CN106754470A - 一株人母乳来源的鼠李糖乳杆菌及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一株人母乳来源的鼠李糖乳杆菌及其应用。本发明的鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)Z5最初来源于人母乳，属鼠李糖乳杆菌新的亚种，通过实验证明：该菌株具有耐酸、胆盐及耐受模拟动物胃肠道环境特性、能抑制肠道内有害菌大肠杆菌和沙门氏菌生长、很好地黏附到人和动物肠道上皮细胞的特性。可用于制备保健食品、发酵食品、疫苗佐剂和动物饲料，有助于调节人和动物胃肠道菌群平衡，增进人和动物的肠道健康。

Description

一株人母乳来源的鼠李糖乳杆菌及其应用
技术领域
本发明属于食品工业技术、微生物菌种筛选技术领域，具体涉及一株人母乳来源的鼠李糖乳杆菌及其应用。
背景技术
益生菌(probiotics)是指活的微生物，以适当剂量服用时，对宿主人或动物起到有益健康的作用。婴幼儿由于自身免疫系统发育尚未成熟，母传抗体在出生后逐渐消失，在出生后至6周岁这段时期都处于易感期，这段时间大多数婴儿都会因胃肠功能、免疫功能不完善，导致机体抵抗力较弱，消化功能紊乱，进而出现肠吸收不良及感染性疾病。这些异常生理状态不但阻碍了婴儿身体的生长和发育，而且会对婴儿智力发育、情感社交能力的发育都带来不同程度的影响，如果用治疗性的化学药物，势必会担心对婴儿带来不可估量的伤害，而如果用益生菌进行肠道调节，有助于改善婴儿的免疫力、促进肠胃消化吸收，预防各种疾病，保证婴儿健康均衡成长。益生菌在成年人体内也有很多好处：(1)提高人体对营养物质的消化吸收能力。许多益生菌株在胃肠道内可产生消化酶，这些酶可帮助人体更好地消化所摄入的食品和吸收食品中的营养成分。益生菌还可竞争性抑制有害微生物吸收营养物质及进入血液循环系统，嗜酸乳杆菌是这方面的代表菌株，可分泌消化乳糖的乳糖酶，从而缓解乳糖不耐症；(2)定植于人体时产生重要的营养物质。定植于肠道中的益生菌能产生维生素，包括泛酸、尼克酸，以及VB1，VB2，VB6，VK等，同时能产生短链脂肪酸、抗氧化剂、氨基酸等物质，这些物质对骨骼成长和心脏健康有重要作用；(3)可以提高机体抵抗细菌病毒感染的能力。益生菌通过产生杀灭有害菌的化学物质及在肠道中与有害菌竞争空间和资源以遏制它们的生长；抑制有害菌产生毒素；清除有害菌产生的毒素。
益生菌在我国的研究与利用起步较迟，在基础研究和开发利用方面与发达国家都存在一定的差距。许多益生菌诸如乳酸菌等的应用效果不理想。迫切需要开发新型有效的益生菌产品。母乳是婴儿最适宜的天然食物，有婴儿配方奶无法复制的特殊组分。早期人们认为母乳是无菌的，随着菌株分离技术的不断革新，迄今为止在母乳中已分离到200多株细菌，分属于放线菌门、拟杆菌门、厚壁菌门和变形军门。利用选择性培养基，一些具有益生活性的乳酸菌如嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)、短乳杆菌(Lactobacillusbrevis)、干酪乳杆菌(Lactobacilluscasei)、发酵乳杆菌(Lactobacillusfermentum)、唾液乳杆菌(Lactobacillussalivarius)和乳酸乳球菌(Lactococcuslactis)等在母乳中被陆续分离到(Jost et al,2015)。有研究表明，婴儿每天从母乳中约获得104-108的细菌，这些细菌在胃肠道具有很强的抗消化性，作为先头兵在胃肠道定植下来，构成肠道微生物区系的组成部分(Jost et al,2015)。相比其它来源的益生菌，源于母乳中的益生菌具有更好的抗逆、抑菌、抗感染和保持肠道健康的作用。
发明内容
本发明的一个目的是提供一株鼠李糖乳杆菌Lactobacillus rhamnosus Z5。
本发明提供的鼠李糖乳杆菌Lactobacillus rhamnosus Z5的保藏编号为CGMCCNo.12920。
