CN115992079A - 一株发酵乳杆菌e1及其在制备降尿酸药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一株发酵乳杆菌E1及其在制备降尿酸药物中的应用，涉及微生物技术领域。所述发酵乳杆菌为发酵乳杆菌E1，于2021年02月01日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.21777，保藏地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号，分类命名为发酵乳杆菌Lactobacillusfermentum。该菌株在高尿酸斑马鱼体内能显著抑制黄嘌呤氧化酶的活性和显著降低尿酸的含量，具备应用于体内调节尿酸水平的潜能，此为利用发酵乳杆菌E1开发预防或治疗高尿酸血症的益生菌制剂提供理论参考和指导依据。

Description

一株发酵乳杆菌E1及其在制备降尿酸药物中的应用

技术领域

本发明涉及微生物技术领域，更具体地说是涉及一株发酵乳杆菌E1及其在制备降尿酸药物中的应用。

背景技术

高尿酸血症是与痛风相关的主要代谢疾病之一，在全世界家呈上升趋势。据估计，目前全球范围内发生的痛风病例超过744万例。中国高尿酸血症患者已达1.7亿，其中约47％患痛风，年增长率为9.7％。尿酸在组织中以尿酸盐的形式积累，被认为是痛风和其他疾病(如心血管疾病、内皮功能障碍和代谢综合征)发展的一个重要危险因素。

长期以来，血浆中尿酸的高水平与高尿酸血症有关。人体内尿酸的积累有两种方式。首先是嘌呤代谢途径中酶缺乏导致的内源性积累。主要嘌呤代谢酶的这种缺乏导致核酸分解和尿酸产生的速率增加，这是在一种机制的控制下进行的，即最终产物通过抑制产生尿酸的酶来控制自身。尿酸积累的另一途径是通过摄入和外源性吸收富含嘌呤的食物。最近的一项研究表明，肉类的摄入会增加21％的痛风风险，而海产品的摄入只会增加7％的痛风风险。

目前，有几种方法被用于治疗高尿酸血症，包括饮食、药物和生物治疗，旨在吸收和降解嘌呤。一个例子是具有代表性的降低尿酸药物别嘌醇，它可以与黄嘌呤氧化酶(XOD)酶竞争性结合，以减少尿酸的产生。非布索坦是另一种新型的XOD非嘌呤选择性抑制剂。这两种药物都广泛用于治疗高尿酸血症，但是这些药物有许多副作用，例如超敏反应综合征、胃肠道反应、肝肾功能损害等，这在一定程度限制了它们的长期应用。饮食干预通过限制高嘌呤食物和酒精的摄入，但由于难以长期坚持饮食限制，可能不如药物有效。微生物作为一种具有成本效益的治疗方法，由于其在体内的副作用最小，已被公众广泛接受。因此，已经发现了几种可以利用嘌呤的乳杆菌菌株，可以有效降低动物体内的尿酸。例如，短乳杆菌DM9218和格氏乳杆菌PA-3降解嘌呤代谢的中间产物以改善高尿酸血症。然而，目前益生菌在预防和/或治疗高尿酸血症中的研究和应用依然较少。同时，当前国际益生菌专利申请集中于美、日、俄传统研发强国，而我国缺乏拥有自主知识产权的功能性菌株。国内生产企业所用益生菌菌种长期依赖进口，而且国外菌株未必适合我国居民胃肠道生理状况。另外，益生菌的功能缺乏有力的科学研究证据，严重影响了益生菌及其制品的推广。基于此，针对菌种资源的功能深入挖掘，筛选出拥有自主知识产权、具有特定功能性质、适合中国人群生理特性的新型益生菌菌株，对提高我国益生菌生产企业的核心竞争力，促进我国益生菌制品发展尤为重要。

因此，提供一株发酵乳杆菌，并将其应用于在制备降尿酸药物中的应用是本领域技术人员亟需解决的问题。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了一株发酵乳杆菌E1，并将其应用于在制备降尿酸药物中的应用。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一株发酵乳杆菌，所述发酵乳杆菌为发酵乳杆菌E1，于2021年02月01日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.21777，保藏地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号，分类命名为发酵乳杆菌Lactobacillusfermentum。

