CN116286546B - 乳酸片球菌pa04及其在制备治疗或预防糖尿病药物中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了乳酸片球菌PA04及其在制备治疗或预防糖尿病药物中的应用，属于微生物技术领域。本发明公开的乳酸片球菌PA04，其保藏编号为CGMCCNo.22989。乳酸片球菌PA04在体外具有较强的抑制α‑葡萄糖苷酶的作用，在体内能显著降低斑马鱼高血糖模型体内葡萄糖含量，具备应用于体内调节血糖水平的潜能，此为利用乳酸片球菌PA04开发预防或治疗糖尿病的益生菌制剂提供理论参考和指导依据。
Description
技术领域
本发明涉及微生物技术领域，更具体的说是涉及乳酸片球菌PA04及其在制备治疗或预防糖尿病药物中的应用。
背景技术
糖尿病是一组由多病因引起的以慢性高血糖为特征的代谢性疾病，是由于胰岛素分泌和(或)作用缺陷所引起。其典型症状为“三多一少”，即多尿、多饮、多食和体重减轻，可伴有皮肤瘙痒。长期碳水化合物以及脂肪、蛋白质代谢紊乱还可引起多种慢性并发症的产生，如眼、肾、神经、心脏、血管等组织器官慢性进行性病变、功能减退及衰竭；病情严重或应激时可发生急性严重代谢紊乱，如糖尿病酮症酸中毒(DKA)、高渗高血糖综合征。目前糖尿病治疗药物主要分为口服药物和注射胰岛素类，口服药物给药方便，但伴随较大的副作用，同时目前市售的抗糖尿病药物对糖尿病并发症的预防作用弱，且不能彻底治愈。注射胰岛素类药物难以控制，易引起胰岛素耐受，增加疾病的治疗难度。
益生菌是对宿主健康和生理功能产生有益作用的活性微生物，如乳杆菌和双歧杆菌等。大量研究表明，益生菌在提高免疫力、维持肠道微生态平衡、降低胆固醇、缓解过敏、减肥、降血糖等方面发挥着重要的作用，已被广泛用于开发功能性食品或膳食补充剂。虽然当前国内市场上益生菌制品种类繁多，但是缺乏拥有我国自主知识产权的功能性菌株。国内生产企业所用益生菌菌种长期依赖进口，而且国外菌株未必适合我国居民肠道生理状况。另外，益生菌的功能缺乏有力的科学研究证据，严重影响了益生菌及其制品的推广。基于此，针对菌种资源的功能深入挖掘，筛选出拥有自主知识产权、具有特定功能性质、适合中国人群生理特性的新型益生菌菌株，对提高我国益生菌生产企业的核心竞争力，促进我国益生菌制品发展尤为重要。
因此，提供乳酸片球菌PA04及其在制备治疗或预防糖尿病药物中的应用是本领域技术人员亟需解决的问题。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了乳酸片球菌PA04及其在制备治疗或预防糖尿病药物中的应用。
斑马鱼胰腺的形态发生和基本细胞结构、排列方式类似于哺乳动物，斑马鱼食欲调节(如血清素)和胰岛素调节功能与人类相似，斑马鱼其他涉及葡萄糖体内平衡的器官系统(包括脑、肝、脂肪细胞组织和骨骼肌)的发育和功能也与哺乳动物类似。斑马鱼在糖负荷状态下表现出持续高血糖现象，用于模拟人的二型糖尿病。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一株乳酸片球菌(Pediococcus acidilactici)PA04，其保藏编号为CGMCCNo.22989，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏日期为2021年07月30日，分类命名为乳酸片球菌Pediococcus acidilactici。
进一步，所述的乳酸片球菌PA04在制备治疗或预防糖尿病药物中的应用。
进一步，所述的乳酸片球菌PA04在制备降血糖药物中的应用。
进一步，所述的乳酸片球菌PA04在抑制α-葡萄糖苷酶中的应用。
进一步，所述乳酸片球菌PA04为菌悬液。
经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明公开提供了乳酸片球菌PA04及其在制备治疗或预防糖尿病药物中的应用，乳酸片球菌PA04是从广东省梅州市蕉岭县的长寿老人粪便中分离筛选得到的，乳酸片球菌PA04在体外具有较强的抑制α-葡萄糖苷酶的作用，在体内能显著降低斑马鱼高血糖模型体内葡萄糖含量，具备应用于体内调节血糖水平的潜能，此为利用乳酸片球菌PA04开发预防或治疗糖尿病的益生菌制剂提供理论参考和指导依据。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。
图1附图为本发明乳酸片球菌PA04在MRS琼脂平板上的菌落形态；
图2附图为本发明乳酸片球菌PA04对α-葡萄糖苷酶相对活性的影响；
