CN102604855B - 一株长双歧杆菌sqs7-31及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一株长双歧杆菌SQS7-31及其制备方法和应用。长双歧杆菌SQS7-31的16S rRNA基因序列如附图所示。本发明的长双歧杆菌是从新鲜的幼儿粪便中分离获得的菌种，发酵培养过程是：于MRSC液体培养基(MRS中加入0.05％的半胱氨酸盐酸盐)中37℃厌氧培养24h。本发明的长双歧杆菌SQS7-31对酸的耐受性能显著优于普通菌株，并且耐酸性能具有遗传稳定性，其对胆汁盐的耐受性能显著优于普通菌株，在模拟胃液中的幸存率具有显著优势。可用于食品、保健食品和药品的生产领域中。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术，具体涉及一株长双歧杆菌及其制备方法和应用。
背景技术
人的胃肠道栖息着各种细菌，根据其对人体的影响，可分为有益菌、有害菌和中性菌。有益菌，也就是我们所说的益生菌，其中双歧杆菌和乳杆菌是最具代表性的益生菌。当益生菌占优势数量时，人体就会呈现出健康状态。
双歧杆菌属革兰氏阳性菌，是一种专性厌氧菌，其无运动属性，生长周期中不产生芽孢，没有荚膜和鞭毛。
对于pH的变化，双歧杆菌的反应非常敏感，文献报道显示，双歧杆菌的最适生长pH为6.7～7.0，一旦高于8.0或低于5.0，双歧杆菌将不生长。当pH较低时，菌体还会出现大量的死亡。
双歧杆菌对温度的反应同样较为敏感，目前文献的报道结果显示，双歧杆菌在温度介于37℃至41℃时，生长最为迅速，环境温度一旦大于43℃或低于28℃，双歧杆菌生长极其缓慢或停止生长。将双歧杆菌用于生产时，其最适的温度为35～40℃。在更高的温度下，幸存率会大幅度降低。
双歧杆菌在人体内有重要的作用，从目前的报道看，双歧杆菌的生物学功能包括：免疫调节、抗癌抗肿瘤、抑制致病菌、消炎、抗衰老、辅助降血脂、治疗肠道菌群失调、控制内毒素血症等功能。
随着双歧杆菌功能研究的深入，其在食品、保健食品和药品等新产品开发中的应用越来越多。而作为益生菌的双歧杆菌必须具有良好的贮存稳定性和对胃肠道的耐受性，如耐酸、耐胆盐等性能，因此，对不利环境(如胃肠道环境)适应性更强的人源性双歧杆菌优势菌株是应用的重要潜在菌株。
发明内容
本发明的目的，是提供一株长双歧杆菌SQS7-31，它具有优势的耐酸耐胆汁盐性能，在模拟胃肠液中具有高的幸存率，可作为潜在的益生菌菌株。
本发明的长双歧杆菌SQS7-31已于2011年6月27日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，地址：中国北京市海淀区中关村一条13号，中国科学院微生物研究所；保藏登记号为CGMCC No.4993。其分类命名为：长双歧杆菌，拉丁名：Bifidobacterium longum。
为了实现上述目的，本发明的技术方案是：一株长双歧杆菌SQS7-31，其保藏登记号为CGMCC4993，其核苷酸序列如附图1所示。
该长双歧杆菌SQS7-31具有以下特性：
(1)优势的耐酸性能
在pH＝2.5处理0.5h，幸存率为42.43％，在pH＝3.0处理24h，幸存率为11.5％，耐酸性能显著优于普通菌株；
(2)耐酸性能具有遗传稳定性
新分离到的菌株SQS7-31以pH＝2.5处理0.5h，其幸存率为35.41％，传代20次后，以pH＝2.5处理0.5h，其幸存率为53.71％；新分离到的菌株SQS7-31，以pH＝3.0处理24h，其幸存率为8.33％，传代20次后，以pH＝3.0处理24h，其幸存率为14.04％；
(3)对胆汁盐的耐受性能优良
将活化的菌株接入到含有0.2％牛胆汁的培养基中，菌株生长的迟滞时间为0.26小时；将活化的菌株接入到含有0.3％牛胆汁的培养基中，菌株生长的迟滞时间为0.47小时；将活化的菌株接入到含有0.4％牛胆汁的培养基中，菌株生长的迟滞时间为0.60小时；耐胆汁盐性能显著优于普通菌株；
(4)在模拟胃液中的幸存率高
以模拟胃液处理长双歧杆菌SQS7-31 0.5小时，菌株的幸存率为61.9％，耐模拟胃液性能显著优于普通菌株。
上述长双歧杆菌SQS7-31的制备方法，包括以下步骤：
A、将新鲜的幼儿粪便5克用50ml粪便稀释液振荡成匀浆，将1ml粪便匀浆液接入有9ml MRSC培养基的试管，调pH值至3.0，37℃厌氧培养24h，用接种环挑取菌液在MRSC固体培养基平板上划线，37℃厌氧培养24h；
