CN101606952B

CN101606952B - 乳双歧杆菌在制备预防泌尿系统结石药物中的应用

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Publication number: CN101606952B
Application number: CN200810039047A
Authority: CN
Inventors: 张士青; 赵树田; 顾欣; 李建涛
Original assignee: THIRD AFFILIATED PEOPLE'S HOSITAL OF SHANGHAIJIAO TONG UNIVERSITY SCHOOL OF MEDICINE
Current assignee: THIRD AFFILIATED PEOPLE'S HOSITAL OF SHANGHAIJIAO TONG UNIVERSITY SCHOOL OF MEDICINE
Priority date: 2008-06-17
Filing date: 2008-06-17
Publication date: 2012-09-19
Anticipated expiration: 2028-06-17
Also published as: CN101606952A

Abstract

本发明涉及乳双歧杆菌应用。本发明的技术方案如下：乳双歧杆菌在预防泌尿系统结石中应用。其中乳双歧杆菌和可食用菌、益生元或可以接受的载体的组合物在预防泌尿系统结石中应用。其优点表现在：对乳双歧杆菌发掘了新的医疗用途，开拓了一个新的应用领域。乳双歧杆菌安全无毒，药理作用强，预示着很好的药用前景。为临床提供一种非常适合患者长期服食的尿结石预防良品。

Description

乳双歧杆菌在制备预防泌尿系统结石药物中的应用

技术领域

本发明涉及乳双歧杆菌应用，更具体地说，本发明涉及乳双歧杆菌在预防泌尿系统结石中的应用。

背景技术

尿石症是长期以来威胁人类健康的泌尿系统常见病之一，其中草酸钙结石占70％～80％，且有较高的复发率。因此其预防显得尤为重要。

草酸对尿液中草酸钙过饱和程度的影响力比钙大23倍，因此，高草酸尿是草酸钙结石形成的重要危险因素。新的研究发现，50％～80％的尿草酸来源于饮食，肠道吸收草酸的量是影响尿草酸排泄量的重要因素。若能降低肠道草酸的吸收量，其方法不失为预防草酸钙尿结石形成和复发的良策。近来发现，脊椎动物(包括人)的肠道中常驻有一些能分解草酸的细菌，如嗜草酸杆菌、乳酸菌、雷氏普罗威登斯菌、粪肠球菌和迟缓真杆菌等，这些细菌能不同程度地降解肠道中的草酸，使肠道的草酸吸收量降低，尿草酸排泄量减少，具有预防草酸钙肾结石发生和复发的功效。但这些草酸分解菌除了乳酸菌外，都无商品化供应。

益生菌是指经口或其它消化道入口途径摄入，通过改善粘膜表面微生物或酶的平衡、刺激特异性或非特异性免疫机制而发挥作用的微生物制剂。益生菌进入动物消化道后，通过改善消化道菌群及酶的平衡，迅速提高机体的抗病能力、代谢能力和对食物的消化吸收能力，达到防治消化道疾病和促进生长的双重作用。常见益生菌主要指两大类乳酸菌群：一类为双歧杆菌，该类乳酸菌为全球公认有益菌，尚未有不利于人体的报道出现。常见的有婴儿双歧杆菌、长双歧杆菌、短双歧杆菌、青春双歧杆菌等；另一类为乳杆菌，如嗜酸乳杆菌、干酪乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、植物乳杆菌和罗伊氏乳杆菌等。其中较新型的两个菌种为植物乳杆菌和罗伊氏乳杆菌。

益生元是指能够选择性地刺激肠内一种或几种有益菌生长繁殖，而且不被宿主消化的物质。益生元应具备以下四个条件：(1)在胃肠道的上部既不能水解，也不能被宿主吸收。(2)只能选择性对肠内有益菌(双歧杆菌等)有刺激生长繁殖或激活代谢功能的作用。(3)能够提高肠内有益于健康的优势菌群的构成和数量。(4)能起到增强宿主机体健康的作用。常见的益生元有：低聚果糖、大豆低聚糖、异麦芽低聚糖、低聚乳果糖、低聚半乳糖、低聚甘露糖、低聚龙胆糖、低聚木糖等。

中国专利文献CN101040638公开了一种具有减肥功效的绿茶酸奶饮料，其乳酸菌令牛奶中的乳糖转化而令人体容易吸收，并且有益于肠道有益菌群的繁殖，丰富的钙质补充人体每日所需，在餐前饮用令胃部有饱腹感，既可以达到节食效果，还不会营养失衡。中国专利文献CN1350460公开了一种乳杆菌科的新微生物，特别是乳杆菌属的微生物，它们可用于预防或治疗腹泻。但是，关于乳双歧杆菌在预防泌尿系统结石中应用方面未见报道。

