CN111826315A - 一株鼠李糖乳杆菌nx-2及其在制备降尿酸药物中的应用 - Google Patents

一株鼠李糖乳杆菌nx-2及其在制备降尿酸药物中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一株鼠李糖乳杆菌NX‑2及其在制备降尿酸药物中的应用，属于微生物技术领域。本发明公开的一株鼠李糖乳杆菌NX‑2，保藏编号为CGMCC No.20110。鼠李糖乳杆菌NX‑2未灭活与灭活的发酵上清液、菌悬液、细胞破碎物上清液对斑马鱼高尿酸模型均有降尿酸作用；且均能抑制高尿酸斑马鱼体内的黄嘌呤氧化酶活性。本发明所述的鼠李糖乳杆菌NX‑2在制备治疗和/或预防高尿酸血症药物方面有巨大的潜在应用前景。

Description

一株鼠李糖乳杆菌NX-2及其在制备降尿酸药物中的应用
技术领域
本发明涉及微生物技术领域，更具体的说是涉及一株鼠李糖乳杆菌NX-2 及其在制备降尿酸药物中的应用。
背景技术
高尿酸血症(hyperuricemia，HUA)是由于人体嘌吟代谢异常引起尿酸 (UricAcid，UA)生成增加和(或)UA的肾脏排泄减少所致的一种代谢性疾病。目前已知血液中的高尿酸会在关节内形成尿酸晶体，从而导致疼痛、发热、肿胀，通常称为痛风或关节炎。近年来，高尿酸血症也被认为与胰岛素抵抗性糖尿病、高脂血症、肥胖症、肾脏病等疾病的发生息息相关。黄嘌呤氧化酶(Xanthine Oxidase，XO)已被公认为是治疗高尿酸血症的有希望的靶标之一，抑制XO活性可有效减少UA的生物合成。
目前，临床常用的治疗高尿酸血症药物主要包括抑制UA产生或促进UA 排泄两类，例如异嘌呤醇(XO抑制剂)和苯溴马隆(抑制肾尿酸盐的重吸收)。但是，这些药物有许多副作用，例如超敏反应综合征、线粒体功能障碍、史蒂文斯-约翰逊综合征、胃肠道反应、肝肾功能损害等，这在一定程度限制了它们的长期应用。例如，别嘌醇可诱发超敏反应综合征，这可能导致患者死亡。因此，寻找一种疗效可靠、毒副作用小的治疗方式成为主要研究方向。与传统药物治疗相比，具有降尿酸功能的益生菌因其副作用小并且具有其他益生功效等特点，而被广泛关注。治疗痛风的历史其实并不短，是疗法一直没有很大的改变，而微生态制剂的应用给痛风的治疗带来了新的发展，可以更安全，更高效，更健康的治疗痛风病。
益生菌是对宿主健康和生理功能产生有益作用的活性微生物，如乳杆菌和双歧杆菌等。大量研究表明，益生菌在提高免疫力、维持肠道微生态平衡、降低胆固醇、缓解过敏、减肥、降血糖等方面发挥着重要的作用，已被广泛用于开发功能性食品或膳食补充剂。虽然当前国内市场上益生菌制品种类繁多，但是缺乏拥有我国自主知识产权的功能性菌株。国内生产企业所用益生菌菌种长期依赖进口，而且国外菌株未必适合我国居民肠道生理状况。另外，益生菌的功能缺乏有力的科学研究证据，严重影响了益生菌及其制品的推广。基于此，针对菌种资源的功能深入挖掘，筛选出拥有自主知识产权、具有特定功能性质、适合中国人群生理特性的新型益生菌菌株，对提高我国益生菌生产企业的核心竞争力，促进我国益生菌制品发展尤为重要。
因此，提供一株鼠李糖乳杆菌NX-2及其在制备降尿酸药物中的应用是本领域技术人员亟需解决的问题。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了一株鼠李糖乳杆菌NX-2及其在制备降尿酸药物中的应用。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一株鼠李糖乳杆菌Lactobacillus rhamnosus NX-2，其保藏编号为CGMCCNo.20110，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称 CGMCC，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏日期为2020年06月19日，分类命名为鼠李糖乳杆菌Lactobacillus rhamnosus。
进一步，所述的一株鼠李糖乳杆菌NX-2在制备降尿酸药物中的应用。
进一步，所述鼠李糖乳杆菌NX-2为灭活的发酵上清液、菌悬液和细胞破碎物上清液。
进一步，所述鼠李糖乳杆菌NX-2为未灭活的发酵上清液、菌悬液和细胞破碎物上清液。
进一步，所述的一株鼠李糖乳杆菌NX-2在黄嘌呤氧化酶中的应用。
进一步，所述鼠李糖乳杆菌NX-2为灭活的发酵上清液、菌悬液和细胞破碎物上清液。
进一步，所述鼠李糖乳杆菌NX-2为未灭活的发酵上清液、菌悬液和细胞破碎物上清液。
本发明所述鼠李糖乳杆菌NX-2，其未灭活与灭活的发酵上清液(胞外分泌物)、菌悬液(菌体)、细胞破碎物上清液(胞内物)均能显著抑制高尿酸斑马鱼体内黄嘌呤氧化酶的活性，以及显著降低高尿酸斑马鱼体内的尿酸含量。
