CN116478890B - 一株调节高血糖水平的干酪乳酪杆菌及其制剂和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及益生菌技术领域，具体涉及一株调节高血糖水平的干酪乳酪杆菌及其制剂和应用。干酪乳酪杆菌（Lacticaseibacillus casei）HC1378，已于2023年02月20日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC No.26585。该菌株具备优异的体外降血糖能力，在胃肠液环境中具备较强的定殖及粘附能力，可通过抑制α‑葡萄糖苷酶和α‑淀粉酶的活性来延缓葡萄糖吸收，防止餐后血糖水平升高，能够通过调节高血糖宿主各项血清指标的平衡，维持宿主各脏器指数的平衡，维持宿主肠道菌群的平衡，从而达到维持宿主空腹血糖以及餐后2h血糖水平的目的。

Description

一株调节高血糖水平的干酪乳酪杆菌及其制剂和应用
技术领域
本发明涉及益生菌技术领域，具体涉及一株调节高血糖水平的干酪乳酪杆菌及其制剂和应用。
背景技术
高血糖是一种较为常见的内分泌系统疾病，人的正常空腹血糖值在3.9-6.1mmol/L之间，当其在6.1-7.0mmol/L之间则为空腹血糖过高，当空腹血糖值大于7.0mmol/L时，则有很大可能性为糖尿病。已有研究结果表明，高餐后血糖水平与糖尿病等代谢类疾病的发生有着密切的联系，因为它会导致葡萄糖耐受受损的病人继续发展成为Ⅱ型糖尿病。所以，严格控制餐后血糖水平对糖尿病的预防具有非常重要的意义。血糖水平持续过高，会加速非酶糖基化反应的进行，导致机体蛋白质功能降低老化从而使机体组织发生衰老病变，引发糖尿病、心血管疾病以及神经系统疾病等慢性病及并发症，严重影响人的身体健康以及生活水平。
目前，临床上多采用药物治疗来达到降血糖的目的，常用的药物能在短时间控制血糖，但是不能防止高血糖累积从而引发的糖尿病慢性并发症。长期使用药物会产生耐药性，或有较严重的副作用，还会造成低血糖症状、乳酸性酸中毒、胰腺细胞衰竭和肝脏毒性等多种严重的毒副作用。
随着人们健康意识的不断增强，现有药物已不能满足人们对治疗效果的需要，因此对其安全性提出了更高的要求。故而，从新途径中获取高效、安全且经济的降糖药尤为重要。
发明内容
针对长期服用血糖控制药物易产生耐药性或副作用严重的技术问题，本发明提供一株调节高血糖水平的干酪乳酪杆菌及其制剂和应用，该菌株具备优异的体外降血糖能力，在胃肠液环境中具备较强的定殖及粘附能力，可通过抑制α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶的活性来延缓葡萄糖吸收，防止餐后血糖水平升高，能够通过调节高血糖宿主各项血清指标的平衡，维持宿主各脏器指数的平衡，维持宿主肠道菌群的平衡，从而达到维持宿主空腹血糖以及餐后2h血糖水平的目的。
第一方面，本发明提供一株干酪乳酪杆菌（Lacticaseibacillus casei）HC1378，已于2023年02月20日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC No.26585。
第二方面，本发明提供一种含有上述干酪乳酪杆菌HC1378原粉的制剂。
进一步的，制剂规格为≥100亿CFU/g，≥200亿CFU/g，≥500亿CFU/g，≥1000亿CFU/g，≥2000亿CFU/g。
进一步的，制剂含有干酪乳酪杆菌HC1378的原粉，原粉由干酪乳酪杆菌HC1378发酵液经离心、包被、真空冷冻干燥、粉碎后得到。
进一步的，制剂还包括低聚果糖、水苏糖、菊粉和脱脂奶粉，低聚果糖、水苏糖、菊粉和脱脂奶粉的质量比为1：2：3：5。
第三方面，本发明还提供一种上述干酪乳酪杆菌HC1378在制备调节高血糖水平的产品中的应用。
进一步的，调节高血糖水平的产品为抑制α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶的活性的产品。
本发明的有益效果在于：