发明内容

本发明的目的在于：

(1)提供乳双歧杆菌在预防泌尿系统结石中应用；

(2)提供乳双歧杆菌与可食用菌、益生元或可以接受的载体的组合物在预防泌尿系统结石中应用。

本发明的技术方案如下：

乳双歧杆菌在预防泌尿系统结石中应用。

其中乳双歧杆菌与可食用菌、益生元或可以接受的载体的组合物在预防泌尿系统结石中应用。所述可食用菌选自：各种双歧杆菌、丁酸梭菌、乳脂明串菌、光和菌、明串珠菌、黑曲霉、米曲霉、凝结芽孢杆菌、酪酸梭状芽孢杆菌、粘连芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、厌氧性拟杆菌、发酵乳杆菌、纤维二糖乳杆菌、弯曲乳杆菌、载耳布吕克氏乳杆菌、乳酸乳杆菌、胚牙乳杆菌、罗特氏乳杆菌、肠系膜明串球菌、乳酸片球菌、脆弱拟杆菌、毛状拟杆菌、瘤胃拟杆菌、猪拟杆菌、约氏乳杆菌、唾液乳杆菌、瑞士乳杆菌、嗜酸乳杆菌、短乳杆菌、保加利亚乳杆菌、克菲尔乳杆菌、干酪乳杆菌、发酵乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、植物乳杆菌、罗伊氏乳杆菌、高加索乳杆菌、啤酒片球菌、戊糖片球菌、费氏丙酸菌、谢曼氏丙酸杆菌、酿酒酵母菌、乳酸链球菌、二乙酰乳酸链球菌、丁二酮乳酸链球菌、棉子糖链球菌、嗜热链球双尾菌、粪链球菌、中(间)链球菌、乳链球菌、嗜热链球菌、乳脂链球菌、酵母菌、食草酸杆菌、雷氏普罗威登斯菌、粪肠球菌或迟缓真杆菌中一种或多种的混合物。可食用菌优选自：嗜酸乳杆菌或保加利亚乳杆菌。所述益生元选自：低聚果糖、大豆低聚糖、异麦芽低聚糖、低聚乳果糖、低聚半乳糖、低聚甘露糖、低聚龙胆糖、低聚壳聚糖、低聚帕拉金糖、低聚木糖、异麦芽糖、乳酮糖、乳蔗糖、水苏糖、棉子糖、多糖(云芝多糖、胡萝含氮多糖)、蛋白质水解物(酪蛋白的水解物、α-乳清蛋白、乳铁蛋白)或多元醇(木糖醇，甘露醇，山梨醇，乳糖醇)中一种或多种的混合物。

本发明所公开乳双歧杆菌在预防泌尿系统结石中的应用，其优点表现在：对乳双歧杆菌发掘了新的医疗用途，开拓了一个新的应用领域。乳双歧杆菌安全无毒，药理作用强，预示着很好的药用前景。乳双歧杆菌制成的酸奶表面比较光滑，呈白色略偏黄色，新鲜、细腻、润滑、稠厚感较强、爽口；有发酵乳的滋气味，酸甜适口，有醋酸味；凝乳均匀，无杂质，仅有少量乳清析出，感官评分达72.4分，酸度达83.8°T，乳酸菌含量为2.61×10⁷/mL。乳双歧杆菌与可食用菌、益生元或可以接受的载体制成的组合物灌喂大鼠期间，各组大鼠的24h尿草酸排泄量都有所减少。为临床提供一种非常适合患者长期服食的尿结石预防良品。

附图说明

图1：含有乳双歧杆菌的发酵剂接种量对酸奶感官品质的影响。

图2：含有乳双歧杆菌和嗜酸乳杆菌的发酵剂接种量对酸奶感官品质的影响。

图3：实验动物分组情况。

图4：各组大鼠在灌喂酸奶期间24h尿草酸排泄量的变化。

图5：大鼠体重变化与24h尿草酸排泄量变化的关系。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步描述。

实施例1

10种可食用乳酸菌体外分解草酸能力实验和在牛奶培养液中的繁殖能力实验

一、材料

(一)实验器材：

1.仪器：5％CO₂培养箱(Forma，3111型)，高压灭菌锅(上海博讯实业有限公司)，称量天平，电炉，SmartSpec^TMPlus分光光度计。

2.Helber细菌计数板(上海易扩仪器有限公司)

3.比浊度测量仪(DENSIMAT，梅立艾公司)

4.器皿：锥形瓶，量筒，吸管，试管(20ml)，移液管，滴管。

5.其他：光学显微镜，擦镜纸，吸水纸。

(二)实验试剂：

1.嗜酸乳杆菌(L.acidophilu KLDS 1.8701s)、副干酪乳杆菌(L.paracasei KLDS 1.0201)、屎肠球菌(Enterococcaceae faecium KLDS6.0302)、乳双歧杆菌(B.lactis KLDS 2.0501)、青春双歧杆菌(B.adolescentis KLDS 2.0003)、婴儿双歧杆菌(B.infantis KLDS 2.0002)、长双歧杆菌(B.longum KLDS 2.0001)、乳酸乳球菌乳脂亚种(Lactococcuslactis subsp.Cremori KLDS4.0315)、保加利亚乳杆菌(L.bulgaricusKLDS 1.0204)、嗜热链球菌(S.thermophilus KLDS 3.0207)的干燥冷冻纯菌种：(东北农业大学乳品科学教育部重点实验室)。