B、纯化分离长双歧杆菌SQS7-31
无菌条件下用接种环在划线培养后的MRSC固体培养基平板上挑取菌落，在新的MRSC平板上继续划线，平板置于厌氧盒内，在37℃培养箱内培养72h，挑取单菌落进行镜检，确认达到菌株纯种分离，经分子鉴定该菌株为长双歧杆菌，命名为长双歧杆菌SQS7-31；
C、发酵培养获得菌液
用接种环将长双歧杆菌SQS7-31从MRSC固体培养基斜面上挑取两环，至装有10ml MRSC液体培养基的试管中，37℃厌氧培养24h后，再以1％接种量接入SQS7-31于MRSC液体培养基中，37℃厌氧培养24h，即得长双歧杆菌SQS7-31菌株的发酵液。
上述长双歧杆菌SQS7-31的应用，所述的长双歧杆菌SQS7-31菌株用于食品、保健食品和药品的生产领域中。
本发明的长双歧杆菌SQS7-31对酸的耐受性能显著优于普通菌株，并且耐酸性能具有遗传稳定性，其对胆汁盐的耐受性能显著优于普通菌株，在模拟胃液中的幸存率具有显著优势。
附图说明
图1为长双歧杆菌SQS7-31的16SrRNA基因序列表。
具体实施方式
本发明的长双歧杆菌从新鲜的幼儿粪便中分离获得，革兰氏染色呈阳性，专性厌氧，无运动属性，生长周期中不产生芽孢，没有荚膜和鞭毛。
该长双歧杆菌已于2011年7月5日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC(地址：中国北京市海淀区中关村一条13号，中国科学院微生物研究所)保藏，保藏登记号为CGMCC No.4993。其分类命名为：长双歧杆菌，拉丁名：Bifidobacterium longum。其16SrRNA基因于美国国立生物技术信息中心基因库(NCBI，GeneBank)备案，基因序列登录号为JN172624。
下面结合实施例和图表进一步说明本发明：
实施例1：菌株的分离纯化
取新鲜的幼儿粪便5克用50ml粪便稀释液振荡成匀浆，将1ml粪便匀浆液接入有9ml MRSC培养基的试管，调pH值至3.0，37℃厌氧培养24h后用接种环挑取菌液在MRSC固体培养基平板上划线，37℃厌氧培养24h。无菌条件下用接种环在划线培养后的MRSC固体培养基平板上挑取菌落，在新的MRSC平板上继续划线，平板置于厌氧盒内，在37℃培养箱内培养72h，挑取单菌落进行镜检，确认达到菌株纯种分离，经分子鉴定该菌株为长双歧杆菌，命名为长双歧杆菌SQS7-31。
实施例2：菌株的镜检
无菌条件下接种环挑长双歧杆菌SQS7-31，涂于载玻片上，制片并革兰氏染色，在显微镜下观察菌体形态。
实施例3：菌株发酵
用接种环将长双歧杆菌SQS7-31从MRSC斜面上挑取两环，至装有10mlMRSC液体培养基的试管中，培养24h之后，再以1％接种量将SQS7-31接入MRSC液体培养基中，37℃厌氧培养24h，即得长双歧杆菌SQS7-31发酵液。
实施例4：长双歧杆菌SQS7-31优势的耐酸性能
将待评价的菌株接种至MRSC液体培养基，并传代2次，第3代发酵液在37℃下厌氧培养至24h，取1ml菌液转移至1.5ml离心管于4000rpm离心5min获菌泥，将菌泥接入10ml pH为3.0(2.5)的MRSC液体培养基内，培养24h(0.5h)；分别对培养0时刻和0.5h或24h的培养液菌体浓度进行计数。以幸存率评价菌株的耐酸性能，幸存率＝(处理后的活菌数/0时刻的活菌数)×100％。本实施例采用实验室保存的分离自商业化产品的长双歧杆菌SQS4-64作为对照菌株。长双歧杆菌SQS7-31优势的耐酸性能如表1、表2所示。
表1长双歧杆菌SQS7-31优势的耐酸性能(pH＝2.5处理0.5h)
*P＜0.05说明2个菌株的耐酸性差异显著。
表2长双歧杆菌SQS7-31优势的耐酸性能(pH＝3.0处理24h)
*P＜0.05说明2个菌株的耐酸性差异显著。
由表1、表2可见，本发明的长双歧杆菌SQS7-31与商业化产品长双歧杆菌SQS4-64相比，其耐酸性能有明显优势。
实施例5：长双歧杆菌SQS7-31优势的耐酸性能具有遗传稳定性
对长双歧杆菌SQS7-31连续传代20代，并对每一代进行酸处理后的幸存率评价。将待评价的菌株接种至MRSC液体培养基，并传代2次，第3代发酵液在37℃下厌氧培养至24h，取1ml菌液转移至1.5ml离心管于4000rpm离心5min获取菌泥，将菌泥接入10ml pH为3.0(2.5)的MRSC液体培养基内，培养24h(0.5h)；分别对培养0时刻和0.5h或24h的菌液进行计数。以幸存率评价菌株的耐酸性能，幸存率＝(处理后的活菌数/0时刻的活菌数)x100％。