本发明得到一株具有降血糖功能的干酪乳酪杆菌HC1378，该菌株在体外可通过抑制α-葡萄糖苷酶以及α-淀粉酶活性达到降血糖的目的，且该菌株具备十分优异的胃肠液定殖能力以及粘附能力。经过动物实验验证，该菌株对高血糖模型小鼠的各项指标均有改善，且在整个试验过程中该益生菌无毒害作用，无肝肠易位现象。干酪乳酪杆菌HC1378可以调节降低小鼠的空腹血糖及餐后2h血糖水平，维持小鼠高糖高脂饮食过程中小鼠的体重；通过调节小鼠血清各指标，改善小鼠脂代谢紊乱现象；通过改善小鼠脏器指数，维持小鼠机体的生长及代谢平衡。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，对于本领域普通技术人员而言，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是干酪乳酪杆菌HC1378的生长曲线图。
图2是实施例2中各样品对α-葡萄糖苷酶的抑制率柱状图。
图3是实施例2中各样品对α-淀粉酶的抑制率柱状图。
图4是实施例3中干酪乳酪杆菌HC1378在模拟胃液和模拟肠液中的存活率折线图。
图5是实施例6中各组小鼠第六周空腹血糖变化折线图。
图6是实施例6中各组小鼠第六周餐后2h血糖变化折线图。
图7是实施例6中各组小鼠十周内体重变化折线图。
图8是实施例6中各组小鼠十周内空腹血糖变化折线图。
图9是实施例6中各组小鼠十周内餐后2h血糖变化折线图。
图10是实施例6中各组小鼠第十周血清总胆固醇含量柱状图。
图11是实施例6中各组小鼠第十周血清甘油三酯含量柱状图。
图12是实施例6中各组小鼠第十周血清高密度脂蛋白胆固醇含量柱状图。
图13是实施例6中各组小鼠第十周血清低密度脂蛋白胆固醇含量柱状图。
图14是实施例6中各组小鼠第十周肝脏指数柱状图。
图15是实施例6中各组小鼠第十周脾脏指数柱状图。
图16是实施例6中各组小鼠第十周肾脏指数柱状图。
具体实施方式
为了使本技术领域的人员更好地理解本发明中的技术方案，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明保护的范围。
实施例1 干酪乳酪杆菌HC1378的筛选与生长曲线测定
1. 益生菌菌株的分离
实验所用样品于2021年08月份取自青海省西宁市，取1mL样品用无菌的0.85%生理盐水进行稀释后涂布于MRS固体培养基上培养，挑选一菌株在MRS固体培养基上连续划线培养3次，得到纯化菌株，命名为HC1378。
委托生工生物工程（上海）股份有限公司进行16S rDNA测序。在NCBI（NationalCenter for Biotechnology Information，美国国立生物技术信息中心）数据库中把序列和16S rDNA基因进行比较，应用MEGA5.0软件分析并构建系统发育树。
BLAST分析，菌株HC1378十分接近干酪乳酪杆菌（Lacticaseibacillus casei）（99%亲缘），故命名为干酪乳酪杆菌（Lacticaseibacillus casei）HC1378。
序列结果如下：
ATGGCTCAGGATGAACGCTGGCGGCGTGCCTAATACATGCAAGTCGAACGAGTTTTGGTCGATGAACGGTGCTTGCACTGAGATTCGACTTAAAACGAGTGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTGCCCTTAAGTGGGGGATAACATTTGGAAACAGATGCTAATACCGCATAAATCCAAGAACCGCATGGTTCTTGGCTGAAAGATGGCGCAAGCTATCGCTTTTGGATGGACCCGCGGCGTATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCGATGATACGTAGCCGAACTGAGAGGTTGATCGGCCACATTGGGACTGAGACACGGCCCAAACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCACAATGGACGCAAGTCTGATGGAGCAACGCCGCGTGAGTGAAGAAGGCTTTCGGGTCGTAAAACTCTGTTGTTGGAGAAGAATGGTCGGCAGAGTAACTGTTGTCGGCGTGACGGTATCCAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTATCCGGATTTATTGGGCGTAAAGCGAGCGCAGGCGGTTTTTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCTCGGCTTAACCGAGGAAGCGCATCGGAAACTGGGAAACTTGAGTGCAGAAGAGGACAGTGGAACTCCATGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGATATATGGAAGAACACCAGTGGCGAAGGCGGCTGTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGCTCGAAAGCATGGGTAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCATGCCGTAAACGATGAATGCTAGGTGTTGGAGGGTTTCCGCCCTTCAGTGCCGCAGCTAACGCATTAAGCATTCCGCCTGGGGAGTACGACCGCAAGGTTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCTTTTGATCACCTGAGAGATCAGGTTTCCCCTTCGGGGGCAAAATGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTATGACTAGTTGCCAGCATTGAGTTGGGCACTCTAGTAAGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGATGGTACAACGAGTTGCGAGACCGCGAGGTCAAGCTAATCTCTTAAAGCCATTCTCAGTTCGGACTGTAGGCTGCAACTCGCCTACACGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCACGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGAGAGTTTGTAACACCCGAAGCCGGTGGCGTAACCCTTTTAGGG。
将上述菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为2023年02月20日，保藏编号为CGMCCNo.26585。
将冷冻低温保藏后的干酪乳酪杆菌HC1378于常温活化，接入种瓶后，37℃有氧培养24h。待种瓶长好，调设温度及pH至最适，空气保压培养，按照接种量为2%进行接种，以未接种的MRS培养基为空白对照，用容量瓶进行50倍稀释，每隔2小时测一次OD600，并绘制生长曲线。
如图1所示，接种干酪乳酪杆菌HC1378后的0至8h，菌株生长较迟缓，这表明其处于正在适应生长环境的调整期；8h后菌株呈指数形式迅速增长，进入对数期；直至18h，菌株增长减缓，维持稳定状态，进入稳定期。
实施例2 菌株体外降糖能力测定
α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶是人体内消化淀粉的两种关键酶。α-淀粉酶是一种将多糖水解成寡糖的酶，α-葡萄糖苷酶广泛分布于小肠黏膜刷状缘上，能够将进入体内的碳水化合物分解为可利用吸收的葡萄糖，从而引起餐后血糖的升高。因此，可通过抑制α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶的活性来延缓葡萄糖吸收，防止餐后血糖水平升高。
（1）样品制备
活化后的干酪乳酪杆菌HC1378进行2次传代后，取发酵液于4℃、3800rpm条件下离心20min，收集上清，经0.22μm水系滤膜过滤后，得到菌株发酵上清样品。
活化后的干酪乳酪杆菌HC1378进行2次传代后，取发酵液于4℃、3800rpm条件下离心15min，收集菌体，用pH=6.8的无菌PBS缓冲盐溶液（0.1mol/L）洗涤3次后，重悬于PBS中调整至菌数约为1×109CFU/mL（OD600=1），即得到菌悬液。