2.草酸铵、葡萄糖、己糖： (分析纯上海化学试剂公司)

3.基础培养液(MRS肉汤)： (上海化学试剂公司提供原材料，自行配置)

4.含草酸的MRS培养液： (上海化学试剂公司提供原材料，自行配置)

5.一水草酸钾： (分析纯上海化学试剂公司)

6.麝香溴酚兰： (上海化学试剂公司提供原材料，自行配置)

7.甲基红指示剂： (上海化学试剂公司提供原材料，自行配置)

8.铬酸钾： (分析纯上海化学试剂公司)

9.美蓝染色液： (上海化学试剂公司提供原材料，自行配置)

二、方法

(一)菌种选择：

可从国内各个菌种保藏中心和实验室购买到的、可用于酸奶制作的乳酸菌。

(二)主要试剂配置：

1.含5mmol/L草酸的MRS培养液：基础培养液与相应的草酸糖溶液按1∶1的体积配置混匀。

各菌种相应的含草酸MRS培养液的配方为：

保加利亚乳杆菌、嗜酸乳杆菌、婴儿双歧杆菌、副干酪乳杆菌、屎肠球菌、乳双歧杆菌、青春双歧杆菌、长双歧杆菌、乳酸乳球菌乳脂亚种：A组草酸糖溶液+MRS肉汤；

嗜热链球菌：B组草酸糖溶液+MRS肉汤。

配置基础培养液(MRS肉汤)：将下列成分混合，调节pH至6.2～6.4，121℃高温下灭菌15min，待冷却后置于4℃冰箱中保存。

酪蛋白胨 10克牛肉膏 10克

酵母膏浸出液 5克 Tween80 1克

磷酸二氢钾 2克己酸钠 5克

柠檬酸三氨 2克 7水硫酸镁 0.5克

硫酸锰 0.5克水 500ml

草酸糖溶液：按照下列的配比溶解各成分，配置好的草酸糖溶液在超净台中用0.46um的滤器过滤灭菌。

A组：草酸铵10mmol/L+葡萄糖40g/L；

B组：草酸铵10mmol/L+葡萄糖40g/L+己糖20g/L；

2.配置草酸测定试剂：

草酸标准液：一水草酸钾1.0231克溶于蒸馏水至100ml(含无水草酸5mg/mL)，将储备液稀释100倍作为应用液，置于4℃冰箱中保存。

麝香溴酚兰指示剂：0.1g麝香溴酚兰+0.05mmol/L NaOH 3.2ml+去离子200ml；或者0.1g麝香溴酚兰溶于20.0ml 100％乙醇中，徐徐加入蒸馏水80ml，不断振荡。

铬酸钾：配制成1.0mmol/L的水溶液。

甲基红指示剂：0.1g甲基红+0.05mmol/L NaOH 7.4ml+去离子水200ml。

(三)实验步骤：

1.复苏干燥冷冻的纯菌种：

操作流程如下：

1)安瓿管开封：用70％酒精棉球擦净安瓿管，用火焰将安瓿管顶端加热，滴无菌水至加热的安瓿管顶端使玻璃开裂，用锉刀或镊子敲下已开裂的安瓿管的顶端。

2)菌株恢复培养：在超净工作台上用无菌吸管吸取0.3～0.5mlMRS灭菌培养液，滴入各纯菌种安瓿中，轻轻震荡使冷冻干菌溶解呈悬浮状。吸取全部细菌悬浮液，移入含MRS培养液的无菌试管中，37℃ 5％CO₂ 培养箱中培养48h。如此反复培养2～3次，使细菌充分活化。

2.调整细菌浓度：

取充分活化的10种菌液各1ml，适当稀释后，用显微镜直接计数法分别进行细菌计数，换算出各菌种活化后的浓度，然后加入适量的无菌生理盐水，使各菌种的细菌浓度调整到3.0×10⁷个/mL左右。

显微镜细菌直接计数法的具体操作如下：

1)配制美蓝染色液：美蓝0.025g，NaCl 0.9g，KCl 0.042g，CaCl₂.6 H₂O 0.048g，NaHCO₃ 0.02g，葡萄糖1g，蒸馏水100ml。

2)制备细菌稀释液：取一管在液体培养液中培养的细菌培养液，充分振荡混匀后，取1ml菌液，用无菌生理盐水将其稀释100倍(稀释倍数视待测菌悬液浓度，一般稀释到每1中格平均有15～20个细菌为宜)。

3)活体染色：取配置的美蓝溶液0.9ml于试管中，再取上述稀释后的菌液0.1ml相混匀，染色10min后进行计数。

4)清洗计数板：先用自来水冲洗，再用95％乙醇棉球轻轻擦洗，最后用吸水纸吸干(切勿在酒精灯上烘烤)，经镜检确证计数板上无污物或粘附的微生物后才可使用。盖玻片也应用擦镜纸擦亮。

