CN116103195A

CN116103195A - 一株副干酪乳杆菌e6及其在制备降血脂药物中的应用

Info

Publication number: CN116103195A
Application number: CN202211604325.1A
Authority: CN
Inventors: 郑康帝; 黄晓婷; 陈丹; 张召; 马燕; 刘彦; 岑沅亭; 陈涛
Original assignee: Guangdong Yiyuan Lanxin Biotechnology Co ltd; Guangdong Longsee Medical Technology Co ltd
Current assignee: Guangdong Yiyuan Lanxin Biotechnology Co ltd; Guangdong Longsee Medical Technology Co ltd
Priority date: 2022-12-13
Filing date: 2022-12-13
Publication date: 2023-05-12

Abstract

本发明公开了一株副干酪乳杆菌E6及其在制备降血脂药物中的应用，属于微生物技术领域。本发明公开的一株副干酪乳杆菌E6，保藏编号为CGMCCNo.21771。副干酪乳杆菌E6能显著降低斑马鱼高血脂模型体内的甘油三酯(TG)和总胆固醇(TC)含量，表现出良好的降血脂作用，在制备治疗和/或预防高血脂药物方面有巨大的潜在应用前景。

Description

一株副干酪乳杆菌E6及其在制备降血脂药物中的应用

技术领域

本发明涉及微生物技术领域，更具体地说是涉及一株副干酪乳杆菌E6及其在制备降血脂药物中的应用。

背景技术

高脂血症是一种由脂质代谢紊乱引起的疾病。尽管工业进步和人类生活水平的提高，高血脂和肥胖症的患病率仍在继续增加，并出现并发症，如心脑血管疾病、癌症和糖尿病。这些疾病影响生活质量，危害人类健康。目前的研究已确定高胆固醇血症是心血管疾病的最重要原因，并确定了死亡率和胆固醇含量之间的密切关系。总胆固醇每增加1mol/L，冠心病的死亡率就会增加35％。

根据世界卫生组织的资料，心血管疾病目前是世界上主要的死亡原因，每年造成1700多万人死亡。降低血清胆固醇水平，预防和治疗心血管疾病的主要方法是药物、饮食改变和锻炼。抑制羟甲基戊二酰辅酶A还原酶活性的他汀类药物常用于降低血清胆固醇水平。然而，他汀类药物的不良副作用如肌肉毒性、肝毒性和肾损伤已被报道，最近，人们对其治疗效果产生了担忧。低脂饮食和运动是降低血脂和预防冠状动脉粥样硬化的有效途径；然而，由于消费者对低脂饮食的接受程度，目标实际结果之间存在差距。因此，研究人员正在探索降低血清胆固醇的替代方法。与传统药物治疗相比，具有降血脂功效的益生菌因其副作用小并且具有其他益生功效等特点，而被广泛关注。

乳酸菌在自然界中无处不在，是发酵食品(如泡菜、大白菜和奶酪)生产中必不可少的微生物。此外，益生菌对人体生理功能的潜在影响，包括：调节免疫，预防结肠癌和减少过敏反应等。最近，临床和动物研究表明，乳酸菌可能有助于降低血清胆固醇水平。植物乳杆菌299v被证明可以降低高胆固醇血症患者的低密度脂蛋白(LDL-C)。植物乳杆菌LIP-1能够显著降低高脂饲料喂养大鼠的血清总胆固醇(TC)、三酰甘油(TG)和LDL-C水平，并使高密度脂蛋白(HDL-C)水平上升。然而，目前益生菌在降血脂方面的研究和应用依然较少。同时，当前国际益生菌专利申请集中于美、日、俄传统研发强国，而我国缺乏拥有自主知识产权的功能性菌株。国内生产企业所用益生菌菌种长期依赖进口，而且国外菌株未必适合我国居民胃肠道生理状况。另外，益生菌的功能缺乏有力的科学研究证据，严重影响了益生菌及其制品的推广。基于此，针对菌种资源的功能深入挖掘，筛选出拥有自主知识产权、具有特定功能性质、适合中国人群生理特性的新型益生菌菌株，对提高我国益生菌生产企业的核心竞争力，促进我国益生菌制品发展尤为重要。