本发明的另一个目的是提供上述鼠李糖乳杆菌Lactobacillus rhamnosus Z5或其菌悬液或其培养液或其发酵产物或含有其的菌剂的新用途。
本发明提供了上述鼠李糖乳杆菌Lactobacillus rhamnosus Z5或其菌悬液或其培养液或其发酵产物或含有其的菌剂在作为益生菌中的应用。
本发明还提供了上述鼠李糖乳杆菌Lactobacillus rhamnosus Z5或其菌悬液或其培养液或其发酵产物或含有其的菌剂在制备益生菌中的应用。
本发明还提供了上述鼠李糖乳杆菌Lactobacillus rhamnosus Z5或其菌悬液或其培养液或其发酵产物或含有其的菌剂在抑菌中的应用。
本发明还提供了上述鼠李糖乳杆菌Lactobacillus rhamnosus Z5或其菌悬液或其培养液或其发酵产物或含有其的菌剂在制备抑菌产品中的应用。
上述应用中，所述菌为肠道内的有害菌，或，所述肠道内的有害菌为大肠埃希菌和/或鸡白痢沙门氏菌。
本发明还提供了上述鼠李糖乳杆菌Lactobacillus rhamnosus Z5或其菌悬液或其培养液或其发酵产物或含有其的菌剂在维护人或动物肠道健康中的应用。
本发明还提供了上述鼠李糖乳杆菌Lactobacillus rhamnosus Z5或其菌悬液或其培养液或其发酵产物或含有其的菌剂在制备维护人或动物胃肠道健康的产品中的应用。
本发明还提供了上述鼠李糖乳杆菌Lactobacillus rhamnosus Z5或其菌悬液或其培养液或其发酵产物或含有其的菌剂在调节人或动物胃肠道菌群平衡中的应用。
本发明还提供了上述鼠李糖乳杆菌Lactobacillus rhamnosus Z5或其菌悬液或其培养液或其发酵产物或含有其的菌剂在制备调节人或动物胃肠道菌群平衡的产品中的应用。
本发明还提供了上述鼠李糖乳杆菌Lactobacillus rhamnosus Z5或其菌悬液或其培养液或其发酵产物或含有其的菌剂在制备保健食品和/或发酵食品和/或疫苗佐剂和/或动物饲料中的应用。
本发明的最后一个目的是提供一种产品。
本发明提供的产品的活性成分为上述鼠李糖乳杆菌Lactobacillus rhamnosusZ5或其菌悬液或其培养液或其发酵产物或含有其的菌剂；
所述产品具有如下1)-5)中任一种功能：
1)制备益生菌；
2)抑菌；
3)维护人或动物胃肠道健康；
4)调节人或动物胃肠道菌群平衡；
5)制备保健食品和/或发酵食品和/或疫苗佐剂和/或动物饲料。
上述产品中，所述菌为肠道内的有害菌，或，所述肠道内的有害菌为大肠埃希菌和/或鸡白痢沙门氏菌。
本发明提供了一株具有良好益生活性的鼠李糖乳杆菌(Lactobacillusrhamnosus)Z5。本发明提供的鼠李糖乳杆菌，在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCC NO.12920。本发明的鼠李糖乳杆菌(Lactobacillusrhamnosus)Z5最初来源于人母乳，属鼠李糖乳杆菌新的亚种，通过实验证明：该菌株具有耐酸、胆盐及耐受模拟动物胃肠道环境特性、能抑制肠道内有害菌大肠杆菌和沙门氏菌生长、很好地黏附到人和动物肠道上皮细胞的特性。可用于制备保健食品、发酵食品、疫苗佐剂和动物饲料，有助于调节人和动物胃肠道菌群平衡，维护人和动物的肠道健康。
附图说明
图1为菌株在MRS-Ca培养基上产生的钙溶圈。
图2为鼠李糖乳杆菌Z5的菌体形态。
图3为鼠李糖乳杆菌Z5的16S rDNA的PCR产物电泳图。
图4为鼠李糖乳杆菌Z5菌株的系统进化树。
图5为鼠李糖乳杆菌Z5全基因组同源基因分析。
图6为鼠李糖乳杆菌Z5发酵上清液对致病菌的抑菌作用。
图7为鼠李糖乳杆菌Z5与Caco-2细胞黏附的显微结构。
保藏说明
菌种名称：鼠李糖乳杆菌
拉丁名：Lactobacillus rhamnosus
菌株编号：Z5
保藏机构：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心
保藏机构简称：CGMCC
地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号