一株发酵乳杆菌在制备降尿酸药物中的应用。

进一步的，所述发酵乳杆菌E1能降低高尿酸斑马鱼体内尿酸含量。

一株发酵乳杆菌在制备抑制黄嘌呤氧化酶活性药物中的应用。

进一步的，所述发酵乳杆菌E1能抑制高尿酸斑马鱼体内黄嘌呤氧化酶的活性。

一种降尿酸药物，包括发酵乳杆菌E1菌悬液。

一种抑制黄嘌呤氧化酶活性药物，包括发酵乳杆菌E1菌悬液。

经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明的有益效果为：

本发明公开提供了一株发酵乳杆菌E1，并提供了发酵乳杆菌E1在制备降尿酸药物中的应用，发酵乳杆菌E1是从广东省梅州市蕉岭县的长寿老人粪便中分离筛选得到的，在高尿酸斑马鱼体内能显著抑制黄嘌呤氧化酶的活性和显著降低尿酸的含量，具备应用于体内调节尿酸水平的潜能，此为利用发酵乳杆菌E1开发预防或治疗高尿酸血症的益生菌制剂提供理论参考和指导依据。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。

图1附图为本发明发酵乳杆菌E1在MRS琼脂平板上的菌落形态；

图2附图为本发明发酵乳杆菌E1对高尿酸斑马鱼体内尿酸含量的影响；

图3附图为本发明发酵乳杆菌E1对高尿酸斑马鱼体内黄嘌呤氧化酶活性的影响。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实验材料来源：氧嗪酸钾、别嘌醇和黄嘌呤钠盐均购自上海源叶生物科技有限公司；尿酸试剂盒购自南京建成生物工程研究所有限公司；S-18KS手持微量电动组织匀浆器购自莱普特科学仪器(北京)有限公司；黄嘌呤氧化酶测定试剂盒购自南京建成生物工程研究所有限公司。发酵乳杆菌11739(ATCC:11739)购自北京百欧博伟生物技术有限公司。

实施例1发酵乳杆菌E1分离、鉴定及保藏

(1)分离：

1)将长寿老人粪便(约0.1g)溶解于装有1mL无菌生理盐水的1.5mL离心管中，用1mL无菌枪头充分吹打混匀，备用。

2)在6个无菌1.5mL离心管中各加入900uL的无菌生理盐水。

3)从第1个装有10^-1样品稀释液的离心管中，吸取100uL的液体加入第2个离心管(10^-2)，稀释到10^-2；

4)从第2个装有10^-2样品稀释液的离心管中，吸取100uL的液体加入第3个离心管(10^-3)，稀释到10^-3；

5)重复上个步骤，一直稀释到10^-4、10^-5、10^-6、10^-7。

6)从装有10^-4样品稀释液的离心管中吸取100uL的样品稀释液涂布在分别接种于MRS固体培养基、BHI固体培养基中上，将100uL的菌液摊平涂干，注意涂布的手法要温和，动作快速，必须在酒精灯火焰附近操作。涂布完成后，在培养皿侧面做好标记，包括姓名、样品编号、培养基名称、培养时间、稀释梯度、培养条件(厌氧/好氧)等信息。

7)重复上个步骤，完成10^-5、10^-6、10^-7稀释梯度的稀释涂布。

8)涂布完成后，将培养皿分别放在37℃、厌氧养条件下进行培养，48h后可进行观察记录。

9)用接种环挑取平板上的单菌落划线至MRS固体培养基中，37℃厌氧培养48h，分离得到纯菌落。

10)将平板上的纯菌落接种于MRS液体培养基中，37℃厌氧培养12～16h，加入20％甘油，置于-80℃冰箱中保存。

(2)菌株的分子生物学鉴定：对所获得的菌株提取基因组DNA，通过PCR技术利用16SrDNA通用引物27F和1492R扩增16SrDNA全长片段，之后进行测序，鉴定菌株的种属。

其中，通用引物27F和1492R的引物序列如下：

27F：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’；SEQ ID NO.1；

1492R：5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’；SEQ ID NO.2。

实验结果：从广东省梅州市蕉岭县长寿老人粪便中筛选出的菌株，经形态观察、16SrDNA鉴定，其中菌株E1被鉴定为发酵乳杆菌，其16SrDNA序列如SEQ ID NO.3所示。