5)加菌液：将盖玻片盖在计数室上。将染色后的菌悬液摇匀，用细口滴管吸取少许，从计数板中间平台两侧的沟槽内沿盖玻片的下边缘滴入一小滴，让菌悬液充满计数区，注意计数室内不能有气泡产生，再用镊子轻压盖玻片，以免菌液太多将盖玻片顶起而改变计数室的容积。并用吸水纸吸去沟槽中流出的多余菌悬液。静置片刻，待菌体自然沉降并稳定后，开始计数。

6)计数：将血球计数板置载物台上夹稳，先在低倍镜下找到大方格网的位置(视野宜调暗些)，找到计数室后，将它移至视野中央，再转换高倍镜观察并计数。Helber细菌计数板由25个中格组成的，为了减少误差，所选的中格位置应布点均匀，通常选取除四个角上4个中格及中央的1个中格(即80个小格)。分别计各中格中没有染色的细菌。

7)每个样品重复计数2～3次，求出每一个小格中细胞平均数(N)，按公式计算出每ml菌悬液中含有细胞数＝每个小格中细胞平均数(N)×系数(K)×菌液稀释倍数(d)

3.接种细菌：

准备90支写上标记的20ml无菌试管。将灭菌后的各菌种草酸培养液各取9份，每份9ml，分别加入各自的试管中。将细菌浓度为3.0×10⁷ 个/mL的各菌种菌液各取9份，每份1ml，分别接种在各自相应的培养液中。

4.设空白对照组：

准备9支写上标记的20ml无菌试管。取A组草酸培养液9份，每份9ml，分别加入试管中，每管再各加1ml灭菌去离子水，作为空白对照组。

5.培养前的细菌浓度测定：

从刚接种完细菌并充分振荡混合后的各试管菌液中各取1ml，适当稀释后，用显微镜直接计数法分别进行细菌计数。

6.培养前的草酸浓度测定：

从空白对照组各试管中分别取草酸培育液2ml，3000r/min离心10min后，每份取上清液1ml，用铬酸钾氧化甲基红催化光度法测量培养液中草酸的浓度，作为培养前的草酸浓度。具体操作如下：

铬酸钾氧化甲基红催化光度法测定尿草酸：取三支20.0ml试管，分别作样品管(Au)、标准管(As)和空白管(Ab)。样品管中加入用蒸馏水稀释10倍的混匀草酸培育液0.5ml，标准管中加入草酸标准工作液0.5ml，再各加蒸馏水1.0ml，空白管中加蒸馏水1.5ml，各管加溴麝香草酚蓝指示剂1滴，滴加0.25mmol/L氢氧化钠或0.1mmol/L盐酸使试管液成蓝绿色，总量不超过0.5ml。加饱和硫酸钙2.0ml及95％乙醇至20.0ml，混匀，加盖。于室温放置3小时，以2500r/min离心10min，倾去上清液，倒置于滤纸上吸净残液，加0.4mol/L盐酸2.0ml使沉淀溶解，分别转移至三支10ml的比色管中，各加甲基红2.0ml、1.0mmol/L铬酸钾4.0ml，用水稀释至刻度，摇匀，计时，15min时加1.0mmol/L氧氯化锆溶液1.0ml，摇匀，倒入1cm比色杯，以水作参比，SmartSpec^TM Plus分光光度计在515nm处测吸光度。按下列公式计算草酸培育液中草酸含量：

C(mmol/L)＝(Ab-Au)/(Ab-As)×0.01

7.培养：

将上述培养管置于5％CO₂培养箱中，37℃培养72h。

8.培养后的细菌浓度测定：

培养后的菌液每种取1ml，适当稀释后，用显微镜直接计数法分别直接计数。

9.培养后的草酸含量测定：

将培养72h后的含菌培养液置于沸水中30min灭菌，3000r/min离心10min后，每份取上清液1ml，用铬酸钾氧化甲基红催化光度法测量培养液中草酸的浓度。具体操作同上。

10.10种乳酸菌在牛奶中繁殖能力的测定：

将10种乳酸菌分别等量接种于12％的脱脂乳0中，42℃培养3h，然后置于室温自然冷却0.5h，再置入2℃冷藏箱内培养10h。然后测定牛奶中乳酸菌的数量，计算10种乳酸菌在牛奶中单独培养时的增殖倍数。将4种双歧杆菌分别与嗜酸乳杆菌按照1∶1的比例混合，接种于12％的脱脂乳中，同样条件下培养后，测定牛奶中双歧杆菌的数量，计算嗜酸乳杆菌对4种双歧杆菌在牛奶中增殖能力的影响。

