CN114668151B - 一种乳双歧杆菌sf-b21在制备降尿酸产品中的应用 - Google Patents

一种乳双歧杆菌sf-b21在制备降尿酸产品中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及微生物技术领域，具体涉及一种乳双歧杆菌SF‑B21在制备降尿酸产品中的应用，该乳双歧杆菌（Bifidobacterium lactis）SF‑B21保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.23474，保藏日期为2021年9月23日，保藏机构地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。本发明提供的乳双歧杆菌SF‑B21具有高粘附性、强肠胃适应能力，同时本发明制得以乳双歧杆菌SF‑B21为益生菌的固体饮料，可有效降低人体中尿酸的含量，改善尿酸指标，具有预防和治疗高尿酸疾病的功能。

Description

一种乳双歧杆菌SF-B21在制备降尿酸产品中的应用
技术领域
本发明涉及微生物技术领域，具体涉及一种乳双歧杆菌SF-B21在制备降尿酸产品中的应用。
背景技术
高尿酸是人体内有一种叫做嘌呤的物质因代谢发生紊乱，致使血液中尿酸增多而引起的一种代谢性疾病，体内尿酸每日的生成量和排泄量大约是相等，生成量方面，三分之一是由食物而来，三分之二是体内自行合成，排泄途径则是三分之一由肠道排出，三分之二从肾脏排泄。生成和排泄无论哪一方面出问题，都会造成尿酸升高。尿酸上升，因为它会阻碍血液分泌尿酸的过程，使尿酸无法排出。尿酸过高，也会引发其他疾病。高尿酸血症它的影响确实是也是多种多样的，大家最熟悉的是表现在关节的，高尿酸血症患痛风的概率增加，另外长期的高尿酸血症也会出现肾脏的问题，肾衰、尿毒症也是可以出现的，另外它本身和高血压、高血糖、高血脂也是相互协同和促进的。
随着生活水平的提高和饮食结构的改变，多嘌呤食物肉类、蛋类、海鲜等摄入量升高，导致体内嘌呤含量升高，尿酸增多的概率增加；成为继“高血压、高血脂、高血糖”之后的第四高，危害我们的健康。近十几年来，过去比较少见的痛风患者多了起来，不仅是中老年人发病，而且还出现了年轻化的趋势，成了一种常见病。因此发明一种可以降尿酸的产品是非常必要的。
发明内容
针对现有技术高尿酸危害健康的问题，本发明提供乳双歧杆菌SF-B21在制备降尿酸产品中的应用，可有效降低人体中尿酸的含量，改善尿酸指标，具有预防和治疗高尿酸疾病的作用。
本发明提供一种乳双歧杆菌SF-B21在制备降尿酸产品中的应用，该乳双歧杆菌（Bifidobacterium lactis）SF-B21保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.23474，保藏日期为2021年9月23日，保藏机构地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。该乳双歧杆菌（Bifidobacteriumlactis）SF-B21记载于申请人在先专利申请文件（公开号CN114196603A）中。
进一步的，降尿酸产品为固体饮料。
进一步的，乳双歧杆菌SF-B21的培养方法为，将乳双歧杆菌SF-B21接种到乳双歧杆菌液体培养基中，接种量为2％，在37℃下厌氧培养后，得乳双歧杆菌SF-B21培养液。
进一步的，乳双歧杆菌液体培养基包括以下组分：蛋白胨15g，牛肉粉5g，酵母浸粉5g，K2HPO4·7H2O 2.04g，L-半胱氨酸盐酸盐0.5g，葡萄糖15g，CH3COONa·3H2O 5g，NaCl5.08g，CaCl2 0.01g，MgSO4·7H2O 0.2g，MnSO4·4H2O 0.05g，吐温80 1mL，蒸馏水1000mL。
进一步的，固体饮料的制备方法，包括如下步骤：
（1）将乳双歧杆菌SF-B21接种到乳双歧杆菌液体培养基中，接种量为2％，在37℃下厌氧培养后，对乳双歧杆菌液进行离心、真空冷冻干燥处理，获得乳双歧杆菌菌粉；
（2）将乳双歧杆菌菌粉与辅料按配比混合后即得固体饮料。
进一步的，辅料为薏苡仁粉、葛根粉、茯苓粉、蔓越莓粉、低聚果糖和麦芽糊精粉。
进一步的，固体饮料包括如下重量份数的原料：乳双歧杆菌菌粉2份、薏苡仁粉1份、葛根粉1份、茯苓粉2份、蔓越莓粉24份、低聚果糖50份、麦芽糊精粉20份。
进一步的，固体饮料中活菌数为1×108CFU/g。