经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明公开提供了一株鼠李糖乳杆菌NX-2及其在制备降尿酸药物中的应用，鼠李糖乳杆菌NX-2是从健康婴幼儿粪便中分离筛选得到的，在高尿酸斑马鱼体内能显著抑制黄嘌呤氧化酶的活性和显著降低尿酸的含量，具备应用于体内调节尿酸水平的潜能，此为利用鼠李糖乳杆菌NX-2开发预防或治疗高尿酸血症的益生菌制剂提供理论参考和指导依据。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。
图1为本发明鼠李糖乳杆菌NX-2的MALDI-TOF MS蛋白指纹图谱；
图2为本发明鼠李糖乳杆菌NX-2形成的菌落形态图；
图3为本发明鼠李糖乳杆菌NX-2革兰氏染色后的显微形态观察；
图4为本发明鼠李糖乳杆菌NX-2未灭活与灭活的发酵上清液、菌悬液和细胞破碎物上清液对高尿酸斑马鱼体内尿酸含量的影响；
图5为本发明鼠李糖乳杆菌NX-2未灭活与灭活的发酵上清液、菌悬液和细胞破碎物上清液对高尿酸斑马鱼体内黄嘌呤氧化酶活性的影响。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1鼠李糖乳杆菌NX-2分离、鉴定及保藏
(1)分离：将婴幼儿粪便经梯度稀释后，分别接种于TPY固体培养基、 MRS固体培养基和BDS固体培养基中，37℃厌氧培养48h，挑取平板上的单菌落划线分离得到纯菌落。将平板上的纯菌落接种于MRS液体培养基中， 37℃厌氧培养12～16h，加入20％甘油，置于-80℃冰箱中保存。
(2)菌株形态学鉴定：对筛选出的菌株革兰氏染色后于显微镜下观察，革兰氏阳性菌呈紫色，革兰氏阴性菌呈红色。
(3)菌株的分子生物学鉴定：对所获得的菌株提取基因组DNA，通过PCR技术利用16S rDNA通用引物27F和1492R扩增16S rDNA全长片段，之后进行测序，鉴定菌株的种属。
27F：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’；SEQ ID NO.1；
1492R：5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’；SEQ ID NO.2。
实验结果：从婴幼儿粪便中筛选出的菌株，经形态观察、MALDI-TOF MS 蛋白指纹图谱和16S rDNA鉴定，其中菌株NX-2被鉴定为鼠李糖乳杆菌，其 16S rDNA序列如SEQ IDNO.3所示；MALDI-TOF MS蛋白指纹图谱分别如图1所示。
ACGCCACCGGCTTCGGGTGTTACAAACTCTCATGGTGTGACGGGCG GTGTGTACAAGGCCCGGGAACGTATTCACCGCGGCGTGCTGATCCGCG ATTACTAGCGATTCCGACTTCGTGTAGGCGAGTTGCAGCCTACAGTCCGAACTGAGAATGGCTTTAAGAGATTAGCTTGACCTCGCGGTCTCGCAACT CGTTGTACCATCCATTGTAGCACGTGTGTAGCCCAGGTCATAAGGGGCA TGATGATTTGACGTCATCCCCACCTTCCTCCGGTTTGTCACCGGCAGTCT TACTAGAGTGCCCAACTAAATGCTGGCAACTAGTCATAAGGGTTGCGC TCGTTGCGGGACTTAACCCAACATCTCACGACACGAGCTGACGACAAC CATGCACCACCTGTCATTTTGCCCCCGAAGGGGAAACCTGATCTCTCAG GTGATCAAAAGATGTCAAGACCTGGTAAGGTTCTTCGCGTTGCTTCGAA TTAAACCACATGCTCCACCGCTTGTGCGGGCCCCCGTCAATTCCTTTGA GTTTCAACCTTGCGGTCGTACTCCCCAGGCGGAATGCTTAATGCGTTAG CTGCGGCACTGAAGGGCGGAAACCCTCCAACACCTAGCATTCATCGTTT ACGGCATGGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTTCGCTACCCATGCTTTC GAGCCTCAGCGTCAGTTACAGACCAGACAGCCGCCTTCGCCACTGGTG TTCTTCCATATATCTACGCATTTCACCGCTACACATGGAG；SEQ ID NO.3。
该菌单菌落接种到MRS固体培养基上37℃厌氧生长良好、呈圆形、白色菌落(图2)，革兰氏染色呈阳性(图3)。该菌株已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏日期为2020年06月19日，分类命名为鼠李糖乳杆菌Lactobacillus rhamnosus，保藏编号为CGMCC No. 20110。