活化后的干酪乳酪杆菌HC1378进行2次传代后，取发酵液于4℃、3800rpm条件下离心15min，收集菌体，用pH=6.8的无菌PBS缓冲盐溶液（0.1mol/L）洗涤3次后，重悬于PBS中调整至菌数约为1×109CFU/mL（OD600=1），进行超声破碎，于4℃、3800rpm条件下离心20min，经0.22μm水系滤膜过滤后，得到菌体细胞破碎内容物上清样品（以下简称细胞破碎物）。
（2）菌株对α-葡萄糖苷酶活性的抑制能力
利用PNPG能够被α-葡萄糖苷酶水解生成PNP和葡萄糖，PNP在405nm处有特征吸收的原理，对α-葡萄糖苷酶活性进行测定，步骤如下表1所示，每个样品（发酵上清、菌悬液、细胞破碎物及1mg/mL阿卡波糖）设置三个平行。
表1 α-葡萄糖苷酶活性的抑制实验的条件和步骤
α-葡萄糖苷酶抑制率计算公式：
α-葡萄糖苷酶抑制率（%）=1-[（AB-Ab）/（AA-Aa）]×100%；
式中：AA为对照组-A在405nm处的吸光值；
Aa为对照空白组-a在405nm处的吸光值；
AB为样品组-B在405nm处的吸光值；
Ab为样品空白组-b在405nm处的吸光值。
结果如图2所示，发酵上清、菌悬液、细胞破碎物以及阳性对照阿卡波糖对α-葡萄糖苷酶的活性均有抑制作用，以阳性对照阿卡波糖对α-葡萄糖苷酶活性抑制率86.53%为参考，发酵上清对α-葡萄糖苷酶活性抑制率最低，其次为菌悬液，细胞破碎物对α-葡萄糖苷酶活性抑制率可达到75.71%，最接近阳性对照。该结果表明，干酪乳酪杆菌HC1378具备优异的体外抑制α-葡萄糖苷酶活性的能力。
（3）菌株对α-淀粉酶活性的抑制能力
利用α-淀粉酶可以水解可溶性淀粉生成葡萄糖，3,5-二硝基水杨酸（DNS）与还原糖共热后被还原成棕红色的氨基化合物的原理，对α-淀粉酶活性进行测定，步骤如下表2所示，每个样品（发酵上清、菌悬液、细胞破碎物及1mg/mL阿卡波糖）设置三个平行。
表2 α-淀粉酶活性的抑制实验的条件和步骤
α-淀粉酶抑制率计算公式：
α-淀粉酶抑制率（%）=1-[（AB-Ab）/（AA-Aa）]×100%；
式中：AA为对照组-A在540nm处的吸光值；
Aa为对照空白组-a在540nm处的吸光值；
AB为样品组-B在540nm处的吸光值；
Ab为样品空白组-b在540nm处的吸光值。
结果如图3所示，发酵上清、菌悬液、细胞破碎物以及阳性对照阿卡波糖对α-淀粉酶的活性均有抑制作用，以阳性对照阿卡波糖对α-淀粉酶活性抑制率91.61%为参考，菌株发酵上清对α-淀粉酶活性抑制率最低，其次为菌悬液，细胞破碎物对α-淀粉酶活性抑制率可达到90.38%，十分接近阳性对照。该结果表明，干酪乳酪杆菌HC1378具备优异的体外抑制α-淀粉酶活性的能力。
实施例3 菌株定殖能力测定
乳酸菌在宿主胃肠道中的定殖和黏附可以延长其在体内的停留时间，进而通过改善局部微生物群或其代谢产物来影响宿主的健康。胃酸和胆盐对细菌有一定抑制作用，益生菌进入人体必须能顺利通过胃液，同时还要能够抵抗胆盐，因此菌株对胃酸及胆盐耐受能力是衡量益生菌的重要指标。
（1）胃肠液模拟溶液配制
胃液缓冲液（pH3.0）：准确称取0.5144g KCl，0.1225g KH2PO4，2.75085g NaCl，2.1002g NaHCO3，0.0203g MgCl2·6H2O，0.0480g (NH4)2CO3，0.0083g CaCl2，定容至1000mL；
模拟胃液：3g的胃蛋白酶溶于1000mL胃液缓冲液中，用1mol/L HCl调节pH至3.0，0.22μm滤膜过滤除菌，现用现配。
肠液缓冲液：准确称取0.5069g KCl，0.1089g KH2PO4，2.2442g NaCl，7.1408gNaHCO3，0.0067g MgCl2·6H2O，0.0333g CaCl2，定容至1000mL；
模拟肠液（0.1%胆盐）：1000mL肠液缓冲液，加入1g胰蛋白酶和1g的胆盐溶解后，用1 mol/L的NaOH调节模拟肠液的pH至8.0，0.22μm滤膜过滤除菌，现用现配。
（2）菌体富集
菌株活化后，以1%接种量接种于液体培养基中，37℃有氧静置培养24h。于无菌条件下，6000rpm离心10 min，倒掉上清收集菌泥，用无菌PBS缓冲液洗涤3次后，备用。
（3）胃液模拟消化
取富集后菌体1mL，加入9mL模拟胃液，设置三个平行，37℃恒温水浴，转速100r/min，振荡0h、1h、2h、3h、4h，分别用稀释涂布平板法计算活菌数，每个样品涂布三个重复。根据公式计算乳酸菌定殖存活率：