因此，提供一株副干酪乳杆菌，并将其应用于在制备降血脂药物中的应用是本领域技术人员亟需解决的问题。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了一株副干酪乳杆菌E6，并将其应用于在制备降血脂药物中的应用。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种副干酪乳杆菌E6，所述副干酪乳杆菌(Lactobacillusparacasei)E6，于2021年01月29日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.21771，保藏地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号，分类命名为副干酪乳杆菌Lactobacillusparacasei。

作为与上述技术方案相同的发明构思，本发明还请求保护副干酪乳杆菌E6在制备降血脂药物中的应用。

优选地，所述副干酪乳杆菌E6能显著降低斑马鱼高血脂模型体内的甘油三酯(TG)和总胆固醇(TC)，表现出良好的降血脂作用。

作为与上述技术方案相同的发明构思，本发明还请求保护一种治疗高脂血症的药物，其特征在于，包括副干酪乳杆菌E6菌悬液。

经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明公开提供了一株副干酪乳杆菌E6，并提供了副干酪乳杆菌E6在制备降血脂药物中的应用，副干酪乳杆菌E6是从广东省梅州市蕉岭县的长寿老人粪便中分离筛选得到的，在高血脂斑马鱼体内能显著降低甘油三酯(TG)和总胆固醇(TC)的含量，具备应用于减肥、调节血脂水平的潜能，此为利用副干酪乳杆菌E6开发预防或治疗心血管疾病、预防肥胖、高血脂的益生菌制剂提供理论参考和指导依据。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。

图1附图为本发明副干酪乳杆菌E6在MRS琼脂平板上的菌落形态；

图2附图为本发明副干酪乳杆菌E6对斑马鱼高血脂模型体内甘油三酯的影响；

图3附图为本发明副干酪乳杆菌E6对斑马鱼高血脂模型体内总胆固醇的影响。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1副干酪乳杆菌E6分离、鉴定及保藏

(1)分离：

1)将长寿老人粪便(约0.1g)溶解于装有1mL无菌生理盐水的1.5mL离心管中，用1mL无菌枪头充分吹打混匀，备用。

2)在6个无菌1.5mL离心管中各加入900uL的无菌生理盐水。

3)从第1个装有10^-1样品稀释液的离心管中，吸取100uL的液体加入第2个离心管(10^-2)，稀释到10^-2；

4)从第2个装有10^-2样品稀释液的离心管中，吸取100uL的液体加入第3个离心管(10^-3)，稀释到10^-3；

5)重复上个步骤，一直稀释到10^-4、10^-5、10^-6、10^-7。

6)从装有10^-4样品稀释液的离心管中吸取100uL的样品稀释液涂布在分别接种于MRS固体培养基、BHI固体培养基中上，将100uL的菌液摊平涂干，注意涂布的手法要温和，动作快速，必须在酒精灯火焰附近操作。涂布完成后，在培养皿侧面做好标记，包括姓名、样品编号、培养基名称、培养时间、稀释梯度、培养条件(厌氧/好氧)等信息。

7)重复上个步骤，完成10^-5、10^-6、10^-7稀释梯度的稀释涂布。

8)涂布完成后，将培养皿分别放在37℃、厌氧养条件下进行培养，48h后可进行观察记录。

9)用接种环挑取平板上的单菌落划线至MRS固体培养基中，37℃厌氧培养48h，分离得到纯菌落。

10)将平板上的纯菌落接种于MRS液体培养基中，37℃厌氧培养12～16h，加入20％甘油，置于-80℃冰箱中保存。

(2)菌株的分子生物学鉴定：对所获得的菌株提取基因组DNA，通过PCR技术利用16SrDNA通用引物27F和1492R扩增16SrDNA全长片段，之后进行测序，鉴定菌株的种属。