图3附图为本发明乳酸片球菌PA04对α-葡萄糖苷酶活性的抑制率；
图4附图为本发明乳酸片球菌PA04对高血糖斑马鱼体内的葡萄糖含量的影响；
图5附图为本发明乳酸片球菌PA04对高血糖斑马鱼体内的葡萄糖含量的抑制作用。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
α-葡萄糖苷酶、硝基苯基-α-D-吡喃葡萄糖苷、碳酸氢钠、阿卡波糖均购自上海源叶生物科技有限公司；葡萄糖试剂盒购自南京建成生物工程研究所有限公司；乳酸片球菌8042(ATCC 8042)购自北京百欧博伟生物技术有限公司。
实施例1乳酸片球菌PA04分离、鉴定及保藏
(1)分离：
1)将长寿老人粪便(约0.1g)溶解于装有1mL无菌生理盐水的1.5mL离心管中，用1mL无菌枪头充分吹打混匀，备用。
2)在6个无菌1.5mL离心管中各加入900μL的无菌生理盐水。
3)采用梯度稀释的方法，将样品稀释到10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7。
4)从装有10-4样品稀释液的离心管中吸取100μL的样品稀释液分别接种于MRS固体培养基、PYG固体培养基、BS固体培养基上，将100μL的菌液摊平涂干，注意涂布的手法要温和，动作快速，必须在酒精灯火焰附近操作。涂布完成后，在培养皿侧面做好标记，包括姓名、样品编号、培养基名称、培养时间、稀释梯度、培养条件(厌氧/好氧)等信息。
5)重复上个步骤，完成10-5、10-6、10-7稀释梯度的稀释涂布。
6)涂布完成后，将培养皿分别放在37℃、厌氧养条件下进行培养，48h后可进行观察记录。
7)用接种环挑取平板上的单菌落划线至MRS固体培养基中，37℃厌氧培养48h，分离得到纯菌落。
8)将平板上的纯菌落接种于MRS液体培养基中，37℃厌氧培养12～16h，加入20％甘油，置于-80℃冰箱中保存。
(2)菌株的分子生物学鉴定：对所获得的菌株提取基因组DNA，通过PCR技术利用16S rDNA通用引物27F和1492R扩增16S rDNA全长片段，之后进行测序，鉴定菌株的种属。
其中，通用引物27F和1492R的引物序列如下：
27F：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’；SEQ ID NO.1；
1492R：5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’；SEQ ID NO.2。
实验结果：从广东省梅州市蕉岭县长寿老人粪便中筛选出的菌株，经形态观察、16S rDNA鉴定，其中菌株PA04被鉴定为乳酸片球菌，其16S rDNA序列如SEQ ID NO.3所示。
CACCTTAGACGGCTAGCTCCTAAAGGTTACCCCACCGGCTTTGGGTGTTACAAACTCTCATGGTGTGACGGGCGGTGTGTACAAGGCCCGGGAACGTATTCACCGCGGCATGCTGATCCGCGATTACTAGCGATTCCGACTTCGTGTAGGCGAGTTGCAGCCTACAGTCCGAACTGAGAATGGTTTTAAGAGATTAGCTAAACCTCGCGGTTTCGCGACTCGTTGTACCATCCATTGTAGCACGTGTGTAGCCCAGGTCATAAGGGGCATGATGATTTGACGTCGTCCCCACCTTCCTCCGGTTTGTCACCGGCAGTCTCACTAGAGTGCCCAACTGAATGCTGGCAACTAGTAATAAGGGTTGCGCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACATCTCACGACACGAGCTGACGACAACCATGCACCACCTGTCATTCTGTCCCCGAAGGGAACGCCTAATCTCTTAGGTTGGCAGAAGATGTCAAGACCTGGTAAGGTTCTTCGCGTAGCTTCGAATTAAACCACATGCTCCACC