保藏日期：2016年9月1日
保藏中心登记入册编号：CGMCC No.12920
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
实施例1、人母乳来源的鼠李糖乳杆菌Z5的分离和鉴定
一、人母乳来源的鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)Z5的分离
1、人母乳样品的采集
成熟母乳样品(产妇生产后10天)由北京地区孕足月顺产产妇提供，产妇身体状况良好，无乳腺炎等疾病。母乳取样方法参考Martín发明的方法并稍做改进，采样前用无菌水清洗乳头及乳晕部分，并弃去前500μL母乳，无菌离心管中收集5-10ml成熟母乳。同时，用灭菌棉签取乳头及乳晕部分皮肤样本，样本放入厌氧冰盒立即送至实验室进行分离筛选(从取样到菌种分离时间不超过3小时)。
2、乳酸菌的分离筛选
(1)初筛
本发明目的是从母乳中筛选能够产乳酸的乳酸菌，因此利用乳酸菌发酵糖产酸使菌落周围碳酸钙溶解的原理来鉴别乳酸菌。具体操作为：取新采集的母乳及皮肤样本1mL加入9mL PBS缓冲液(137mmol/L NaCl，2.7mmol/L KCl，10mmol/L Na2HPO4，pH 6.8)中，在试管中依次进行十倍梯度稀释制备稀释样本悬液，从最大稀释度开始依次取0.1mL加入培养皿中，采用混菌法将每个培养皿中分别倾注于40～50℃含0.3％碳酸钙的MRS固体培养基(北京索莱宝生物科技有限公司，产品目录号：M8540-250)，轻轻转动培养皿，使样品与培养基充分混合均匀，培养基冷却后，倒置培养于37℃厌氧培养箱中，培养24-48h至长出单个菌落。挑选光滑、凸圆、白色或乳白色、有较大透明圈特征的菌落，于MRS固体培养基划线分离，厌氧培养48h，待长出单菌落后观察记录菌落形状、大小、色泽、透明度等，进行革兰氏染色并于显微镜下观察菌体形态，具体操作：吸取5μl处于对数生长期的待测菌液于载玻片上，将菌液尽量涂成一层薄的菌膜后自然风干，玻片向上在酒精灯上固定三次，将草酸铵结晶紫滴于固定好的菌液表面初染1min，用蒸馏水充分淋洗，滴加碘液媒染1-2min后水洗，用95％的乙醇脱色并水洗，最后用沙黄复染1-2min水洗充分后风干，在电子显微镜下观察结果，从低倍镜到高倍镜，最后用油镜观察，染色结果呈蓝紫色为革兰氏阳性菌，红色为革兰氏阴性菌。
(2)复筛
将初筛获得的产酸且革兰氏阳性的菌落通过过氧化氢酶接触试验进行复筛，具体操作为：将生长旺盛的待测菌液接种在MRS培养基上，培养24h后，将3-15％(体积分数)过氧化氢滴加在菌苔上，待3-5min后观察，若有气泡产生则为阳性，若不出现泡则为阴性。将体积分数为3％过氧化氢溶液滴于镜检为革兰氏阳性的菌落上，若无气泡，初步鉴定为过氧化氢酶阴性。然后将其纯化菌种接种于MRS液体培养基中，37℃厌氧连续培养24-48h，-80℃冷冻保存备用。并将分离得到的菌种命名为Z5。
二、人母乳来源的鼠李糖乳杆菌Z5的鉴定
1、个体形态及菌落特征
新鲜母乳及皮肤样本梯度稀释后采用混菌法涂布于含0.3％碳酸钙的MRS培养基(MRS-Ca培养基)中，将产透明圈的菌落进行复检，初步鉴定为过氧化氢酶阴性的菌落，在含0.3％碳酸钙的MRS培养基平板上分离纯化后，观察菌落形态，菌落呈圆形，表面光滑，乳白色，边缘整齐中间突起较白，经革兰氏染色在油镜下观察菌体特征，G+，短杆状，呈短链状排列。分离菌株在MRS-Ca培养基上产生的钙溶圈见图1，分离菌株Z5经革兰氏染色后显微镜下形态见图2。
2、生理生化鉴定
(1)淀粉水解试验
牛肉膏蛋白胨固体培养基中加入0.2％可溶性淀粉灭菌后划线接种，37℃培养24-48h后滴加少量卢戈氏碘液，若有无色透明圈则淀粉被水解呈阳性，若出现深蓝色，则为阴性。
(2)酪素水解
5g脱脂奶粉于50ml蒸馏水与1.5g琼脂于50ml蒸馏水，115℃，30min分开灭菌后待冷却至45-50℃时，将两液混匀倒平板，即成牛奶平板，每皿点接3-5株菌，37℃培养1-5d，观察菌落周围酪素是否已被分解而呈透明。
(3)明胶液化试验