胃液定殖存活率=定殖存活的乳酸菌数/初始的乳酸菌数×100%。
结果如图4所示。可以明显看出，虽然随着时间的变化，干酪乳酪杆菌HC1378存活率在下降，但是菌株在模拟胃液中消化4h的过程中整体存活率超过了80%。
（4）肠液模拟消化
取富集后菌体1mL，加入9mL模拟肠液，每株菌设置三个平行，37℃恒温水浴，转速100 r/min，振荡0h、1h、2h、3h、4h，分别用稀释涂布平板法计算活菌数，每个样品涂布三个重复。根据公式计算乳酸菌定殖存活率：
肠液定殖存活率=定殖存活的乳酸菌数/初始的乳酸菌数×100%。
结果如图4所示。可以明显看出，虽然随着时间的变化，干酪乳酪杆菌HC1378存活率在下降，但是菌株在模拟肠液中消化4h过程中整体存活率超过75%。
（5）胃液-肠液二步法模拟消化
取富集后菌体1mL，加入9mL模拟胃液，每株菌设置三个平行，37℃恒温水浴，转速100r/min，振荡3h后取出迅速离心，再向其中加入9mL模拟肠液，同条件振荡培养2h，最终用稀释涂布平板法进行计数，每个样品涂布3个重复。根据公式计算乳酸菌定殖存活率：
肠胃液定殖存活率=定殖存活的乳酸菌数/初始的乳酸菌数×100%。
经计算，通过模拟胃液-肠液二步法消化后，菌株存活率能够达到69.11%±1.35%。综合实验结果，干酪乳酪杆菌HC1378是一株具有耐酸、耐胆盐功能、能够在胃肠道中定殖的优秀菌株。
实施例4 菌株黏附能力测定
乳酸菌在宿主胃肠道中的定殖和黏附可以延长其在体内的停留时间，进而通过改善局部微生物群或其代谢产物来影响宿主的健康。
（1）粘蛋白模型建立
称取10mg粘蛋白用无菌PBS缓冲液配置浓度为1 mg/mL的粘蛋白溶液，-20℃保藏。取500µL粘蛋白溶液在24孔细胞培养板上固定1h，4℃培养过夜，再加入等体积的黏蛋白继续37℃培养2h以弥补空白位点后，用无菌PBS缓冲液洗涤2次。
（2）菌株对黏蛋白黏附能力测定
过夜培养的菌株收集菌体后分别重悬于无菌PBS中，调整菌数在108CFU/mL，涂布计数并记录。向粘蛋白模型中加入500µL菌悬液，37℃培育1h后，用无菌柠檬酸缓冲液清洗5次，去除未结合的细菌，加入1mL0.5%吐温80（v/v）收集黏附菌。最终用稀释涂布平板法进行计数，每个样品涂布三个重复。根据公式计算乳酸菌黏附率：
粘蛋白黏附率=黏附的乳酸菌数/初始的乳酸菌数×100%。
经计算，干酪乳酪杆菌HC1378对黏蛋白黏附率可达到47.87%±2.36%，粘附率十分优异。
（3）菌株对Caco-2细胞黏附能力测定
向24孔细胞培养板中接种0.5mL Caco-2细胞，其中Caco-2细胞调整为2×105cell/mL，将其培养至单层，PBS洗涤2次后加入500µL乳酸菌悬液（108CFU/mL），37℃培养2h，PBS洗涤3次除去未黏附的乳酸菌，加入150µL胰酶细胞消化液，待细胞完全脱落后加入350µL MEM完全培养液终止消化，最终用稀释涂布平板法进行计数，每个样品涂布三个重复。根据公式计算乳酸菌黏附率：
Caco-2细胞黏附率=黏附的乳酸菌数/初始的乳酸菌数×100%。
经计算，干酪乳酪杆菌HC1378对Caco-2细胞黏附率可达到58.68%±1.05%，粘附率十分优异。
实施例5 干酪乳酪杆菌HC1378制剂的制备
将保藏的干酪乳酪杆菌HC1378于常温中回温1h，接种于3.5L液体培养基中培养16-20h，制成一级种子，再转接至100L种子罐中培养6-8h得到二级种子，随后以10%的接种量转种至1000L发酵罐中进行发酵；其中，
3.5L培养基：蛋白胨10.0g/L、酵母浸粉5.0g/L、葡萄糖20.0g/L、磷酸氢二钾2.0g/L、柠檬酸三铵2.0g/L、醋酸钠5.0g/L、硫酸镁0.1g/L、硫酸锰0.05g/L、吐温80 1.0g/L；
100L种子罐培养基：蛋白胨10.0g/L、酵母浸粉5.0g/L、葡萄糖20.0g/L、磷酸氢二钾2.0g/L、柠檬酸三铵2.0g/L、醋酸钠5.0g/L、硫酸镁0.1g/L、硫酸锰0.05g/L、食用油1.0g/L；
1000L发酵罐培养基：乳清粉5g/L、葡萄糖62g/L、酵母粉16g/L、浓缩胡萝卜汁6g/L、浓缩苦瓜汁4g/L、大豆蛋白胨5g/L、硫酸锰0.05g/L、硫酸镁0.1g/L、磷酸氢二钾1.2g/L、柠檬酸三铵1.2g/L、醋酸钠1.9g/L、食用油1.0g/L。