GCTTGTGCGGGCCCCCGTCAATTCTTTTGAGTTTCAACCTTGCGGTCGTACTCCCCAGGCGGATTACTTAATGCGTTAGCTGCAGCACTGAAGGGCGGAAACCCTCCAACACTTAGTAATCATCGTTTACGGCATGGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTTCGCTACCCATGCTTTCGAGCCTCAGCGTCAGTTACAGACCAGACAGCCGCCTTCGCCACTGGTGTTCTTCCATATATCTACGCATTTCACCGCTACACATGGAGTTCCACTGTCCTCTTCTGCACTCAAGTCTCCCAGTTTCCAATGCACTTCTTCGGTTGAGCCGAAGGCTTTCACATTAGACTTAAAAGACCGCCTGCGCTCGCTTTACGCCCAATAAATCCGGATAACGCTTGCCACCTACGTATTACCGCGGCTGCTGGCACGTAGTTAGCCGTGGCTTTCTGGTTAAATACCGTCACTGGGTGAATAGTTACTCTCACCCACGTTCTTCTTTAACAACAGAGCTTTACGAGCCGAAACCCTTCTTCACTCACGCGGCGTTGCTCCATCAGACTTGCGTCCATTGTGGAAGATTCCCTACTGCTGCCTCCCGTAGGAGTCTGGGCCGTGTCTCAGTCCCAATGTGGCCGATTACCCTCTCAGGTCGGCTACGCATCATCGCCTTGGTGAGCCGTTACCTCACCAACTAGCTAATGCGCCGCGGGTCCATCCAGAAGTGATAGCAGAGCCATCTTTTAAAAGAAAACCAGGCGGTTTTCTCTGTTATACGGTATTAGCATCTGTTTCCAGGTGTTATCCCCTGCTTCTGGGCAGGTTACCCACGTGTTACTCACCCGTCCGCCACTCACTTCGTGTTAAAATCTCATTCAGTGCAAGCACGTCCATGAATCAATTAACGGAAGTTCGTTCGACATGCATGTATAG；SEQ ID NO.3。
菌株PA04单菌落接种到MRS固体培养基上，在37℃有氧条件下生长良好，菌落乳白色、呈圆形、表面光滑(图1)。菌株PA04已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏日期为2021年07月30日，分类命名为乳酸片球菌Pediococcus acidilactici，保藏编号为CGMCC No.22989。
实施例2乳酸片球菌PA04菌悬液(菌体)的制备
将乳酸片球菌PA04活化培养后接种于MRS液体培养基中，37℃培养24h后，4℃，6000r/min离心10min，得到菌体沉淀；菌体沉淀经PBS两次洗涤后，将菌体用PBS重新悬浮，调整细胞浓度为1×106CFU/mL得到菌悬液(菌体)。
实施例3乳酸片球菌8042菌悬液(菌体)的制备
将乳酸片球菌8042活化培养后接种于MRS液体培养基中，37℃培养24h后，4℃，6000r/min离心10min，得到菌体沉淀；菌体沉淀经PBS两次洗涤后，将菌体用PBS重新悬浮，调整细胞浓度为1×106CFU/mL得到菌悬液(菌体)。
实施例4乳酸片球菌PA04对α-葡萄糖苷酶活性的抑制能力分析
将100μL 1U/mLα-葡萄糖苷酶与50μL样品(1×106CFU/mL乳酸片球菌8042、1×106CFU/mL乳酸片球菌PA04)混合于1.5mL离心管中。在37℃水浴下预孵育10min后，添加50μL 5mM对硝基苯基-α-D-吡喃葡萄糖苷(pNPG，0.1M PBS，pH 6.8)作为底物。酶促反应在37℃水浴下进行30min，并通过添加1mL的0.1M Na2CO3(蒸馏水)终止反应。取200μL反应液置于96孔细胞培养板中，α-葡萄糖苷酶活性是通过在405nm处测量OD值对硝基苯酚从pNPG中的释放来确定的。没有样品的溶剂用作空白组，没有底物的溶剂用作溶剂调零组，阿卡波糖(0.5μg/mL)作阳性对照。每组试验重复6次，取其平均值。α-葡萄糖苷酶相对活性和α-葡萄糖苷酶活性抑制率计算如下：
采用SPSS 19.0软件统计处理数据，实验数据均用x±SD数据表示，用T-检验分析，与空白组相比：****P<0.001，***P<0.005。
由图2和图3可知，阳性对照组(阿卡波糖)α-葡萄糖苷酶相对活性为24.23±3.00％，同时α-葡萄糖苷酶活性抑制率为75.76±3.00％，与空白组(α-葡萄糖苷酶相对活性：100.00±9.05％)相比差异性显著(P<0.001)。因此，阿卡波糖具有抑制α-葡萄糖苷酶活性的作用，与临床结果一致，说明本次α-葡萄糖苷酶活性抑制试验有效。
