并传代2次，第3代发酵液在37℃厌氧培养18h至平台期后，取1ml菌液转移至1.5ml离心管中，7600g离心10min获得菌体，将菌体转移至10ml pH3.5新鲜的BL液体培养基(含0.05％半胱氨酸盐酸盐)中，分别于0h和3h，37℃厌氧培养后，取100μl的菌液用含0.05％半胱氨酸盐酸盐的磷酸缓冲液(pH7.4)梯度稀释后取100μl的稀释菌液涂布于TPY(含0.05％半胱氨酸盐酸盐)固体培养基中，37℃厌氧培养3～4天后菌落计数，并计算在pH3.5BL液体培养基(含0.05％半胱氨酸盐酸盐)中培养0h和3h后的菌体浓度。
由图1可见，本发明的长双歧杆菌JDY1017dpH菌株的优势耐酸性能具有遗传稳定性。
实施例6：长双歧杆菌JDY1017dpH细胞膜脂肪酸组成分析
将待进行脂肪酸分析的菌株1％接种量接种于新鲜的pH7.4BL液体培养基(含0.05％半胱氨酸盐酸盐)中，并传代2次，第3代发酵液在37℃厌氧培养18h至平台期后，取200ml菌液于7600g，4℃离心20min，再用无菌蒸馏水洗涤2次，将菌体冷冻至-20℃后进行冷冻干燥获得菌粉。再将菌粉磨碎倒入试管中，往试管中加入2ml体积比1∶1的苯／石油醚后混匀，再加入2ml质量体积比为2.25％的氢氧化钾／甲醇混匀后，将试管置于40℃水浴锅中30min后，再加入5ml蒸馏水后静置10min待分层明显后，取上层有机相于棕色样品瓶中，脂肪酸分析时进样量为1μl。脂肪酸分析于HP6890气相色谱仪中进行，毛细管柱为安捷伦公司生产的J&WHP-88(30×0.25mm×0.25μm)。炉温程序为：起始温度为80℃，维持5min，再以2℃／min升至100℃后维持2min，然后以1℃／min升至160℃后维持5min。载气为氮气，进样臼温度和检测器温度分别为250℃和280℃。脂肪酸成分通过与标准品出峰的保留时间的比较来确定。脂肪酸平均碳链长度计算：平均碳链长度＝∑FAP×C／100％。其中FAP为脂肪酸的百分比含量，C是碳原子数目。本实施例采用实验室保存的分离自商业化产品的长双歧杆菌BLS作为对照菌株。长双歧杆菌的JDY1017dpH细胞膜脂肪酸百分比含量如表2所示。
表2长双歧杆菌JDY1017dpH细胞膜脂肪酸百分比含量
*表示p＜0.05，说明2株菌株的C16∶0、C16∶1、C18∶0、C18∶1、cycC19∶0脂肪酸含量百分比和平均碳链长度存在显著差异。
由表2可见，长双歧杆菌JDY1017dpH菌株其C16∶0和C16∶1脂肪酸含量百分比分别为24.786±1.162和5.460±0.908，显著低于对照菌株；而C18∶0、C18∶1和cycC19∶0脂肪酸含量百分比分别为4.281±0.521、44.066±1.844和11.342±0.996，显著高于对照菌株；平均碳链长度为17.085±0.049，显著长于对照菌株。
实施例7：长双歧杆菌JDY1017dpH具有更低的细胞膜流动性
将待进行脂肪酸分析的菌株1％接种量接种于新鲜的pH7.4BL液体培养基(含0.05％半胱氨酸盐酸盐)中，并传代2次，第3代发酵液在37℃厌氧培养18h至平台期后，取菌液并调节浓度至OD450＝0.25，用0.25％甲醛37℃固定1h后，菌体用含0.25％甲醛的磷酸缓冲液(pH7.4)洗涤两次，细菌细胞用5×10-6M1.6-二苯基-1，3，5-己三烯(DPH)于37℃温浴标记1h，用荧光分光光度计测定荧光强度，加偏振装置。激发波长360nm，发射波长430nm，狭缝均为6nm。微粘度r值的计算：r＝(Ivv-G Ivh)／(Ivv+2G Ivh)，其中Ivv和Ivh分别表示：激发光为垂直方向的偏振光，而发射光分别为垂直和水平方向的偏振光时测得的荧光强度；G为光栅矫正因子(G＝Ihv／Ihh)，Ihv和Ihh分别表示激发光为水平方向的偏振光，而发射光分别为垂直和水平方向的偏振光时测得的荧光强度。微粘度r值越大说明细胞膜流动性越低。本实施例采用实验室保存的分离自商业化产品的长双歧杆菌BLS作为对照菌株。长双歧杆菌JDY1017dpH具有更低的细胞膜流动性如表3所示。