将活力较好的菌液穿刺接种于明胶培养基中，置于37℃培养，另取未接种试管作为对照，待菌株培养24-48h后放在4℃冰箱或冷水中，观察凝固情况，当对照管凝固后，将全部菌株取出，逐日观察液化情况结果(避免室温高导致的培养基自行融化)。若接种管液化则为阳性反应，若接种管凝固则为阴性反应。
(4)硫化氢产生试验
采用三氯化铁明胶培养基灭菌后趁热加入5ml灭菌的10％氯化铁溶液。立即以无菌操作分装试管，达5-6cm高，迅速冷凝成高层。穿刺接种，培养于37℃观察7天，培养基变黑色者为阳性。
(5)石蕊牛乳试验
含0.004％溴甲酚紫的脱脂牛乳中，接种1％待测菌液，37℃培养24-48h后，观察牛乳颜色，由于乳酸菌发酵产酸，培养基有紫红色变为黄色为阳性。
(6)糖发酵试验
取含有0.004％溴甲酚紫的棉籽糖、蔗糖、山梨醇、乳果糖、纤维二糖、麦芽糖培养基的试管中接入1％待测菌液，并做对照，将上述已接种的糖发酵试管和对照管均置于37℃培养24h-48h，观察试管产酸产气情况。
上述检测结果见表1。该菌分泌胞外多糖，菌株不水解淀粉，明胶不液化，接触酶阴性，不水解酪素，不产生H2S，石蕊牛乳试验阳性，可以利用山梨醇、纤维二糖、乳果糖、麦芽糖、蔗糖、不利用棉籽糖。根据生理生化试验结果，初步鉴定该菌为鼠李糖乳杆菌。
表1 生理生化试验结果
注：“+”表示菌株阳性；“-”表示菌株阴性
3、分子鉴定
(1)16S rDNA序列扩增及系统发育树的构建
以分离菌株Z5总DNA为模板，采用通用的16S rDNA引物(27F：5’-AGTTTGATCMTGGCTCAG-3’；引物1492R：5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’)进行PCR扩增，得到PCR产物。PCR反应体系(25μL)：上下游引物各0.5μL(10μmol/L)，基因组DNA 0.5μL，10×Buffer(with Mg2+)2.5μL，dNTP each 2.5mM 1μL，加双蒸水至25μL。PCR扩增程序为：94℃预变性4min；循环30次(94℃，45s变性；55℃，45s退火；72℃，1min延伸)；72℃延伸10min，PCR产物于4℃终止反应保存。
将PCR产物用1％琼脂糖凝胶电泳检测，得到约1500bp的特异性扩增产物，如图3所示。将PCR产物送上海生物工程技术服务有限公司测序，并将测序结果通过BLAST与GenBank中的已知细菌的核酸序列进行同源性比对分析，并建立系统发育树。
PCR产物测序结果表明，菌株Z5的测序片段长为1438bp，其16S rDNA序列如序列1所示，具有典型的16S rDNA的特征。将获得的序列在GenBank数据库中进行Blast分析，结果表明：菌株Z5的16S rDNA序列与GenBank中同源性最为接近的菌株为鼠李糖乳杆菌菌株(Lactobacillus rhamnosus)；下载同源性较高的细菌序列，用MEGA软件进行多序列比对分析并构建系统发育树，菌株与Lactobacillus rhamnosus登录号JN703790.1亲缘关系最近，同源性达100％，故确定分离得到的菌株为鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)，这与形态学、生理生化特性结果一致。序列比对的同源性分析与进化树构建如图4所示。
(2)鼠李糖乳杆菌Z5的全基因测序及比对分析
委托上海美吉生物医药科技有限公司完成鼠李糖乳杆菌(Lactobacillusrhamnosus)Z5的全基因测序，并选取NCBI数据库中已发表的所有鼠李糖乳杆菌的基因组序列(表2)与本发明获得鼠李糖乳杆菌进行全基因比对分析。
表2 NCBI数据库选取的鼠李糖乳杆菌
序号 来源 GenBank登录号
1 Lactobacillus rhamnosusATCC 53103 FM179322.1
2 Lactobacillus rhamnosusLc 705 FM179323.1
3 Lactobacillus rhamnosusATCC 8530 CP003094.1