实施例2鼠李糖乳杆菌NX-2发酵上清液(胞外分泌物)、菌悬液(菌体)和细胞破碎物上清液(胞内物)的制备
将鼠李糖乳杆菌NX-2活化培养后接种于MRS液体培养基中，37℃培养 15h后，调整发酵菌浓度为109CFU/mL，4℃，6000r/min离心10min，得到培养上清液和菌体沉淀，上清液经0.22μm滤膜过滤后得发酵上清液(胞外分泌物)；菌体沉淀经PBS两次洗涤后，将菌体用PBS重新悬浮，调整细胞浓度为109CFU/mL得到菌悬液(菌体)；将菌悬液用超声波破碎仪在冰浴中处理，工作3s、间隔8s，超声破碎15min，12000×g，4℃离心30min，收集上清液，经0.22μm滤膜过滤即为细胞破碎物上清液(胞内物)。发酵上清液 (胞外分泌物)、菌悬液(菌体)和细胞破碎物上清液(胞内物)经100℃加热20min后，制成热灭活的发酵上清液(胞外分泌物)、菌悬液(菌体) 和细胞破碎物上清液(胞内物)。
实施例3鼠李糖乳杆菌NX-2对高尿酸斑马鱼体内尿酸含量的影响
草酸钾和别嘌醇购自上海绿源生物科技有限公司，黄嘌呤钠盐购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司。
模型构建：将野生型AB系斑马鱼(5dpf)置于于六孔板中。实验设置空白对照组、模型组、阳性对照组(别嘌醇)、样品(菌悬液、发酵上清液、细胞破碎物上清液)干预组，每组设置3个复孔，每孔50条鱼，用10mmoL/L 草酸钾与0.5mmoL/L黄嘌呤钠盐联合处理斑马鱼(5dpf)24h后构建高尿酸模型。
干预：空白对照组和模型组每孔加入5mL养殖水；阳性对照组用每孔加入5mL100mg/L别嘌醇溶液；样品干预组每孔加入5mL 10％(v/v，养殖水稀释)样品溶液(未灭活和灭活的：菌悬液、发酵上清液、细胞破碎物上清液)。将6孔板置于37℃生化培养箱至48h后，收集斑马鱼至1.5mL离心管，每管40条斑马鱼，每个实验组收集3管；将离心管中的水吸干后，加入 50μL冰PBS缓冲液。将离心管用超声波破碎仪在冰浴中处理，工作5s、间隔8s，超声破碎10次，12000×g，4℃离心10min，收集上清液。使用尿酸试剂盒(Abcam)检测各组的尿酸浓度。实验重复三次。
采用SPSS 19.0软件统计处理数据，实验数据均用x±SEM数据表示，用单因素方差分析。各实验组组与模型对照组比较：*P<0.05，**P<0.01，***P <0.005。
结果见图4；由图4可知，与空白对照组(21.01±1.42μmoL/L)相比，模型组斑马鱼体内的尿酸含量(58.18±1.52μmoL/L)显著增加(P<0.005)，说明本次斑马鱼高尿酸模型建立成功。
由图4可知，别嘌醇组斑马鱼体内的尿酸含量为25.28±1.53μmoL/L，与模型组(58.18±1.51μmoL/L)相比差异性显著(P<0.005)，因此，别嘌醇具有降尿酸的作用，与临床结果一致。鼠李糖乳杆菌NX-2未灭活的发酵上清液、菌悬液、细胞破碎物上清液组斑马鱼体内的尿酸含量分别为31.25±1.24 μmoL/L、46.03±1.38μmoL/L和41.59±1.49μmoL/L，与模型组(58.18±1.51 μmoL/L)相比均差异性显著(P<0.005)。另外，鼠李糖乳杆菌NX-2灭活的发酵上清液、菌悬液、细胞破碎物上清液组斑马鱼体内的尿酸含量分别为 35.81±1.30μmoL/L、53.81±1.10μmoL/L和46.87±1.64μmoL/L，与模型组 (58.18±1.51μmoL/L)相比差异性显著(P<0.005)。因此，上述结果表明鼠李糖乳杆菌NX-2未灭活与灭活的发酵上清液、菌悬液、细胞破碎物上清液均具有降尿酸的作用。
实施例4鼠李糖乳杆菌NX-2对高尿酸斑马鱼体内黄嘌呤氧化酶活性的影响
使用黄嘌呤氧化酶测定试剂盒(Abcam)检测各组的黄嘌呤氧化酶的活性。实验重复三次。
采用SPSS 19.0软件统计处理数据，实验数据均用x±SEM数据表示，用单因素方差分析。各实验组组与模型对照组比较：*P<0.05，**P<0.01，***P <0.005。
结果见图5；由图5可知，与空白对照组(8.79±0.48U/L)相比，模型组斑马鱼体内的黄嘌呤氧化酶活性(14.51±0.70U/L)显著升高(P<0.005)，说明本次斑马鱼高尿酸模型建立成功。