本发明的有益效果在于，本发明提供的乳双歧杆菌SF-B21具有高粘附性、强肠胃适应能力，同时本发明制得以乳双歧杆菌SF-B21为益生菌的固体饮料，可有效降低人体中尿酸的含量，改善尿酸指标，具有预防和治疗高尿酸疾病的功能。
具体实施方式
为了使本技术领域的人员更好地理解本发明中的技术方案，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明保护的范围。
下述实施例使用的乳双歧杆菌液体培养基包括以下组分：
蛋白胨15g，牛肉粉5g，酵母浸粉5g，K2HPO4·7H2O 2.04g，L-半胱氨酸盐酸盐0.5g，葡萄糖15g，CH3COONa·3H2O 5g，NaCl 5.08g，CaCl20.01g，MgSO4·7H2O 0.2g，MnSO4·4H2O0.05g，吐温80 1mL，蒸馏水1000mL。
下述实施例使用的乳双歧杆菌固体平板培养基包括以下组分：
蛋白胨15g，牛肉粉5g，酵母浸粉5g，K2HPO4·7H2O 2.04g，L-半胱氨酸盐酸盐0.5g，葡萄糖20g，CH3COONa·3H2O 5g，NaCl 5.08g，CaCl20.01g，MgSO4·7H2O 0.2g，MnSO4·4H2O0.05g，吐温80 1mL，琼脂5g，蒸馏水1000mL。
实施例1 乳双歧杆菌SF-B21的分离和鉴定
1、菌源
酸奶；采集时间为2021年1月，采集地点为青海省西宁市。
2、菌株的分离
对酸奶样品做十倍梯度稀释，每个梯度取100μL均匀涂布于乳双歧杆菌固体平板培养基上，随后取出置于厌氧罐中，37℃厌氧培养过夜；
次日可见平板上长有形态大小各异的菌落，挑取若干乳酸菌的特征菌落作二代划线纯化处理，平板厌氧活化1天，得培养物，随后做菌株鉴定。
3、乳双歧杆菌SF-B21的鉴定
(1)鉴定单位
生工生物工程（上海）股份有限公司。
(2)引物序列
27F：5'-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3'；
1492R：5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'。
(3)鉴定的序列
CCACCGGCTTCGGGTGCTACCCACTTTCATGACTTGACGGGCGGTGTGTACAAGGCCCGGGAACGCATTCACCGCGGCGTTGCTGATCCGCGATTACTAGCGACTCCGCCTTCACGCAGTCGAGTTGCAGACTGCGATCCGAACTGAGACCGGTTTTCAGCGATCCGCCCCACGTCACCGTGTCGCACCGCGTTGTACCGGCCATTGTAGCATGCGTGAAGCCCTGGACGTAAGGGGCATGATGATCTGACGTCATCCCCACCTTCCTCCGAGTTGACCCCGGCGGTCCCACATGAGTTCCCGGCATCACCCGCTGGCAACATGCGGCGAGGGTTGCGCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACATCTCACGACACGAGCTGACGACGACCATGCACCACCTGTGAACCGGCCCCGAAGGGAAACCGTGTCTCCACGGCGATCCGGCACATGTCAAGCCCAGGTAAGGTTCTTCGCGTTGCATCGAATTAATCCGCATGCTCCGCCGCTTGTGCGGGCCCCCGTCAATTTCTTTGAGTTTTAGCCTTGCGGCCGTACTCCCCAGGCGGGATGCTTAACGCGTTGGCTCCGACACGGGACCCGTGGAAAGGGCCCCACATCCAGCATCCACCGTTTACGGCGTGGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTTCGCTCCCCACGCTTTCGCTCCTCAGCGTCAGTGACGGCCCAGAGACCTGCCTTCGCCATTGGTGTTCTTCCCGATATCTACACATTCCACCGTTACACCGGGAATTCCAGTCTCCCCTACCGCACTCCAGCCCGCCCGTACCCGGCGCAGATCCACCGTTAGGCGATGGACTTTCACACCGGACGCGACGAACCGCCTACGAGCCCTTTACGCCCAATAAATCCGGATAACGCTCGCACCCTACGTATTACCGCGGCTGCTGGCACGTAGTTAGCCGGTGCTTATTCGAACAATCCACTCAACACGGCCGAAACCGTGCCTTGCCCTTGAACAAAAGCGGTTTACAACCCGAAGGCCTCCATCCCGCACGCGGCGTCGCTGCATCAGGCTTGCGCCCATTGTGCAATATTCCCCACTGCTGCCTCCCGTAGGAGTCTGGGCCGTATCTCAGTCCCAATGTGGCCGGTCACCCTCTCAGGCCGGCTACCCGTCAACGCCTTGGTGGGCCATCACCCCGCCAACAAGCTGATAGGACGCGACCCCATCCCATGCCGCAAAAGCATTTCCCACCCCACCATGCGATGGAGCGGAGCATCCGGTATTACCACCCGTTTCCAGGAGCTATTCCGGTGCACAGGGCAGGTTGGTCACGCATTACTCACCCGTTCGCCACTCT。
(4)鉴定结果
该菌株被鉴定为Bifidobacterium（双歧杆菌属），推测为Bifidobacteriumanimalis subsp. lactis（动物双歧杆菌乳亚种）。
测试例1 乳双歧杆菌SF-B21的粘附特性测试
将乳双歧杆菌SF-B21按1%的接种量接种于乳双歧杆菌液体培养基中37℃厌氧培养14h，发酵菌液以8000r/min离心15分钟，除去上清液，收集沉淀的菌体，将菌体和RPMI-1640细胞培养基（购于武安普诺赛生命科技有限公司）混合，得到浓度达到108CFU/mL的菌悬液。将菌悬液加入到24孔细胞培养板中，每孔1mL，将24孔细胞培养板在5%CO2、95%空气的CO2培养箱中37℃培养3小时，吸收出未粘附的菌悬液，用磷酸盐缓冲盐冲洗5次，然后加入含有聚乙二醇辛基苯基醚的磷酸盐缓冲液溶解细胞，加入无菌水溶解。最后进行计数，培养条件为37℃恒温厌氧培养，2天后统计活菌数（GB4789.35方法检测）。
以BB-12、双歧杆菌SF-11（CICC 6165）和双歧杆菌SF-12（CICC 6200）作为对比菌种，其中BB-12为行业内研究比较成熟的双歧杆菌标品，上述菌种均来源于开放的菌种保藏库，能够在市面上购买得到。
由表1可以看出，0.28%是较理想指标，结果表明，本发明的乳双歧杆菌SF-B21粘附力有明显优势。
表1 细菌粘附特性测试结果
Figure DEST_PATH_IMAGE001
测试例2乳双歧杆菌SF-B21的胃肠道适应性测试
（1）模拟胃液的配置：将胃蛋白酶溶于灭菌的生理盐水（0.9%w/v，pH值为3.0），使胃蛋白酶终浓度为3g/L，以0.22μm无菌滤膜过滤，现配现用；
（2）模拟肠液的配置：将胰蛋白酶溶于灭菌的生理盐水（0.9%w/v，pH值为8.0），使胰蛋白酶终浓度为1g/L，并加入胆盐使胆盐终浓度为0.3%，以0.22μm无菌滤膜过滤，现配现用；
（3）分别将双歧杆菌SF-11、双歧杆菌SF-12和乳双歧杆菌SF-B21连续活化三代（每代18h），测定连续活化三代的菌株在A600下的OD值，通过计算求出OD5所需的菌液量；
（4）将OD5的菌液以8000G离心10min，弃上清，重悬于1mL模拟胃液中，37℃培养3h后进行平板活菌计数；
（5）取模拟胃液处理后的菌液8000G离心10min，弃上清，重悬于等体积的模拟肠液中，37℃培养4h后进行平板活菌计数。
按照如下公式计算各菌株的耐受胃肠液后的存活率，分析各菌株的胃肠道适应能力。
耐受胃肠液后的存活率（%）＝（耐受模拟肠液后菌液中的活菌数/菌液中的原始活菌数）×100%。
结果如下表2所示，可以看出，本发明乳双歧杆菌SF-B21较其他双歧杆菌胃肠适应能力强。
表2乳双歧杆菌SF-B21胃肠道适应性测试
Figure 177593DEST_PATH_IMAGE002
实施例2
一种使用乳双歧杆菌SF-B21制备固体饮料的方法，包括如下步骤：
（1）将乳双歧杆菌SF-B21接种到乳双歧杆菌液体培养基中，接种量为2％，在37℃下厌氧培养后，对乳双歧杆菌液进行离心、真空冷冻干燥处理，获得乳双歧杆菌菌粉；
（2）将乳双歧杆菌菌粉2份、薏苡仁粉1份、葛根粉1份、茯苓粉2份、蔓越莓粉24份、低聚果糖50份、麦芽糊精粉20份混合后即得固体饮料，所得固体饮料中含乳双歧杆菌益生菌活菌数为1×108CFU/g。
试验例1
实验动物：雄性SD大鼠，21日龄；100-110克，购于潍坊实验动物中心。
实验动物饲养条件：室温21℃，光照12小时，饲料专用鼠粮；水为蒸馏水。
实验内容：