TACCCCACCGACTTTGGGTGTTACAAACTCTCATGGTGTGACGGGCGGTGTGTACAAGGCCCGGGAACGTATTCACCGCGGCATGCTGATCCGCGATTACTAGCGATTCCGACTTCGTGCAGGCGAGTTGCAGCCTGCAGTCCGAACTGAGAACGGTTTTAAGAGATTTGCTTGCCCTCGCGAGTTCGCGACTCGTTGTACCGTCCATTGTAGCACGTGTGTAGCCCAGGTCATAAGGGGCATGATGATCTGACGTCGTCCCCACCTTCCTCCGGTTTGTCACCGGCAGTCTCACTAGAGTGCCCAACTTAATGCTGGCAACTAGTAACAAGGGTTGCGCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACATCTCACGACACGAGCTGACGACGACCATGCACCACCTGTCATTGCGTTCCCGAAGGAAACGCCCTATCTCTAGGGTTGGCGCAAGATGTCAAGACCTGGTAAGGTTCTTCGCGTAGCTTCGAATTAAACCACATGCTCCACCGCTTGTGCGGGCCCCCGTCAATTCCTTTGAGTTTCAACCTTGCGGTCGTACTCCCCAGGCGGAGTGCTTAATGCGTTAGCTCCGGCACTGAAGGGCGGAAACCCTCCAACACCTAGCACTCATCGTTTACGGCATGGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTTCGCTACCCATGCTTTCGAGTCTCAGCGTCAGTTGCAGACCAGGTAGCCGCCTTCGCCACTGGTGTTCTTCCATATATCTACGCATTCCACCGCTACACATGGAGTTCCACTACCCTCTTCTGCACTCAAGTTATCCAGTTTCCGATGCACTTCTCCGGTTAAGCCGAAGGCTTTCACATCAGACTTAGAAAACCGCCTGCACTCTCTTTACGCCCAATAAATCCGGATAACGCTTGCCACCTACGTATTACCGCGGCTGCTGGCACGTAGTTAGCCGTGACTTTCTGGTTAAATACCGTCAACGTATGAACAGTTACTCTCATACGTGTTCTTCTTTAACAACAGAGCTTTACGAGCCGAAACCCTTCTTCACTCACGCGGTGTTGCTCCATCAGGCTTGCGCCCATTGTGGAAGATTCCCTACTGCTGCCTCCCGTAGGAGTATGGGCCGTGTCTCAGTCCCATTGTGGCCGATCAGTCTCTCAACTCGGCTATGCATCATCGCCTTGGTAGGCCGTTACCCCACCAACAAGCTAATGCACCGCAGGTCCATCCAGAAGTGATAGCGAGAAGCCATCTTTTAAGCGTTGTTCATGCGAACAACGCTGTTATGCGGTATTAGCATCTGTTTCCAAATGTTGTCCCCCGCTTCTGGGCAGGTTACCTACGTGTTACTCACCCGTCCGCCACTCGTTGG；SEQ ID NO.3。

菌株E1单菌落接种到MRS固体培养基上，在37℃有氧条件下生长良好，菌落乳白色、边缘整齐，呈球形、表面光滑(图1)。菌株E1已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏日期为2021年02月01日，分类命名为发酵乳杆菌Lactobacillusfermentum，保藏编号为CGMCCNo.21777。

实施例2发酵乳杆菌E1菌悬液(菌体)的制备

将发酵乳杆菌E1活化培养后接种于MRS液体培养基中，37℃培养24h后，4℃，6000r/min离心10min，得到菌体沉淀；菌体沉淀经PBS两次洗涤后，将菌体用PBS重新悬浮，调整细胞浓度为1×10⁴CFU/mL、1×10⁵CFU/mL、1×10⁶CFU/mL，得到菌悬液(菌体)。

对比例1发酵乳杆菌11739菌悬液(菌体)的制备

制备发酵乳杆菌11739菌悬液(菌体)，制备方法同实施例2。

测定发酵乳杆菌E1对高尿酸斑马鱼体内尿酸含量的影响

模型构建：将野生型AB系斑马鱼(5dpf)置于于六孔板中。实验设置正常组、模型组、阳性对照组(别嘌醇)、实施例2菌株干预组(1×10⁴CFU/mL、1×10⁵CFU/mL、1×10⁶CFU/mL发酵乳杆菌E1)，对比例1菌株干预组(1×10⁴CFU/mL、1×10⁵CFU/mL、1×10⁶CFU/mL发酵乳杆菌11739)，每组设置6个复孔，每孔50条鱼，用200μmoL/L氧嗪酸钾与10μmoL/L黄嘌呤钠盐联合处理斑马鱼(5dpf)24h后构建高尿酸模型。

干预：正常组和模型组每孔加入5mLPBS；

阳性对照组每孔加入5mL2mmoL/L别嘌醇溶液；

实施例2菌株干预组：1×10⁴CFU/mL干预组加入1×10⁴CFU/mL发酵乳杆菌E1，1×10⁵CFU/mL干预组加入1×10⁵CFU/mL发酵乳杆菌E1，1×10⁶CFU/mL干预组加入1×10⁶CFU/mL发酵乳杆菌E1，每孔5mL；

对比例1菌株干预组：1×10⁴CFU/mL干预组加入1×10⁴CFU/mL发酵乳杆菌11739，1×10⁵CFU/mL干预组加入1×10⁵CFU/mL发酵乳杆菌11739，1×10⁶CFU/mL干预组加入1×10⁶CFU/mL发酵乳杆菌11739，每孔5mL；