长双歧杆菌SQS7-31优势的耐酸性能的遗传稳定性如表3、表4所示。
表3长双歧杆菌SQS7-31优势的耐酸性能的遗传稳定性(pH＝2.5处理0.5h后的菌体幸存率)
表4长双歧杆菌SQS7-31优势的耐酸性能的遗传稳定性(pH＝3.0处理24h后的菌体幸存率)
由表3、表4可见，本发明的长双歧杆菌SQS7-31的优势耐酸性能具有遗传稳定性。
实施例6：长双歧杆菌SQS7-31优势的耐胆汁盐性能
迟滞时间(LT)，表示菌株在含胆汁盐的培养基中生长至菌体吸光度(OD620nm)达到0.3u所需时间与对照之差，正数为生长延迟，负数为生长促进。配制含有牛胆汁的MRSC培养基及普通的MRSC培养基，灭菌。将菌种接入普通的MRSC培养基中，37℃厌氧培养24h，传代活化2次，从0时刻开始，每隔1h测定620nm处的OD值，参数达到0.2u时，每隔10min进行一次测定，记录到达0.3u的时刻及培养时间；将活化的菌株接入含有0.2％牛胆汁的培养基中，进行同样的操作。记录时间点，计算迟滞时间，进行性能评价。表5-7结果表明，与对照菌株SQS4-64相比，迟滞时间明显小，且差异具有显著性，因此SQS7-31具有优势的耐胆汁盐性能。长双歧杆菌SQS7-31优势的耐胆汁盐性能如表5、表6、表7所示。
表5长双歧杆菌SQS7-31优势的耐胆汁盐性能(0.2％w/v牛胆汁盐)
*P＜0.05说明2个菌株的耐胆汁盐性能差异显著。
表6长双歧杆菌SQS7-31优势的耐胆汁盐性能(0.3％w/v牛胆汁盐)
*P＜0.05说明2个菌株的耐胆汁盐性能差异显著。
表7长双歧杆菌SQS7-31优势的耐胆汁盐性能(0.4％w/v牛胆汁盐)
*P＜0.05说明2个菌株的耐胆汁盐性能差异显著。
由表5、表6、表7可见，本发明的长双歧杆菌SQS7-31与商业化产品长双歧杆菌SQS4-64相比，其耐胆汁盐性能有显著优势。
实施例7：长双歧杆菌SQS7-31在模拟胃液中的幸存率具有明显优势
以模拟胃液处理对照组菌株SQS4-64和长双歧杆菌SQS7-31 0.5小时，分别评价其幸存率。结果如表8所示。
表8长双歧杆菌SQS7-31在模拟胃液中的幸存率
*P＜0.05说明2个菌株的耐模拟胃液性能差异显著。
由表8可见，本发明的长双歧杆菌SQS7-31与商业化产品长双歧杆菌SQS4-64相比，其在模拟胃液中的幸存率具有显著优势。
Claims (4)
1.一株长双歧杆菌（Bifidobacterium longum）SQS7-31，其保藏登记号为CGMCC4993，其16s rRNA的核苷酸序列如附图1所示。
2.如权利要求1所述的长双歧杆菌SQS7-31，其特征在于，该长双歧杆菌SQS7-31具有以下特性：
（1）优势的耐酸性能
将该菌株的第3代培养物在pH=2.5处理0.5h，平均幸存率为42.43％，在pH=3.0处理24h，平均幸存率为11.5％，耐酸性能显著优于普通菌株；
（2）耐酸性能具有遗传稳定性
新分离到的菌株SQS7-31以pH=2.5处理0.5h，其幸存率为35.41%，传代20次后，以pH=2.5处理0.5h，其幸存率为53.71％；新分离到的菌株SQS7-31，以pH=3.0处理24h，其幸存率为8.33%，传代20次后，以pH=3.0处理24h，其幸存率为14.04％；
（3）对胆汁盐的耐受性能优良
将活化的菌株接入到含有0.2%牛胆汁的培养基中，菌株生长的迟滞时间为0.26小时；将活化的菌株接入到含有0.3%牛胆汁的培养基中，菌株生长的迟滞时间为0.47小时；将活化的菌株接入到含有0.4%牛胆汁的培养基中，菌株生长的迟滞时间为0.60小时；耐胆汁盐性能显著优于普通菌株；
（4）在模拟胃液中的幸存率高
以模拟胃液处理长双歧杆菌SQS7-31 0.5小时，菌株的幸存率为61.9％，耐模拟胃液性能显著优于普通菌株。
3.如权利要求1所述的长双歧杆菌SQS7-31的应用，其特征在于：所述的长双歧杆菌SQS7-31菌株用于食品和药品的生产领域中。
4.如权利要求1所述的长双歧杆菌SQS7-31的应用，其特征在于：所述的长双歧杆菌SQS7-31菌株用于保健食品的生产领域中。
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