实验分组：将SD大鼠随机分为对照组（15只）和实验组（50只）；实验组大鼠每天灌胃氧嗪酸钾（2克/千克），7天后腹腔注射3%戊巴比妥钠（30毫克/千克）麻醉，眼眶后静脉丛取血，4℃、3000rpm离心15分钟取上清测定尿酸含量，对照组大鼠灌胃等体积的蒸馏水。将尿酸含量>110μM/L的大鼠，确定为造模成功。造模成功的大鼠随机分为模型组，阳性对照的别嘌呤醇组，含乳双歧杆菌SF-B21的固体饮料组，每组15只，别嘌呤醇组、固体饮料组分别喂养别嘌呤醇（25毫克/千克）、含乳双歧杆菌SF-B21的固体饮料固体饮料（50毫克/千克），模型组大鼠灌胃等体积的蒸馏水；连续处理30天。在处理的第15、30天，腹腔注射3%戊巴比妥钠（30毫克/千克）麻醉，眼眶后静脉丛取血，4℃、3000rpm离心15分钟取上清测定尿酸含量。血清尿酸含量测定严格按照尿酸检测试剂盒（南京建成生物工程研究所）说明书进行操作和测定。
各实验组大鼠血清尿酸水平见表3，表3中，不同的字母表示同一检时间测组间具有显著性差异P<0.05；相同的字母表示组间没有显著性差异P>0.05。
表3 各实验组大鼠血清尿酸水平
Figure DEST_PATH_IMAGE003
由表3可知，在造模后，模型组、别嘌呤醇组和固体饮料组的大鼠血清尿酸水平要显著高于对照组（n=15,P<0.05），但是三组的大鼠血清尿酸水平无显著性差异（n=15，P>0.05）。在给药15天、30天，别嘌呤醇组和固体饮料组的尿酸含量显著低于模型组（n=15，P<0.05）；说明乳双歧杆菌SF-B21固体饮料能够显著降低高尿酸血症大鼠的血清尿酸水平。
试验例2
5.1研究对象
选择慢性肾病高尿酸患者共120例，选择标准：年龄18-65岁，性别不限，血清检测肾小球滤过率≤59[ml/(min*1.73m2)]，血尿酸≥420mmol/L；排除标准：(1)接受升高尿酸的药物(利尿剂除外)治疗；(2)原发性尿酸代谢性疾病、常染色体显性遗传多囊肾病等患者；(3)有症状的高尿酸、痛风、怀孕及哺乳期妇女等。
5.2试验设计
按比例分入试验组和对照组，每组60例。试验组在常规药物治疗的基础上加用实施例4的固体饮料，对照组服用常规药物治疗，均连续服用6个月。
5.3试验指标
5.3.1血液和尿液检查
分别检测治疗0、3、6个月的血清肌酐、血尿素氮、血尿酸、C-反应蛋白、血清白蛋白、碱性磷酸酶、24 h尿蛋白、尿液中性粒细胞明胶酶相关载脂蛋白（UNGAL)。采用慢性肾脏病流行病学合作组(CKnEPI)公式计算eGFR。参照1996年国家中医药管理局发布的《中医病症诊断疗效标准》判定降血尿酸疗效，血尿酸较治疗前降幅≥25％为显效，血尿酸较治疗前降幅≥15％为有效，血尿酸较治疗前降幅<15％为无效。
5.3.2中医症候积分记录
记录治疗前、后的中医症候积分，主要观察患者的疲倦乏力、头晕耳鸣、舌质暗、恶心呕吐、纳呆腹胀、舌苔黄腻症状，每个项目根据病情严重程度评为0、2、4、6分，评分越高表示病情越重，随访期为6个月。
5.3.3数据处理
使用SPSS 22．0统计学软件包处理数据，用独立样本t检验；组间比较采用χ2检验。P<0.05具有统计学差异。
5.4实验结果：
5.4.1两组患者观察指标的比较
治疗前，两组患者的肾小球滤过率、血清肌酐、血尿素氮、尿酸、尿蛋白、血清白蛋白、碱性磷酸酶、C-反应蛋白和UNGAL差异均无统计学意义(P>0.05)；进行降尿酸治疗6个月后，两组患者的上述指标差异仍无统计学意义。观察组治疗6个月与治疗前比较，肾小球滤过率上升，血尿素氮、尿酸和尿蛋白均有所下降，差异有统计学意义(P<0.05)；血清肌酐、血清白蛋白、碱性磷酸酶、UNGAL和C-反应蛋白差异均无统计学意义(P>0.05)。 具体结果见表4。
表4 两组患者降尿酸治疗前、后检测指标的比较
Figure 235679DEST_PATH_IMAGE004
试验组降尿酸治疗无效1例(1.7％)，有效3例(5.0％)，显效56例(93.3％)；对照组降尿酸治疗无效5例(8.3％)，有效5例(8.％)，显效50例(83.3％)。但两组患者的降尿酸效果组间比较，差异无统计学意义(P=0.189)。
两组患者中医症候评分比较见表5。
表5 两组患者中医症候评分的比较
Figure DEST_PATH_IMAGE005
表5中，试验组和对照组患者治疗前的中医症候评分差异无统计学意义[(26.5±2.5)分和(26.6±2.4分，P>0.05]，治疗后试验组组患者的中医症候评分显著低于对照组[(20.7±2.3)分和(23.5±2.5)分，P<0.05]，差异具有统计学意义。