4 Lactobacillus rhamnosusLOCK900 CP005484.1
5 Lactobacillus rhamnosusBPL5 LT220504.1
6 LactobacillusrhamnosusASCC290 CP014645.1
7 Lactobacillus rhamnosusLMS2-1 ACIZ00000000.1
8 Lactobacillus rhamnosusCASL AFYD00000000.1
9 Lactobacillus rhamnosusATCC 21052 AFZY00000000.1
10 Lactobacillus rhamnosus769_LRHA JUTS00000000.1
11 Lactobacillus rhamnosusDSM 20021 AZCQ00000000.1
12 Lactobacillus rhamnosusR0011 AGKC00000000.1
13 Lactobacillus rhamnosusMTCC 5462 AEYM00000000.1
14 Lactobacillus rhamnosus 2166 AVFG00000000.2
A、同源基因分析
采用OrthoMCLv2.0.3软件对鼠李糖乳杆菌Z5和NCBI数据库中14个鼠李糖乳杆菌全基因组中所有参与分析的物种的氨基酸(或核苷酸)序列进行比对，选取阈值一般在30-80％之间进行相似性聚类，获得同源基因的列表。统计每一个蛋白聚类cluster的物种分布情况，进行种内的范基因组、核心基因组的研究比对。
结果如图5所示。其中，图5中心部分表示15个鼠李糖乳杆菌的共有基因簇为1118个，远端数字代表不同鼠李糖乳杆菌特有的基因簇数量。从图中可以看出，鼠李糖乳杆菌Z5特有的基因簇数量为213个，证明该菌在基因组序列上与其它菌株存在着较大差异。
B、平均核苷酸相似度(ANI)分析
利用Jspecies(http://imedea.uib-csic.es/jspecies/)软件分析物种全基因组之间平均核苷酸相似度(ANI)的特征性，属间、种间及亚种间两两菌株间ANI与其分类地位相关，具有明显的属种特异性，其中属间的ANI值分布于50-65％，种间的ANI值分布于65-90％，亚种间的ANI值分布于90-99％，同时基因组中的四核苷酸(Tetra)回归系数与ANI值具有相关性，表现明显属种特征性。
同源基因是物种构建亲缘进化关系的依据，平均核苷酸相似度是基于物种全基因组系列，通过分析比较同源基因序列来判定物种间的遗传关联性的重要参数。与单基因如16S rDNA基因相比，其亲缘性不受单个基因或者少数基因变化的遗传速率和基因水平转移影响。ANI与16S rDNA基因序列的同源性相关，并且可以克服在种水平上0-30％平均核苷酸错配种存在的0-5％的16S rDNA基因错配引起的16S rDNA基因不充分的问题。证实ANI与作为原核生物基因组中基因组标签的四核苷酸(Tetra)具有相关性，Tetrade频率具有种属特异性。鼠李糖乳杆菌Z5与已发表的14个鼠李糖乳杆菌的全基因进行平均核苷酸相似度分析(ANI)，发现鼠李糖乳杆菌Z5与其它亚种间的ANI值分布于97-99％(表3)。以上结果证明，从人母乳中分离到的鼠李糖乳杆菌Z5是鼠李糖乳杆菌一个新的亚种。
表3 不同鼠李糖乳杆菌的平均核苷酸相似度分析
综合上述鉴定结果表明，Z5菌株的分类命名为鼠李糖乳杆菌Lactobacillusrhamnosus，该菌株已于2016年9月1日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏号为CGMCC No.12920。
实施例2、鼠李糖乳杆菌Z5作为益生菌的体外活性评价
1、Z5菌株酸耐受能力的测定
将鼠李糖乳杆菌Z5接种于不同pH值(pH 2.5、pH 3.0、pH 6.5)的MRS培养基中，在37℃厌氧条件下培养0h、3h和6h，每组三个平行，采用活菌计数法观察该菌株耐酸情况并计算存活率。