由图2和图3可知，乳酸片球菌8042组(1×106CFU/mL)α-葡萄糖苷酶相对活性为73.46±8.06％，同时α-葡萄糖苷酶活性抑制率为26.54±8.06％，与空白组(α-葡萄糖苷酶相对活性：100.00±9.05％)相比差异性显著(P<0.005)。另外，乳酸片球菌PA04(1×106CFU/mL)α-葡萄糖苷酶相对活性为41.73±8.39％，同时α-葡萄糖苷酶活性抑制率为58.27±8.39％，与空白组(α-葡萄糖苷酶相对活性：100.00±9.05％)相比差异性显著(P<0.001)。因此，上述结果表明，在相同的浓度时，乳酸片球菌PA04对α-葡萄糖苷酶的抑制作用强于乳酸片球菌8042，具有降血糖的潜能。
实施例5乳酸片球菌PA04对高血糖斑马鱼体内的葡萄糖含量的影响
模型构建：将野生型AB系斑马鱼(5dpf)置于于六孔板中。实验设置正常组、模型组、阳性对照组(阿卡波糖)、乳酸片球菌8042干预组(1×106CFU/mL)、乳酸片球菌PA04干预组(1×106CFU/mL)，每组设置6个复孔，每孔10条鱼；除正常组外，用蔗糖(4％)与四氧嘧啶(1mmol/L)联合处理斑马鱼(5dpf)48h后构建高血糖斑马鱼模型。
干预：正常组和模型组每孔加入5mL PBS；阳性对照组每孔加入5mL0.05mg/mL阿卡波糖溶液；乳酸片球菌8042干预组加入1×106CFU/mL乳酸片球菌8042，乳酸片球菌PA04干预组加入1×106CFU/mL乳酸片球菌PA04，每孔5mL，28℃孵育，24h后更换新溶液；孵育48h后收集斑马鱼至1.5mL离心管，每管5条斑马鱼，每个实验组收集6管；将离心管中的水吸干后，加入100μL的乙醇，用S-18KS手持微量电动组织匀浆器将斑马鱼匀浆破碎，直至无明显组织碎块，12000×g，4℃离心10min，收集上清液于离心管中，转移至烘箱70℃1小时烘干。每管加入5μL的超纯水，温度37℃，摇床转速200r/min，15min后，取其中2μL，使用葡萄糖试剂盒检测上清液中葡萄糖的浓度(A)。降糖率计算如下：
采用SPSS 19.0软件统计处理数据，实验数据均用x±SD数据表示，用T-检验分析，与正常组相比：####p<0.001；与模型组相比：*P<0.01，***P<0.005，****P<0.001。
由图4和图5可知，与正常组(1.48±0.22nmoL/fish)相比，模型组的斑马鱼体内葡萄糖含量(4.01±0.34nmoL/fish)显著增加(P<0.001)，说明本次斑马鱼糖尿病模型建立成功。
由图4和图5可知，阳性对照组斑马鱼体内葡萄糖含量为2.04±0.38nmol/fish，降糖率为78.01±15.14％，与模型组(4.01±0.34nmoL/fish)相比差异性显著(P<0.001)。因此，阿卡波糖具有降血糖的作用，与临床结果一致，说明本次降血糖功效评价试验有效。乳酸片球菌8042组斑马鱼体内葡萄糖含量为3.22±0.30nmol/fish，降糖率为31.40±11.87％，与模型组(4.01±0.34nmoL/fish)相比差异性显著(P<0.01)。另外，乳酸片球菌PA04组斑马鱼体内葡萄糖含量为2.38±0.60nmol/fish，降糖率为64.38±23.68％，与模型组(4.01±0.34nmoL/fish)相比差异性显著(P<0.005)。因此，上述结果表明，在相同的浓度时，乳酸片球菌PA04对高血糖斑马鱼体内的葡萄糖含量的降低作用强于乳酸片球菌8042，表现出良好的降血糖的功效。
对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。
Claims (7)
1.一株乳酸片球菌(Pediococcus acidilactici)PA04，其特征在于，其保藏编号为CGMCC No.22989。
2.权利要求1所述的乳酸片球菌PA04在制备治疗或预防糖尿病药物中的应用。
3.根据权利要求2所述的乳酸片球菌PA04在制备治疗或预防糖尿病药物中的应用，其特征在于，所述乳酸片球菌PA04为菌悬液。
4.权利要求1所述的乳酸片球菌PA04在制备降血糖药物中的应用。
5.根据权利要求4所述的乳酸片球菌PA04在制备降血糖药物中的应用，其特征在于，所述乳酸片球菌PA04为菌悬液。
6.权利要求1所述的乳酸片球菌PA04在制备抑制α-葡萄糖苷酶的药物中的应用。
7.根据权利要求6所述的乳酸片球菌PA04在制备抑制α-葡萄糖苷酶的药物中的应用，其特征在于，所述乳酸片球菌PA04为菌悬液。
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