由图5可知，别嘌醇组斑马鱼体内的黄嘌呤氧化酶活性为10.16±0.62 U/L，与模型组(14.51±0.70U/L)相比差异性显著(P<0.001)，因此，别嘌醇具有抑制黄嘌呤氧化酶活性的作用，与临床结果一致。鼠李糖乳杆菌NX-2 未灭活的发酵上清液、菌悬液、细胞破碎物上清液组斑马鱼体内的黄嘌呤氧化酶活性分别为10.91±0.84U/L、11.36±0.92U/L和11.03±0.69U/L，与模型组(14.51±0.70U/L)相比均差异性显著(P<0.05)。另外，鼠李糖乳杆菌NX-2灭活的发酵上清液、菌悬液、细胞破碎物上清液组斑马鱼体内的黄嘌呤氧化酶活性分别为11.03±0.43U/L、11.03±0.48U/L、11.42±0.71U/L，与模型组(14.51±0.70U/L)相比差异性显著(P<0.05)。因此，上述结果表明鼠李糖乳杆菌NX-2未灭活与灭活的发酵上清液、菌悬液、细胞破碎物上清液均能显著抑制高尿酸斑马鱼体内的黄嘌呤氧化酶活性。
对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。
序列表
<110> 广东南芯医疗科技有限公司 佛山市朗芯生物科技有限公司
<120> 一株鼠李糖乳杆菌NX-2及其在制备降尿酸药物中的应用
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 1
agagtttgat cctggctcag 20
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 2
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<210> 3
<211> 769
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 3
acgccaccgg cttcgggtgt tacaaactct catggtgtga cgggcggtgt gtacaaggcc 60
cgggaacgta ttcaccgcgg cgtgctgatc cgcgattact agcgattccg acttcgtgta 120
ggcgagttgc agcctacagt ccgaactgag aatggcttta agagattagc ttgacctcgc 180
ggtctcgcaa ctcgttgtac catccattgt agcacgtgtg tagcccaggt cataaggggc 240
atgatgattt gacgtcatcc ccaccttcct ccggtttgtc accggcagtc ttactagagt 300
gcccaactaa atgctggcaa ctagtcataa gggttgcgct cgttgcggga cttaacccaa 360
catctcacga cacgagctga cgacaaccat gcaccacctg tcattttgcc cccgaagggg 420
aaacctgatc tctcaggtga tcaaaagatg tcaagacctg gtaaggttct tcgcgttgct 480
tcgaattaaa ccacatgctc caccgcttgt gcgggccccc gtcaattcct ttgagtttca 540
accttgcggt cgtactcccc aggcggaatg cttaatgcgt tagctgcggc actgaagggc 600
ggaaaccctc caacacctag cattcatcgt ttacggcatg gactaccagg gtatctaatc 660
ctgttcgcta cccatgcttt cgagcctcag cgtcagttac agaccagaca gccgccttcg 720
ccactggtgt tcttccatat atctacgcat ttcaccgcta cacatggag 769

Claims (7)

1.一株鼠李糖乳杆菌Lactobacillus rhamnosus NX-2，其特征在于，其保藏编号为CGMCC No.20110。
2.权利要求1所述的一株鼠李糖乳杆菌NX-2在制备降尿酸药物中的应用。
3.根据权利要求2所述的一株鼠李糖乳杆菌NX-2在制备降尿酸药物中的应用，其特征在于，所述鼠李糖乳杆菌NX-2为灭活的发酵上清液、菌悬液和细胞破碎物上清液。
4.根据权利要求2所述的一株鼠李糖乳杆菌NX-2在制备降尿酸药物中的应用，其特征在于，所述鼠李糖乳杆菌NX-2为未灭活的发酵上清液、菌悬液和细胞破碎物上清液。
5.权利要求1所述的一株鼠李糖乳杆菌NX-2在黄嘌呤氧化酶中的应用。
6.根据权利要求5所述的一株鼠李糖乳杆菌NX-2在黄嘌呤氧化酶中的应用，其特征在于，所述鼠李糖乳杆菌NX-2为灭活的发酵上清液、菌悬液和细胞破碎物上清液。
7.根据权利要求5所述的一株鼠李糖乳杆菌NX-2在黄嘌呤氧化酶中的应用，其特征在于，所述鼠李糖乳杆菌NX-2为未灭活的发酵上清液、菌悬液和细胞破碎物上清液。
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