结果如表4所示，Z5菌株在pH 2.5条件下6h后活菌数lg cfu/ml值由初始0h时7.25变为6h后6.35，存活率为87.58％，在pH 3.0条件下6h后活菌数lg cfu/ml值由初始0h时7.91变为6h后7.75，菌株存活率仍达到97.98％，说明Z5菌株具有较强的酸耐受力。
表4 不同pH值条件下菌株存活数与存活率
2、Z5菌株胆盐耐受能力的测定
将鼠李糖乳杆菌Z5菌株分别接种于含有不同质量分数牛胆盐(北京奥博星生物技术有限责任公司，产品目录号：01-017)(0.05％、0.1％、0.15％、0.20％)的MRS液体培养基中，在37℃厌氧的条件下恒温培养0h、3h和6h，每组三个平行，采用活菌计数法观察该菌株耐酸情况并计算存活率。
结果如表5所示，Z5菌株在胆盐浓度为0.05％条件下培养6h，菌株存活不受胆盐影响，能继续生长，活菌数的lg cfu/ml值由初始0h时7.61变为6h后8.00，存活率达到105.06％；随着胆盐浓度的升高，各菌株的生长受到不同程度的抑制，在0.15g/L的胆盐质量浓度下培养6h后，其存活率达到76.14％，当胆盐浓度为0.2％较高时，菌株受到严重的抑制，表现为不生长，存活数为0。
表5 不同浓度胆盐条件下乳酸菌的存活数与存活率
3、Z5菌株耐人工胃、肠液能力的测定
人工胃肠液配制方法参照Carteris的模拟胃肠道转运体系。人工胃液的配制：胃蛋白酶(Sigma-aldrich公司，产品目录号CAS：8049-47-6)溶于PBS缓冲液至终浓度为3g/L，调节pH至3.0，过滤除菌；人工肠液的配制：胰蛋白酶(Sigma-aldrich公司，产品目录号CAS：9001-75-6)和牛胆盐溶于PBS缓冲液至终浓度分别为1g/L和0.1％，调节pH为8.0。将传代2次的鼠李糖乳杆菌Z5接种于上述配置的人工胃液0h，3h后采用平板计数法，计算其人工胃液耐受存活率，每组三个平行。将在pH 3.0人工胃液中消化3h后的1.0ml供试菌液，转接入9.0ml人工肠液中，继续消化0h、3h后采用平板计数法，计算其人工肠液耐受存活率，每组三个平行。
结果如图6所示：将鼠李糖乳杆菌Z5接种于pH值为3.0的人工胃液3h后，其活菌数基本不受影响，存活率保持在92％以上，随即分别接入pH值为8.0的人工肠液后菌株仍然保持较高的存活率，高达96.42，如表6所示。这一结果说明鼠李糖乳杆菌Lactobacillusrhamnosus Z5具有较强抗人工胃液消化能力。
表6 人工胃、肠液条件下乳酸菌的存活数与存活率
4、抑制致病菌试验
将含有指示菌致病性大肠埃希菌(中国兽医微生物菌种保藏管理中心，CVCC3367)、鸡白痢沙门氏菌(中国兽医微生物菌种保藏管理中心，CVCC520)种子液(109cfu/mL)混入50℃左右的LB培养基中，摇匀，倾注于冷却的琼脂平皿上，其上垂直放入已灭菌的牛津杯(内径6mm、外径8mm、高10mm)，待上层LB琼脂培养基凝固后，取出牛津杯，在牛津杯形成的孔中加入200μL鼠李糖乳杆菌Z5发酵上清液，同时，等量MRS液体培养基作对照，室温下放置4h后，37℃恒温培养24-48h，观察测量抑菌圈直径，每组三个平行。
将鼠李糖乳杆菌Z5发酵上清液加入到含有指示菌致病性大肠埃希菌、鸡白痢沙门氏菌种子液的琼脂平皿上，发现Z5对上述两株菌的生长都表现出了抑制作用(图6)，抑菌圈直径分别为21.25±0.35mm和22.5±0.71mm。说明鼠李糖乳杆菌Z5对两株致病菌均有明显的抑制作用。
5、Z5菌株对Caco-2细胞黏附能力的测定
从液氮罐中取出Caco-2细胞(购自中国科学院上海生科院细胞资源中心)，并迅速解冻，培养在7ml MEM完全培养基(10％胎牛血清、1％非必需氨基酸、100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素)中复苏，细胞生长在37℃，CO2培养箱中，隔天换液，当细胞在培养皿底部贴壁量达80％以上，用含0.05％胰酶、0.53mMEDTA的消化液处理3min后加入3mL MEM含10％热灭活的FBS中止反应，将消化后细胞传代至24孔板中进行粘附试验。当细胞长满整个24孔板底部时，调整鼠李糖乳杆菌Z5菌液浓度(浓度约为1×107)，用PBS(pH 7.4)清洗每孔细胞后，每孔添加1ml鼠李糖乳杆菌Z5菌液，37℃培养90min进行黏附试验。黏附完成后，PBS每孔清洗3次未被黏附的细菌，再加入1ml无菌蒸馏水37℃孵育60min进行细胞裂解，将每孔中的细胞与菌悬液全部吸出，梯度稀释后涂布于MRS固体培养基上，每组3个平行，进行菌落计数，计算鼠李糖乳杆菌Z5与Caco-2的粘附情况。