将扩培后的发酵液离心，得到菌泥，对菌泥包被后进行真空冷冻干燥，得到冻干块，粉碎冻干块后得到干酪乳酪杆菌原粉。
将制得的干酪乳酪杆菌原粉加入生理盐水中，制成活菌数为1×108CFU/mL的益生菌活菌制剂。
在其他实施例中，还可以将原粉与质量比为1：2：3：5的低聚果糖、水苏糖、菊粉、脱脂奶粉充分混匀稀释，制备规格为≥100亿CFU/g，≥200亿CFU/g，≥500亿CFU/g，≥1000亿CFU/g，≥2000亿CFU/g的菌粉。
实施例6 动物模型试验
（1）饲料制备
基础饲料：玉米粉23%，麸皮20.1%，面粉22%，豆饼20%，米粉6%，钙粉3%，骨粉2.5%，酵母粉1.9%，食盐0.9%，复合维生素0.5%，微量元素0.1%，混匀造粒，使用前灭菌。
高糖高脂饲料：8.7%蛋黄粉，14.7%猪油，5%大豆油，18.4%蔗糖，0.2%胆盐，53%基础饲料，混匀造粒，使用前灭菌。
（2）分组及喂养
60只4周龄SPF级小鼠，初始体重为15±1g，自由饮水、进食，定时更换垫料，适应性喂养1周后剔除异常小鼠，采用随机区组分组法分为4组：空白对照组（NCD）、高糖模型组（HFCD）、益生菌A组（HFCD-A）以及益生菌B组（HFCD-B），其中HFCD及HFCD-A组小鼠在建模成功前一同培养，待建模成功剔除异常小鼠后再随机分为HFCD及HFCD-A。按照表3设计进行饲喂，饲料和水可自由获得，灌胃时以无菌生理盐水作为益生菌活菌制剂（1×108CFU/mL，按实施例5方法制备）的空白对照，灌胃时间固定为早上9：00和晚上8：00，灌胃剂量为每100g重量灌胃1mL。第5周建模成功后，所有小鼠均开始饲喂基础饲料，并通过第6周血糖参数观察模型的稳定性；
其中，小鼠高糖模型通过注射链脲佐菌素（STZ）建立，将STZ溶于无菌柠檬酸缓冲液液中配置浓度为75mg/mL的STZ柠檬酸溶解液，过滤后备用，建模时在30分钟内完成注射。
表3 小鼠分组饲喂设计
（3）小鼠建模数据监测
于第六周开始，于第1天、第4天、第7天每间隔2天对各组小鼠进行空腹血糖（Fasting plasma glucose, FBG）以及餐后2h血糖（Postprandial blood glucose, PBG）的检测，判断建模成功与否以及建模的稳定性。
结果如图5、图6所示，空白对照组小鼠的空腹血糖总体低于7mmol/L，餐后2h血糖总体低于11.1mmol/L，血糖正常。而高糖模型组、益生菌A组以及益生菌B组的小鼠空腹血糖整体高于7mmol/L，餐后2h血糖整体高于11.1mmol/L，且一直处于一个稳定状态。这表明高血糖模型建模成功且状态稳定。
（4）各组小鼠状态对比
建模成功后的饲养过程中空白对照组小鼠整体生长状态及活动正常，皮毛顺滑光泽，精神状态健康积极，大便成形；高糖模型组小鼠摄食摄水较空白对照组有增加，尿量也随之增加，需勤换垫料，皮毛毛躁，精神低萎反应迟钝，大便不成形；益生菌A组小鼠较高糖模型组状态明显改善许多，活动量也较多，垫料更换次数明显少于高糖模型组；益生菌B组小鼠较高糖模型组以及益生菌A组在皮毛、精神状态、活动量、排泄等方面均有不同程度的好转。
每周固定时间称量小鼠重量。如图7所示，空白对照组在整个实验周期中体重呈稳定增长趋势；高糖模型组以及益生菌A组在饲喂高糖高脂饲料的第2-4周，小鼠体重增长速度明显高于空白对照组，经过第5周对模型小鼠注射（Streptozotocin，STZ）诱导高血糖模型分组后，高糖模型组以及益生菌A组小鼠体重有不同程度的下降，其中以建模后未经干酪乳酪杆菌干预的高糖模型组体重下降速度最快，而建模后经益生菌灌胃干预的益生菌A组小鼠体重下降速度有所减缓，这一现象表明，干酪乳酪杆菌HC1378可缓解高血糖模型小鼠的体重减轻症状；益生菌B组小鼠是自建模前便已开始进行益生菌灌胃且一直持续到实验结束，自图7中可明显看出，在配合高糖高脂饲料饲喂的2-4周，益生菌B组小鼠体重增长速度略高于空白对照组，但显著低于高脂模型组以及益生菌A组，在建模后的6-10周益生菌B组小鼠体重并没有显著下降，仅是趋于稳定的一个状态，这表明在建模前开始进行益生菌干预，能够调节高血糖模型小鼠整个生长过程中体重的非常规增长及减轻，维持其生长过程中的体重平衡。表明干酪乳酪杆菌HC1378的干预对严重高血糖引发的体重减轻症状有一定的缓解作用，且该菌的干预时间越早效果越好。