11.统计学处理：

采用SAS软件进行分析，草酸浓度均值用x±s示，乳酸菌均数用 G±s表示，草酸分解率用百分数表示。组间均数比较用单因素方差分析。

三、结果

1.这10种乳酸菌都具有体外分解草酸能力，但差异明显，72h草酸降解率从29.03％～0.23％不等，其中最强为乳双歧杆菌，最弱为屎肠球菌。这10种乳酸菌在含草酸的MRS培养液中培养72h，都有不同程度的增殖，而它们的增殖能力与其草酸降解能力无相关性。

2.这10种乳酸菌在脱脂乳中单独培养72h，都有明显的增殖，从37.11倍～13.90倍不等，其中最强为乳双歧杆菌，最差为青春双歧杆菌；双歧杆菌与嗜酸乳杆菌混合培养于脱脂乳时，嗜酸乳杆菌可促进双歧杆菌的生长，其促生长效果由高到低依次为：长双歧杆菌＞青春双歧杆菌＞乳双歧杆菌＞婴儿双歧杆菌；筛选出的草酸降解能力和在脱脂乳中生长能力俱佳的最优菌种为乳双歧杆菌。

实施例2

用乳双歧杆菌制作预防尿结石的酸奶及测试

一、材料

(一)实验器材：

1.仪器：水浴锅、冰箱、5％CO₂培养箱、称量天平、高压灭菌锅、搅拌器、电炉。

2.器皿：锥形瓶，量筒，吸管，试管，移液管，滴管。

3.Helber细菌计数板：上海易扩仪器有限公司提供。

4.其他：光学显微镜，擦镜纸，吸水纸、150目纱布等。

(二)实验试剂：

乳双歧杆菌干燥冷冻纯菌种：(东北农业大学乳品科学教育部重点实验室)

1.脱脂乳： (光明牌脱脂奶粉，超市购买)

2. 绵白糖： (超市购买，符合GB317《白砂糖》)

3.酚酞、NaOH等： (分析纯上海化学试剂公司)

二、方法

1.酸奶的制作和理化指标测定：

1)菌种的活化：

先将装乳双歧杆菌种试管口用火焰彻底杀菌，然后打开棉塞，用灭菌吸管从试管底部吸取1～2ml菌液，立即移入预先准备好的灭菌脱脂乳培养液中，于42℃的恒温培养箱中培养，待凝固后，再取出1～2ml，再照上述方法反复2～3移植活化后，用于调制母发酵剂。

2)母发酵剂的制备：

将脱脂乳粉与水混合做成12％复原奶，分装至250ml的三角瓶中，每瓶100ml，105℃灭菌15min，冷却至45℃左右，以无菌方式将充分活化的乳酸菌按4％(v/v)接种量分别接种到含有脱脂乳的三角瓶中，混匀后，于42℃的恒温培养箱中培养发酵至凝固，凝固后，再反复接种2～3次，使乳酸菌保持一定的活力。置于6℃冰箱保存。

3)生产发酵剂的制备：

将脱脂乳粉与水混合做成12％复原奶，向其中添加8％蔗糖，搅拌溶解后，分装至250ml的三角瓶中，每瓶100ml。90℃5min灭菌，冷却至45℃左右，按4％接种量(v/v)接种上述母发酵剂，于42℃的恒温培养箱中培养至凝乳。置于6℃冰箱保存。

4)制作酸奶：

将脱脂乳粉与水混合做成2L复原奶后，150目纱布过滤。然后加入8％的蔗糖，搅拌溶解后，150目纱布过滤，等量分装在4个1L的灭菌平底烧瓶中，90℃灭菌5min，冷却到42℃后，按2％、3％、4％和5％接种量(v/v)分别接种上述生产发酵剂。在接种的过程中，原料乳始终保持搅拌状态。每种接种浓度的牛奶经过充分搅拌后，迅速连续地灌入10只容量为100ml的清洁灭菌葡萄糖液体瓶中，每瓶装50ml，于42℃发酵3h。冷却，置于4℃储存。

5)酸度的测定：

酸碱滴定法：吸取样品10ml置于100ml三角烧瓶中，加入20ml的蒸馏水，再加入0.5％酚酞指示剂2～3滴，摇匀，用0.1mol/L的NaOH溶液进行滴定，至微红色，在2min内不消失为终点。记录所消耗的NaOH溶液的体积(以ml为单位)。用以下公式计算滴定酸度：

酸度(°T)＝消耗0.1mol/L的NaOH溶液毫升数×100×碱液摩尔浓度

6)感官评定：

取适量自制防石酸奶于50ml烧杯中，在自然光下观察色泽和组织状态，再闻气味，然后用温开水漱口，品尝滋味。由10人分别对口感、滋味气味及组织状态进行评定。

表1酸奶感官评定评分表

7)最佳发酵剂接种量的确定：

将感官评定得分最高的酸奶的发酵剂接种量定为最佳发酵剂接种量。

8)乳酸菌量的测定：

用显微镜直接计数法进行活菌计数。

3.统计学处理：

采用SAS软件进行分析，细菌数量均值用G±s表示。

三、结果

1.发酵剂不同接种量制成的4种酸奶的感官品质：评分值见表2和图1。

表2发酵剂接种量对酸奶感官品质的影响

**：P＜0.01，4％ vs 2％、3％、5％

*：P＜0.05，5％ vs 2％；3％ vs 2％

当接种量为4％时，感官评分最高，且与其他接种量时的感官评分的差异具有极显著统计学意义(P＜0.01)，接种量大于或小于4％都会使酸奶的感官品质下降。因此，发酵剂的最佳接种量为4％。