Caco-2细胞经活化传代培养后，24孔板中每板约为5×105个细胞，经过37℃孵育90min后，可黏附8.8×105个鼠李糖乳杆菌Z5，相当于1个Caco-2细胞能黏附1-2个鼠李糖乳杆菌Z5。同时在显微镜下观察发现鼠李糖乳杆菌Z5菌体黏附时形态完整，并且能够黏附在Caco-2单层细胞的刷状边缘上(如图7所示)。说明鼠李糖乳杆菌Z5有很好地黏附到人和动物肠道上皮细胞的特性，可用于制备保健食品、发酵食品、疫苗佐剂和动物饲料，有助于调节人和动物胃肠道菌群平衡，维护人和动物的肠道健康。
序列表
<110>中国农业科学院饲料研究所
<120>一株人母乳来源的鼠李糖乳杆菌及其应用
<160>1
<210>1
<211>1438bp
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>1
tcgacgagta tctgattatt agaaaggtgc ttgcatcttg atttaatttt gaacgagtgg 60
cggacgggtg agtaacacgt gggtaacctg cccttaagtg ggggataaca tttggaaaca 120
gatgctaata ccgcataaat ccaagaaccg catggttctt ggctgaaaga tggcgtaagc 180
tatcgctttt ggatggaccc gcggcgtatt agctagttgg tgaggtaacg gctcaccaag 240
gcaatgatac gtagccgaac tgagaggttg atcggccaca ttgggactga gacacggccc 300
aaactcctac gggaggcagc agtagggaat cttccacaat ggacgcaagt ctgatggagc 360
aacgccgcgt gagtgaagaa ggctttcggg tcgtaaaact ctgttgttgg agaagaatgg 420
tcggcagagt aactgttgtc ggcgtgacgg tatccaacca gaaagccacg gctaactacg 480
tgccagcagc cgcggtaata cgtaggtggc aagcgttatc cggatttatt gggcgtaaag 540
cgagcgcagg cggtttttta agtctgatgt gaaagccctc ggcttaaccg aggaagtgca 600
tcggaaactg ggaaacttga gtgcagaaga ggacagtgga actccatgtg tagcggtgaa 660
atgcgtagat atatggaaga acaccagtgg cgaaggcggc tgtctggtct gtaactgacg 720
ctgaggctcg aaagcatggg tagcgaacag gattagatac cctggtagtc catgccgtaa 780
acgatgaatg ctaggtgttg gagggtttcc gcccttcagt gccgcagcta acgcattaag 840
cattccgcct ggggagtacg accgcaaggt tgaaactcaa aggaattgac gggggcccgc 900
acaagcggtg gagcatgtgg tttaattcga agcaacgcga agaaccttac caggtcttga 960