每周固定时间测小鼠空腹血糖、以及餐后2h血糖。如图8、图9所示，能够看出，空白对照组在整个实验周期中，空腹血糖一直低于7mmol/L，餐后2h血糖总体低于11.1mmol/L，且十分平稳；高糖模型组以及益生菌A组在饲喂高糖高脂饲料的第2-4周，不论是其空腹血糖还是其餐后2h血糖均呈显著增长趋势，自第5周分组后，未经任何干预的高糖模型组小鼠的空腹血糖以及餐后2h血糖一直稳步上升，而经干酪乳酪杆菌灌胃干预的益生菌A组小鼠的空腹血糖以及餐后2h血糖开始有明显且持续的下降，这表明干酪乳酪杆菌可缓解高血糖模型小鼠空腹血糖以及餐后2h血糖水平的持续上升，有一定的降血糖效果；益生菌B组小鼠是自建模前便已开始进行益生菌灌胃且一直持续到实验结束，自图中可明显看出，在配合高糖高脂饲料饲喂的2-4周，益生菌B组小鼠空腹血糖以及餐后2h血糖水平有一定程度的升高，但显著低于高脂模型组以及益生菌A组，在建模后的6-10周配合基础饲料进行益生菌灌胃后，益生菌B组小鼠的空腹血糖以及餐后2h血糖水平开始有所下降，虽依旧高于空白对照组，但也已趋近正常水平，这表明在建模前开始进行益生菌干预，能够更高效的调节高血糖模型小鼠的空腹血糖以及餐后2h血糖水平。表明干酪乳酪杆菌HC1378的干预对空腹血糖以及餐后2h血糖水平过高有调节作用，且该菌的干预时间越早，其对空腹血糖以及餐后2h血糖水平过高的调节作用越大。
（5）小鼠血液采集及相关指标测定
试验周期第10周，对小鼠禁食不禁水12h，对小鼠进行摘眼球取血，将采得血样室温静置1h后在4℃条件下8000rpm离心10min分离血清备用，通过总胆固醇（TC）检测试剂盒、甘油三酯（TG）检测试剂盒、高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）试剂盒、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）试剂盒。
结果如图10~图13所示，高糖模型组与空白对照组相比，模型组的小鼠血清TC、TG和LDL水平有显著增加（p<0.05），而血清HDL-C水平显著下降（p<0.05），这表明高糖模型组小鼠血清指标已严重失衡，故而引发小鼠代谢失衡，导致高糖模型组小鼠体重及血糖水平的变化。相比较于高糖模型组的变化，经不同方式处理的益生菌A组与益生菌B组缓解了小鼠血清TC、TG和LDL水平的升高以及血清HDL-C水平的下降，其中以益生菌B组效果最显著且趋于正常水平。上述结果表明，干酪乳酪杆菌HC1378可降低高血糖小鼠血清中的TC、TG、LDL-C，提升HDL-C的含量，维持其血清中各项血清指标的平衡从而调节小鼠自身脂代谢紊乱现象，且该菌的干预时间越早其调节效果越好。
（6）小鼠脏器指数测定
试验周期第10周，对小鼠禁食不禁水12h，脱颈处死小鼠后，在解剖过程中精确迅速取出小鼠肝脏、脾脏和肾脏，称重并记录数据。根据公式计算小鼠各脏器指数：
肝脏指数=肝脏重量（g）/体重（g）×100%；
脾脏指数=脾脏重量（g）/体重（g）×100%；
肾脏指数=肾脏重量（g）/体重（g）×100%。
结果如图14~图16所示，高糖模型组的小鼠可以明显看出其肝脏指数、脾脏指数和肾脏指数均显著高于空白对照组（p<0.05），进行干酪乳酪杆菌灌胃的益生菌A组与益生菌B组这几项脏器指数显著低于高糖模型组（p<0.05），且向空白对照组靠近，以益生菌B组效果最为显著。综上所述，食用干酪乳酪杆菌HC1378菌粉，可以帮助小鼠维持较为正常的肝脏指数、脾脏指数和肾脏指数，从而维持小鼠的健康状态，且该菌的干预时间越早其对脏器指数的维持效果越好。
（7）小鼠肝脏益生菌检测
将步骤（6）解剖得到小鼠肝脏迅速放至无菌平板中，切取肝脏1g加入无菌PBS缓冲液中悬浮、均质，取1mL溶液涂布于MRS固体平板，37℃恒温好氧以及厌氧培养48h，检测平板中是否有菌生长。
有研究表明高糖模型小鼠饲喂某些益生菌后，在肝脏部位会有菌生长，从而导致肝功能衰竭。本试验中各组小鼠肝脏组织无菌涂布在MRS平板，好氧以及厌氧培养48h后，均未发现菌落的形成。这表明干酪乳酪杆菌在动物体内不会发生的肝肠易位现象。