2.4％接种量制成的酸奶感官品质的评价：表面比较光滑，呈白色略偏黄色，新鲜，感官评分达72.4分，详见表3。

表3感官评定评分结果

3.4％接种量制成的酸奶的酸度检测结果：酸度83.8°T，基本与国家标准(GB2746)的要求相符合。

4.4％接种量制成的酸奶的微生物指标检测结果：乳酸菌总量约为2.61×10⁷个/mL，达到国家标准的要求。

实施例3

用乳双歧杆菌和嗜酸乳杆菌制作预防尿结石的酸奶及测试

一、材料同实施例2中材料。其中嗜酸乳杆菌干燥冷冻纯菌种： (东北农业大学乳品科学教育部重点实验室)

二、方法同实施例2中方法。其中菌种的复活：装乳双歧杆菌和嗜酸乳杆菌试管中，乳双歧杆菌为2ml，嗜酸乳杆菌2ml。

三、结果

1.发酵剂不同接种量制成的4种酸奶的感官品质：评分值见表4和图2。

表4发酵剂接种量对酸奶感官品质的影响

**：P＜0.01，3％ vs 2％

*：P＜0.05，4％vs 2％、3％、5％；5％vs 2％

2.4％接种量制成的酸奶感官品质的评价：表面比较光滑，呈白色略偏黄色，新鲜，感官评分达73.7分，详见表5。

表5感官评定评分结果

3.4％接种量制成的酸奶的酸度检测结果：酸度81.2°T，基本与国家标准(GB2746)的要求相符合。

4.4％接种量制成的酸奶的微生物指标检测结果：乳酸菌总量约为3.49×10⁷个/mL，完全达到国家标准的要求。

实施例4

用乳双歧杆菌制作防石酸奶与市售酸奶体外分解草酸能力的比较

一、材料

(一)实验器材：

1.灭菌平板，5％CO₂培养箱，高压灭菌锅，称量天平，电炉，锥形瓶，吸管。

2.721分光光度计：(厦门分析仪器厂)

3.Helber细菌计数板：上海易扩仪器有限公司

(二)实验试剂：

1.市售酸奶：出厂第二天的180g装的塑罐装味全牌酸奶，超市购买，4℃冰箱中储存，在7天储存期内使用。

2.自制防石酸奶： (实施例2按4％接种量制成的酸奶)

3.草酸铵、葡萄糖、已糖： (分析纯上海化学试剂公司)

4.一水草酸钾： (分析纯上海化学试剂公司)

5.麝香溴酚兰： (上海化学试剂公司提供原材料，自行配置)

6.甲基红指示剂 (上海化学试剂公司提供原材料，自行配置)

7.铬酸钾： (分析纯上海化学试剂公司)

二、方法

1.灭菌奶的灭菌方法：出厂第二天的塑罐装味全牌酸奶和制成第二天的防石酸奶，105℃灭菌15min，4℃冰箱中储存，在7天储存期内使用。

2.配置10mmol/L的草酸糖溶液：草酸铵10mmol/L+葡萄糖40g/L。配制好的草酸糖溶液在超净台用0.46um的滤器过滤灭菌。

3.取45支20ml的灭菌试管，分成5组，分别为活菌防石酸奶组、活菌味全牌酸奶组、灭菌防石酸奶组、灭菌味全牌酸奶组和空白对照组，每组9支，在无菌操作台中，分别向各组的试管中加入相应的活菌防石酸奶、活菌味全牌酸奶、灭菌防石酸奶、灭菌味全牌酸奶和无菌生理盐水，每支试管5ml。

4.在无菌操作台上，向上述试管中各加无菌10mmol/L的草酸糖溶液5ml，混匀，再向各试管中滴加2～3ml的灭菌石蜡油，加盖无菌胶塞。

5.培养前细菌计数：从活菌味全牌酸奶组和活菌防石酸奶组的各试管中分别取液体1ml，适当稀释后，用显微镜直接计数法计数细菌，作为培养前的细菌浓度。

6.培养前草酸含量测定：从空白对照组各试管中分别取液体2ml，3000r/min离心10min后，每份取上清液1ml，用铬酸钾氧化甲基红催化光度法测量培养液中草酸的浓度，作为培养前的草酸浓度。

7.培养：将上述各试管置于5％CO₂培养箱中，37℃培养3天。

8.培养后草酸含量测定：将培养72h后的各试管置于沸水中30min灭菌，3000r/min离心10min后，每份取上清液1ml，用铬酸钾氧化甲基红催化光度法测量培养液中草酸的浓度。