catcttttga tcacctgaga gatcaggttt ccccttcggg ggcaaaatga caggtggtgc 1020
atggttgtcg tcagctcgtg tcgtgagatg ttgggttaag tcccgcaacg agcgcaaccc 1080
ttatgactag ttgccagcat ttagttgggc actctagtaa gactgccggt gacaaaccgg 1140
aggaaggtgg ggatgacgtc aaatcatcat gccccttatg acctgggcta cacacgtgct 1200
acaatggatg gtacaacgag ttgcgagacc gcgaggtcaa gctaatctct taaagccatt 1260
ctcagttcgg actgtaggct gcaactcgcc tacacgaagt cggaatcgct agtaatcgcg 1320
gatcagcacg ccgcggtgaa tacgttcccg ggccttgtac acaccgcccg tcacaccatg 1380
agagtttgta acacccgaag ccggtggcgt aaccctttag ggagcgagcc gtctaagt 1438

Claims (10)

1.一株鼠李糖乳杆菌Lactobacillus rhamnosus Z5，其保藏编号为CGMCC No.12920。
2.权利要求1所述的鼠李糖乳杆菌Lactobacillus rhamnosus Z5或其菌悬液或其培养液或其发酵产物或含有其的菌剂在作为益生菌中的应用。
3.权利要求1所述的鼠李糖乳杆菌Lactobacillus rhamnosus Z5或其菌悬液或其培养液或其发酵产物或含有其的菌剂在制备益生菌中的应用。
4.权利要求1所述的鼠李糖乳杆菌Lactobacillus rhamnosus Z5或其菌悬液或其培养液或其发酵产物或含有其的菌剂在抑菌中的应用；
或权利要求1所述的鼠李糖乳杆菌Lactobacillus rhamnosus Z5或其菌悬液或其培养液或其发酵产物或含有其的菌剂在制备抑菌产品中的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：
所述菌为肠道内的有害菌，或，所述肠道内的有害菌为大肠埃希菌和/或鸡白痢沙门氏菌。
6.权利要求1所述的鼠李糖乳杆菌Lactobacillus rhamnosus Z5或其菌悬液或其培养液或其发酵产物或含有其的菌剂在维护人或动物肠道健康中的应用；
或权利要求1所述的鼠李糖乳杆菌Lactobacillus rhamnosus Z5或其菌悬液或其培养液或其发酵产物或含有其的菌剂在制备维护人或动物肠道健康的产品中的应用。
7.权利要求1所述的鼠李糖乳杆菌Lactobacillus rhamnosus Z5或其菌悬液或其培养液或其发酵产物或含有其的菌剂在调节人或动物胃肠道菌群平衡中的应用；
或权利要求1所述的鼠李糖乳杆菌Lactobacillus rhamnosus Z5或其菌悬液或其培养液或其发酵产物或含有其的菌剂在制备调节人或动物胃肠道菌群平衡的产品中的应用。
8.权利要求1所述的鼠李糖乳杆菌Lactobacillus rhamnosus Z5或其菌悬液或其培养液或其发酵产物或含有其的菌剂在制备保健食品和/或发酵食品和/或疫苗佐剂和/或动物饲料中的应用。
9.一种产品，其活性成分为权利要求1所述的鼠李糖乳杆菌Lactobacillus rhamnosusZ5或其菌悬液或其培养液或其发酵产物或含有其的菌剂；
所述产品具有如下1)-5)中任一种功能：
1)制备益生菌；
2)抑菌；
3)维护人或动物肠道健康；
4)调节人或动物胃肠道菌群平衡；
5)制备保健食品和/或发酵食品和/或疫苗佐剂和/或动物饲料。
10.根据权利要求9所述的产品，其特征在于：所述菌为肠道内的有害菌，或，所述肠道内的有害菌为大肠埃希菌和/或鸡白痢沙门氏菌。
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