其中，通用引物27F和1492R的引物序列如下：

27F：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’；SEQ ID NO.1；

1492R：5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’；SEQ ID NO.2。

实验结果：从广东省梅州市蕉岭县长寿老人粪便中筛选出的菌株，经形态观察、16SrDNA鉴定，其中菌株E6被鉴定为副干酪乳杆菌，其16SrDNA序列如SEQ ID NO.3所示。

TGCAGTCGAACGAGTTCTCGTTGATGATCGGTGCTTGCACCGAGATTCAACATGGAACGAGTGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTGCCCTTAAGTGGGGGATAACATTTGGAAACAGATGCTAATACCGCATAGATCCAAGAACCGCATGGTTCTTGGCTGAAAGATGGCGTAAGCTATCGCTTTTGGATGGACCCGCGGCGTATTAGCTAGTTGGTGAGGTAATGGCTCACCAAGGCGATGATACGTAGCCGAACTGAGAGGTTGATCGGCCACATTGGGACTGAGACACGGCCCAAACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCACAATGGACGCAAGTCTGATGGAGCAACGCCGCGTGAGTGAAGAAGGCTTTCGGGTCGTAAAACTCTGTTGTTGGAGAAGAATGGTCGGCAGAGTAACTGTTGTCGGCGTGACGGTATCCAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTATCCGGATTTATTGGGCGTAAAGCGAGCGCAGGCGGTTTTTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCTCGGCTTAACCGAGGAAGCGCATCGGAAACTGGGAAACTTGAGTGCAGAAGAGGACAGTGGAACTCCATGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGATATATGGAAGAACACCAGTGGCGAAGGCGGCTGTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGCTCGAAAGCATGGGTAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCATGCCGTAAACGATGAATGCTAGGTGTTGGAGGGTTTCCGCCCTTCAGTGCCGCAGCTAACGCATTAAGCATTCCGCCTGGGGAGTACGACCGCAAGGTTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCTTTTGATCACCTGAGAGATCAGGTTTCCCCTTCGGGGGCAAAATGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTATGACTAGTTGCCAGCATTTAGTTGGGCACTCTAGTAAGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGATGGTACAACGAGTTGCGAGACCGCGAGGTCAAGCTAATCTCTTAAAGCCATTCTCAGTTCGGACTGTAGGCTGCAACTCGCCTACACGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCACGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGAGAGTTTGTAACACCCGAAGCCGGTGGCGTAACCCTTTTAGGGAGCGAGCCGTCTA；SEQ ID NO.3。

菌株E6单菌落接种到MRS固体培养基上，在37℃厌氧下生长良好，菌落乳白色、呈球形、边缘整齐，表面光滑(图1)。菌株E6已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏日期为2021年01月29日，分类命名为副干酪乳杆菌Lactobacillusparacasei，保藏编号为CGMCCNo.21771。

实施例2副干酪乳杆菌E6菌悬液(菌体)的制备

将副干酪乳杆菌E6活化培养后接种于MRS液体培养基中，37℃培养15h后，4℃，6000r/min离心10min，得到菌体沉淀；菌体沉淀经PBS两次洗涤后，将菌体用PBS重新悬浮，调整细胞浓度为调整细胞浓度为1×10⁴CFU/mL、1×10⁵CFU/mL、1×10⁶CFU/mL得到菌悬液(菌体)。

实施例3副干酪乳杆菌E6对斑马鱼高血脂模型体内甘油三酯和总胆固醇的影响

洛伐他汀购自上海绿源生物科技有限公司，普通饲料和高胆固醇饲料均购自南通特洛菲饲料科技有限公司。甘油三脂测定试剂盒和总胆固醇测定试剂盒均购自南京建成生物工程研究所有限公司。