28℃孵育，24h后更换新溶液；孵育48h后收集斑马鱼至1.5mL离心管，每管40条斑马鱼，每个实验组收集6管；将离心管中的水吸干后，加入50μL冰PBS缓冲液，用S-18KS手持微量电动组织匀浆器将斑马鱼匀浆破碎，直至无明显组织碎块，15000×g，4℃离心15min，收集上清液。使用尿酸试剂盒检测各组的尿酸浓度。

采用SPSS19.0软件统计处理数据，实验数据均用

数据表示，用T-检验分析，与正常组相比：^####p<0.001，与模型组相比：^&&&p<0.001；用单因素方差分析,与模型组相比：，**P<0.01，***P<0.005。

结果见图2；由图2可知，与正常组(20.33±2.34μmoL/L)相比，模型组斑马鱼体内的尿酸含量(55.93±3.21μmoL/L)显著增加(P<0.005)，说明本次斑马鱼高尿酸模型建立成功。

由图2可知，阳性对照组(别嘌醇)斑马鱼体内的尿酸含量为29.40±3.61μmoL/L，与模型组(55.93±3.21μmoL/L)相比差异性显著(P<0.005)，因此，别嘌醇具有降尿酸的作用，与临床结果一致。

对比例1发酵乳杆菌11739浓度为1×10⁶CFU/mL时，斑马鱼体内的尿酸含量分别为49.10±2.46μmoL/L，与模型组(55.93±3.21μmoL/L)相比差异性显著(P<0.01)。实施例2发酵乳杆菌E1浓度为1×10⁵CFU/mL和1×10⁶CFU/mL时，斑马鱼体内的尿酸含量分别为40.11±1.73μmoL/L和37.08±3.36μmoL/L，与模型组(55.93±3.21μmoL/L)相比均差异性显著(P<0.005)。因此，上述结果表明，在相同的浓度时，发酵乳杆菌E1对高尿酸斑马鱼体内尿酸降低的作用强于发酵乳杆菌11739，具有预防或治疗高尿酸血症的潜能。

测定发酵乳杆菌E1对高尿酸斑马鱼体内黄嘌呤氧化酶活性的影响取上述各组斑马鱼匀浆离心后的上清液，使用黄嘌呤氧化酶测定试剂盒(南京建成生物工程研究所有限公司)检测各组斑马鱼体内黄嘌呤氧化酶的活性。

采用SPSS19.0软件统计处理数据，实验数据均用

数据表示，用T-检验分析，与正常组相比：^####p<0.001，与模型组相比：^&&&p<0.001；用单因素方差分析,与模型组相比：，**P<0.01，***P<0.005。

结果见图3；由图3可知，与正常组(7.48±1.85U/L)相比，模型组斑马鱼体内的黄嘌呤氧化酶活性(17.48±1.90U/L)显著升高(P<0.005)，说明本次斑马鱼高尿酸模型建立成功。

由图3可知，阳性对照组(别嘌醇)斑马鱼体内的黄嘌呤氧化酶活性为10.82±1.60U/L，与模型组(17.48±1.90U/L)相比差异性显著(P<0.005)，因此，别嘌醇具有抑制黄嘌呤氧化酶活性的作用，与临床结果一致。

对比例1发酵乳杆菌11739浓度为1×10⁶CFU/mL时，斑马鱼体内的黄嘌呤氧化酶活性分别为14.42±1.14U/L，与模型组(17.48±1.90U/L)相比均差异性显著(P<0.01)。实施例2发酵乳杆菌E1浓度为1×10⁵CFU/mL和1×10⁶CFU/mL时，斑马鱼体内的黄嘌呤氧化酶活性分别为13.93±1.61U/L和12.13±1.07U/L，与模型组(17.48±1.90U/L)相比均差异性显著(P<0.01)。因此，上述结果表明，在相同的浓度时，发酵乳杆菌E1对高尿酸斑马鱼体内的黄嘌呤氧化酶活性的抑制作用强于发酵乳杆菌11739，具有降尿酸的潜能。

对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

Claims (7)

1.一株发酵乳杆菌，其特征在于，所述发酵乳杆菌为发酵乳杆菌E1，于2021年02月01日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.21777，保藏地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号，分类命名为发酵乳杆菌Lactobacillusfermentum。

2.权利要求1所述的一株发酵乳杆菌在制备降尿酸药物中的应用。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述发酵乳杆菌E1能降低高尿酸斑马鱼体内尿酸含量。

4.权利要求1所述的的一株发酵乳杆菌在制备抑制黄嘌呤氧化酶活性药物中的应用。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述发酵乳杆菌E1能抑制高尿酸斑马鱼体内黄嘌呤氧化酶的活性。

6.一种降尿酸药物，其特征在于，包括发酵乳杆菌E1菌悬液。

7.一种抑制黄嘌呤氧化酶活性药物，其特征在于，包括发酵乳杆菌E1菌悬液。

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