本试验显示，试验组治疗6个月后，肾小球滤过率上升，血尿素氮、尿酸、尿蛋白均有所下降，表明乳双歧杆菌SF-B21固体饮料结合常规药物治疗可以有效降低尿酸，同时降低尿蛋白，延缓肾脏损伤的进展。试验还发现，与单纯常规药物治疗相比，添加乳双歧杆菌SF-B21固体饮料后可以明显降低中医症候积分，改善患者临床症状。
尽管通过优选实施例的方式对本发明进行了详细描述，但本发明并不限于此。在不脱离本发明的精神和实质的前提下，本领域普通技术人员可以对本发明的实施例进行各种等效的修改或替换，而这些修改或替换都应在本发明的涵盖范围内/任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 山东向日葵生物工程有限公司
上海蔚健生物科技有限公司
<120> 一种乳双歧杆菌SF-B21在制备降尿酸产品中的应用
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1341
<212> DNA
<213> 乳双歧杆菌(Bifidobacterium lactis)
<400> 1
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cctaccgcac tccagcccgc ccgtacccgg cgcagatcca ccgttaggcg atggactttc 840
acaccggacg cgacgaaccg cctacgagcc ctttacgccc aataaatccg gataacgctc 900
gcaccctacg tattaccgcg gctgctggca cgtagttagc cggtgcttat tcgaacaatc 960
cactcaacac ggccgaaacc gtgccttgcc cttgaacaaa agcggtttac aacccgaagg 1020
cctccatccc gcacgcggcg tcgctgcatc aggcttgcgc ccattgtgca atattcccca 1080
ctgctgcctc ccgtaggagt ctgggccgta tctcagtccc aatgtggccg gtcaccctct 1140
caggccggct acccgtcaac gccttggtgg gccatcaccc cgccaacaag ctgataggac 1200
gcgaccccat cccatgccgc aaaagcattt cccaccccac catgcgatgg agcggagcat 1260
ccggtattac cacccgtttc caggagctat tccggtgcac agggcaggtt ggtcacgcat 1320
tactcacccg ttcgccactc t 1341
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
agagtttgat cmtggctcag 20
<210> 3
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
ggttaccttg ttacgactt 19

Claims (3)

1.一种乳双歧杆菌SF-B21在制备降尿酸产品中的应用，其特征在于，该乳双歧杆菌（Bifidobacterium lactis）SF-B21保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.23474，保藏日期为2021年9月23日，保藏机构地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，乳双歧杆菌SF-B21的培养方法为，将乳双歧杆菌SF-B21接种到乳双歧杆菌液体培养基中，接种量为2％，在37℃下厌氧培养后，得乳双歧杆菌SF-B21培养液。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，乳双歧杆菌液体培养基包括以下组分：蛋白胨15g，牛肉粉5g，酵母浸粉5g，K2HPO4·7H2O 2.04g，L-半胱氨酸盐酸盐0.5g，葡萄糖15g，CH3COONa·3H2O 5g，NaCl 5.08g，CaCl2 0.01g，MgSO4·7H2O 0.2g，MnSO4·4H2O 0.05g，吐温80 1mL，蒸馏水1000mL。
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