9.统计学处理：采用SAS软件分析，草酸浓度均值用x±s表示，乳酸菌均数用G±s表示，草酸分解率用百分数表示。组间均数比较用单因素方差分析。

三、结果

1.自制防石酸奶与市售酸奶的分解草酸能力：结果见表6。

表6酸奶中草酸浓度在培养前后的变化(x±smmol/L)

*：P＜0.05培养后vs培养前

^#：培养72h后各组草酸浓度差异，P＞0.05

培养后的草酸浓度，五个组之间虽有一定的差异，但是这种差异在统计学上尚未达到显著意义(P＞0.05)。两个活菌酸奶组的草酸含量降幅均超过空白对照组和相应的灭菌对照组，其中活菌防石酸奶组的草酸含量比空白对照组减少0.59mmol/L，比灭菌防石酸奶组减少0.54mmol/L；活菌味全牌酸奶组的草酸含量比空白对照组减少0.28mmol/L，比灭菌味全牌酸奶组减少0.26mmol/L，活菌防石酸奶组的草酸浓度降幅超过活菌味全牌酸奶2.1倍。

实施例5

用乳双歧杆菌和嗜酸乳杆菌制作防石酸奶与市售酸奶体外分解草酸能力的比较

一、材料同实施例4中材料。其中自制防石酸奶：(实施例3按4％接种量制成的酸奶)

二、方法同实施例4中方法。

三、结果

1.自制防石酸奶与市售酸奶的分解草酸能力：结果见表7。

表7酸奶中草酸浓度在培养前后的变化(x±smmol/L)

*：P＜0.05培养后vs培养前

^#：培养72h后各组草酸浓度差异，P＞0.05

培养后的草酸浓度，五个组之间虽有一定的差异，但是这种差异在统计学上尚未达到显著意义(P＞0.05)。两个活菌酸奶组的草酸含量降幅均超过空白对照组和相应的灭菌对照组，其中活菌防石酸奶组的草酸含量比空白对照组减少0.63mmol/L，比灭菌防石酸奶组减少0.59mmol/L；活菌味全牌酸奶组的草酸含量比空白对照组减少0.28mmol/L，比灭菌味全牌酸奶组减少0.26mmol/L，活菌防石酸奶组的草酸浓度降幅超过活菌味全牌酸奶2.25倍。

实施例6

用乳双歧杆菌制作防石酸奶与市售酸奶对大鼠尿草酸排泄量影响的比较

一、材料：

(一)实验动物：选用健康清洁级成年雄性SD大鼠(复旦大学实验动物科学部提供)50只，体重180～200g/只。

(二)实验器材：

1.大鼠代谢笼：(苏州实验器械有限公司)

2.721分光光度计：(厦门分析仪器厂)

3.IVC大鼠饲养笼：(上海绍丰实验动物设备有限公司)

(三)实验试剂：

1.活菌市售酸奶：出厂第2天的180g装的塑罐装味全牌酸奶，超市购买，4℃冰箱中储存，限7天储存期内使用。

2.灭菌市售酸奶：出厂第2天的180g装塑罐装味全牌酸奶，超市购买，105℃高温灭菌15分钟，4℃冰箱中储存，限7天储存期内使用。

3.0.9％生理盐水：(上海市华源长富药业有限公司)

4.自制防石酸奶：(实施例2按4％接种量制成的酸奶)

5.灭菌自制防石酸奶：自制的防石酸奶，121℃高温灭菌15分钟，4℃冰箱中储存，限7天储存期内使用。

二、实验方法：

1.动物分组：选取健康SD雄性大鼠50只，随机分为5组，每组10只。实验动物分组情况见图3。

2.大鼠适应性喂养3天，喂正常鼠饲料，饮自来水。

3.第4天开始灌喂，灌喂物见后面的实验动物分组情况。

4.灌喂前1天、灌喂期内每隔4天用代谢笼分别收集各鼠24h尿液，用浓HCl酸化至pH＝1.0左右，置于冰箱保存。

5.灌喂前1天、灌喂期内每隔4天测大鼠体重的变化。

6.用铬酸钾氧化甲基红催化光度法测定鼠24h尿液草酸排泄量。

7.统计学处理：采用SAS软件进行分析，草酸浓度均值用x±s表示。组间均数比较用单因素方差分析。相关性检验用SAS软件中的相关性检验方法。

三、结果

灌喂期间，各组大鼠的24h尿草酸排泄量都有所上升。其中，三个对照组大鼠尿草酸排泄量走势的组间差异不大，且无统计学意义。防石酸奶灌喂组和味全牌酸奶灌喂组大鼠尿草酸排泄量的上升走势明显弱于三个对照组，其与各自灭菌对照组的差异分别于8天后和12天后具有显著统计学意义；防石酸奶组尿草酸排泄量上升走势明显缓于味全牌酸奶组(图4)，其差异在灌胃第16天后具有显著统计学意义，防石酸奶组大鼠24小时尿草酸排泄量比味全牌酸奶组低15.6％，其尿草酸减排效果比后者提高82.9％。