模型构建：显微镜下挑选发育正常野生型AB系斑马鱼(5dpf)分为正常组、模型组(高胆固醇)、阳性对照组(洛伐他汀)、菌株干预组(1×10⁴CFU/mL、1×10⁵CFU/mL、1×10⁶CFU/mL副干酪乳杆菌E6)，每组设置6个复孔，每孔30条鱼，每孔5mLPBS，正常组的斑马鱼喂养普通饲料(每次20mg)；模型组、阳性对照组、菌株干预组的斑马鱼均喂养高胆固醇饲料(每次20mg)，每天喂养3次，喂养周期为7天，每天更换一次PBS。

干预：正常组、模型组均加入PBS溶液；阳性对照组加入0.24μg/mL洛伐他汀溶液；1×10⁴CFU/mL干预组加入1×10⁴CFU/mL副干酪乳杆菌E6，1×10⁵CFU/mL干预组加入1×10⁵CFU/mL副干酪乳杆菌E6，1×10⁶CFU/mL干预组加入1×10⁶CFU/mL副干酪乳杆菌E6，每孔5mL；同时正常组的斑马鱼喂养普通饲料(每次20mg)；模型组、阳性对照组、菌株干预组的斑马鱼均喂养高胆固醇饲料(每次20mg)，每天喂养3次，喂养周期为5天，每天更换一次溶液。干预结束后，收集斑马鱼至1.5mL离心管，每个实验组收集6管；将离心管中的水吸干后，按照质量(mg)：体积(μL)为1∶9加入PBS缓冲液，用S-18KS手持微量电动组织匀浆器将斑马鱼匀浆破碎，直至无明显组织碎块，15000×g，4℃离心15min，收集上清液。使用甘油三脂测定试剂盒和总胆固醇测定试剂盒各组的甘油三脂(图2)和总胆固醇(图3)浓度。

采用SPSS19.0软件统计处理数据，实验数据均用x±SD数据表示，用T-检验分析，与正常组相比：^####p<0.001，与模型组相比：^&&&&p<0.001；用单因素方差分析,与模型组相比：*P<0.05，**P<0.01，***P<0.005，****P<0.001。

由图2和图3可知，与正常组组(甘油三酯：0.11±0.02mmol/gprot、总胆固醇：0.08±0.02mmol/gprot)相比，模型组斑马鱼体内的甘油三酯和总胆固醇(0.30±0.03mmol/gprot、0.27±0.02mmol/gprot)均显著增加(P<0.005)，说明本次斑马鱼高血脂模型建立成功。

由图2和图3可知，洛伐他汀组斑马鱼的甘油三酯和总胆固醇分别为0.15±0.02mmol/gprot和0.14±0.01mmol/gprot，与模型组(甘油三酯：0.30±0.03mmol/gprot、总胆固醇：0.27±0.02mmol/gprot)相比差异性显著(P<0.005)。因此，洛伐他汀具有降血脂的作用，与临床结果一致。副干酪乳杆菌E6浓度为1×10⁴CFU/mL、1×10⁵CFU/mL和1×10⁶CFU/mL时，斑马鱼体内的甘油三脂分别为0.25±0.02mmol/gprot、0.23±0.03mmol/gprot和0.18±0.03mmol/gprot，总胆固醇分别为0.23±0.02mmol/gprot、0.19±0.02mmol/gprot和0.17±0.02mmol/gprot，与模型组(甘油三酯：0.30±0.03mmol/gprot、总胆固醇：0.27±0.02mmol/gprot)相比均差异性显著(P<0.05)。因此，上述结果表副干酪乳杆菌E6具有降尿酸的作用。上述结果表明副干酪乳杆菌E6具有降血脂的作用。

对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

Claims

1.一种副干酪乳杆菌E6，其特征在于，所述副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)E6，于2021年01月29日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.21771，保藏地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号，分类命名为副干酪乳杆菌Lactobacillusparacasei。

2.权利要求1所述的副干酪乳杆菌E6在制备降血脂药物中的应用。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述副干酪乳杆菌E6能显著降低斑马鱼高血脂模型体内的甘油三酯(TG)和总胆固醇(TC)含量。

4.一种制备降血脂药物，其特征在于，包括副干酪乳杆菌E6菌悬液。