尽管通过参考附图并结合优选实施例的方式对本发明进行了详细描述，但本发明并不限于此。在不脱离本发明的精神和实质的前提下，本领域普通技术人员可以对本发明的实施例进行各种等效的修改或替换，而这些修改或替换都应在本发明的涵盖范围内/任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (7)

1. 一株干酪乳酪杆菌（Lacticaseibacillus casei）HC1378，其特征在于，已于2023年02月20日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC No.26585。
2.一种含有如权利要求1所述的干酪乳酪杆菌HC1378的制剂。
3.如权利要求2所述的制剂，其特征在于，制剂规格为≥100亿CFU/g，≥200亿CFU/g，≥500亿CFU/g，≥1000亿CFU/g或≥2000亿CFU/g。
4.如权利要求2所述的制剂，其特征在于，制剂含有干酪乳酪杆菌HC1378的原粉，原粉由干酪乳酪杆菌HC1378发酵液经离心、包被、真空冷冻干燥、粉碎后得到。
5.如权利要求2所述的制剂，其特征在于，制剂还包括低聚果糖、水苏糖、菊粉和脱脂奶粉。
6.如权利要求5所述的制剂，其特征在于，低聚果糖、水苏糖、菊粉和脱脂奶粉的质量比为1：2：3：5。
7.一种如权利要求1所述的干酪乳酪杆菌HC1378在制备调节高血糖水平的产品中的应用，其特征在于，调节高血糖水平的产品为抑制α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶的活性，调节血清指标平衡的产品。
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Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102533868A (zh) * 2011-12-07 2012-07-04 光明乳业股份有限公司 干酪乳杆菌LC2W在制备Alpha-糖苷酶抑制剂中的用途
CN114015610A (zh) * 2021-11-26 2022-02-08 陕西省微生物研究所 一株具有α-葡萄糖苷酶高抑制活性的短乳杆菌及其应用
WO2022258694A1 (fr) * 2021-06-09 2022-12-15 Institut National De Recherche Pour L'agriculture, L'alimentation Et L'environnement Probiotique et ses utilisations

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102533868A (zh) * 2011-12-07 2012-07-04 光明乳业股份有限公司 干酪乳杆菌LC2W在制备Alpha-糖苷酶抑制剂中的用途
WO2022258694A1 (fr) * 2021-06-09 2022-12-15 Institut National De Recherche Pour L'agriculture, L'alimentation Et L'environnement Probiotique et ses utilisations
CN114015610A (zh) * 2021-11-26 2022-02-08 陕西省微生物研究所 一株具有α-葡萄糖苷酶高抑制活性的短乳杆菌及其应用

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Identification and Classification for the Lactobacillus casei Group;Chien-Hsun Huang等;Front Microbiol;1974 *
不同干酪乳杆菌菌株对α-葡萄糖苷酶抑制作用的比较;范文娅;吴正钧;季红;郭本恒;;食品与发酵工业(第04期);29-33 *
益生菌对2型糖尿病小鼠的调节作用;白璐;张喆;梁曦;吕优优;周慧;张峻雪;易华西;刘同杰;公丕民;冯丽荣;冷友斌;张兰威;;食品工业科技(19);345-352 *

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