实施例7

用乳双歧杆菌和嗜酸乳杆菌制作防石酸奶与市售酸奶对大鼠尿草酸

排泄量影响的比较

一、材料同实施例6中材料。其中自制防石酸奶：(实施例3按4％接种量制成的酸奶)

二、方法同实施例6中方法。

三、结果

灌喂期间，各组大鼠的24h尿草酸排泄量都有所上升。其中，三个对照组大鼠尿草酸排泄量走势的组间差异不大，且无统计学意义。防石酸奶灌喂组和味全牌酸奶灌喂组大鼠尿草酸排泄量的上升走势明显弱于三个对照组，其与各自灭菌对照组的差异分别于8天后和12天后具有显著统计学意义；防石酸奶组尿草酸排泄量上升走势明显缓于味全牌酸奶组，其差异在灌胃第16天后具有显著统计学意义，防石酸奶组大鼠24小时尿草酸排泄量比味全牌酸奶组低18.8％，其尿草酸减排效果比后者提高100％(图5) 。

本发明乳双歧杆菌通过口服方式施用于食用者。用于口服时，可将其制成常规的固体制剂如片剂、粉剂、粒剂、胶囊等，制成液体制剂如水或其他液体。

实施例8

片剂：活性成分：乳双歧杆菌冻干粉20mg(10⁹cfu)

乳糖 187mg

玉米淀粉 50mg

硬脂酸镁 3mg

制备方法：将活性成分、乳糖、玉米淀粉混合，用水均匀湿润，把湿润后的混合物过筛，加入硬脂酸镁，然后将混合物压片。

实施例9

乳双歧杆菌冻干粉200mg(10¹⁰cfu)

乳酸饮料(超市购买)50mL

制备方法：将乳双歧杆菌冻干粉溶解于乳酸饮料中，经过充分搅拌后，置于4℃储存。

实施例10

乳双歧杆菌冻干粉200mg(10¹⁰cfu)

低聚果糖(购于江门量子高科生物工程有限公司)1.0g

硬脂酸镁 5mg

制备方法：将乳双歧杆菌、低聚果糖、硬脂酸镁混合后装入硬明胶胶囊中。

实施例11

乳双歧杆菌冻干粉200mg(10¹⁰cfu)

低聚异麦芽糖(购于江门量子高科生物工程有限公司)2.0g

嗜酸乳杆菌冻干粉1mg(购于中国普通微生物保藏管理中心)

硬脂酸镁 8mg

制备方法：将乳双歧杆菌、低聚异麦芽糖、嗜酸乳杆菌、硬脂酸镁混合，过滤，在合适的容器中均匀混合，把得到的混合物装入硬明胶胶囊中。

Claims

1.乳双歧杆菌在制备预防泌尿系统结石药物中的应用，其特征在于，所述乳双歧杆菌为乳双歧杆菌菌株KLDS 2.0501。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述乳双歧杆菌菌株KLDS 2.0501与可食用菌、益生元或可以接受的载体的组合物在制备预防泌尿系统结石药物中的应用。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，可食用菌选自：丁酸梭菌、光和菌、明串珠菌、黑曲霉、米曲霉、凝结芽孢杆菌、酪酸梭状芽孢杆菌、粘连芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、厌氧性拟杆菌、发酵乳杆菌、纤维二糖乳杆菌、弯曲乳杆菌、载耳布吕克氏乳杆菌、乳酸乳杆菌、胚牙乳杆菌、罗特氏乳杆菌、乳酸片球菌、脆弱拟杆菌、毛状拟杆菌、瘤胃拟杆菌、猪拟杆菌、约氏乳杆菌、唾液乳杆菌、瑞士乳杆菌、嗜酸乳杆菌、短乳杆菌、保加利亚乳杆菌、克菲尔乳杆菌、干酪乳杆菌、发酵乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、植物乳杆菌、罗伊氏乳杆菌、高加索乳杆菌、啤酒片球菌、戊糖片球菌、费氏丙酸菌、谢曼氏丙酸杆菌、酿酒酵母菌、二乙酰乳酸链球菌、丁二酮乳酸链球菌、棉子糖链球菌、嗜热链球双尾菌、粪链球菌、中间链球菌、乳链球菌、嗜热链球菌、酵母菌、食草酸杆菌、雷氏普罗威登斯菌、粪肠球菌或迟缓真杆菌中一种或多种的混合物。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，可食用菌选自：嗜酸乳杆菌或保加利亚乳杆菌。

5.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，益生元选自：低聚果糖、大豆低聚糖、异麦芽低聚糖、低聚乳果糖、低聚半乳糖、低聚甘露糖、低聚龙胆糖、低聚壳聚糖、低聚帕拉金糖、低聚木糖、异麦芽糖、乳酮糖、乳蔗糖、水苏糖、棉子糖中一种或多种的混合物。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，益生元选自：低聚果糖或低聚异麦芽糖。