表3长双歧杆菌JDY1017dpH具有更低的细胞膜流动性
*p＜0.05说明2株菌株的耐酸性差异显著。
由表3可见，本发明的长双歧杆菌JDY1017dpH与商业化产品长双歧杆菌BLS相比，具有更低的细胞膜流动性。
Claims (5)
1.一株耐酸长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)JDY1017dpH，其保藏登记号为CGMCC No.8371，其16S rRNA基因部分核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.如权利要求1所述的长双歧杆菌JDY1017dpH，其特征在于，所述长双歧杆菌JDY1017dpH具有以下特性：
(1)优势的耐酸性能
经pH3.5处理4h后，每毫升菌液活菌数的对数值log CFU／ml＝为7.53±0.41，其耐酸性能明显优于普通菌株；
(2)耐酸性能具有遗传稳定性
新筛选到的菌株JDY1017dpH经pH3.5处理4h后，其每毫升菌液活菌数的对数值log CFU／ml＝7.12±0.10，连续传代20次并经pH3.5处理4h后，其每毫升菌液活菌数的对数值log CFU／ml＝7.57±0.15；
(3)不同的细胞膜脂肪酸含量百分比
新筛选到的菌株JDY1017dpH的C16∶0和C16∶1脂肪酸含量百分比分别为24.786±1.162和5.460±0.908，显著低于普通菌株；而C18∶0、C18:1和cycC19∶0脂肪酸含量百分比分别为4.281±0.521、44.066±1.844和11.342±0.996，显著高于普通菌株；平均碳链长度为17.085±0.049，显著长于普通菌株；
(4)具有更低的细胞膜流动性
新筛选到的菌株JDY1017dpH细胞膜的微粘度r＝0.135±0.006，明显高于普通菌株，即细胞膜流动性明显低于普通菌株。
3.权利要求1所述长双歧杆菌JDY1017dpH的获取方法，其特征在于，包括以下步骤：
A、将新鲜的健康青年人粪便5克用50ml粪便稀释液振荡成粪便匀浆液，将1ml粪便匀浆液接入9ml新鲜的pH7.4BL液体培养基中，37℃厌氧培养24h，用接种环挑取菌液在pH6.5的TPY固体培养基平板上划线，37℃厌氧培养24h后，挑取单菌落接种于50ml新鲜的pH7.4BL液体培养基中，37℃厌氧过夜培养至平台期后，7600g离心10min获得菌体，再将菌体转移至pH3.5新鲜的BL液体培养基中，37℃厌氧过夜培养后，7600g离心10min获得菌体；
B、再用pH7.4的磷酸缓冲液洗涤两次后，重悬于500μl pH7.4的磷酸缓冲液中，然后涂布于pH6.5的TPY固体培养基中，37℃厌氧培养3～4天至生长出单菌落，挑取单菌落进行镜检，确认达到菌株纯种分离，并分子鉴定该菌株为长双歧杆菌，命名为长双歧杆菌JDY1017dpH；
C、将长双歧杆菌JDY1017dpH以1％接种量接种于新鲜的pH7.4BL液体培养基中，37℃厌氧培养24h，即得长双歧杆菌JDY1017dpH菌株的发酵液。
4.如权利要求3所述的长双歧杆菌JDY1017dpH的获取方法，其特征在于，所述BL液体培养基、TPY固体培养基和磷酸缓冲液中均含有重量百分含量为0.05％的半胱氨酸盐酸盐。
5.如权利要求1所述的长双歧杆菌JDY1017dpH的应用，其特征在于：所述的长双歧杆菌JDY1017dpH菌株用于日常发酵食品、保健食品和药品的生产领域中。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20140618 |