CN112940984B - 抗幽门螺杆菌、降血糖、调理肠胃和增加免疫力的复合乳酸杆菌制剂及其制备方法 - Google Patents
抗幽门螺杆菌、降血糖、调理肠胃和增加免疫力的复合乳酸杆菌制剂及其制备方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种抗幽门螺杆菌、降血糖、调理肠胃和增加免疫力的复合乳酸杆菌制剂及其制备方法与应用，采用植物乳杆菌MiuCul‑01、嗜酸乳杆菌MiuLac‑01、干酪乳杆菌MiaoTech‑01、鼠李糖乳杆菌MiaoTech‑11、嗜热链球菌MiaoPro‑01，经混合菌接种、液态培养、固液分离、固态培养等结合的新工艺制备而成，获得具有更高活力的复合乳酸杆菌菌体，还保留固态培养过程中所产生的细菌素和有机酸等抗菌物质，具有抗幽门螺杆菌和调理肠胃的功能；还能产生多种具有降血糖、增加免疫力的代谢产物。固态培养物水分含量较低，容易干燥，能减少复合乳酸杆菌在干燥期间的应激死亡，结合适当的造粒、包衣工序，能大幅提高产品中复合乳酸杆菌的活力。生产的复合乳酸杆菌类益生菌制剂可增加抗幽门螺杆菌、降血糖、调理肠胃和增加免疫力等多方面的功效。
Description
技术领域
本发明属于益生菌制剂技术领域，具体涉及一种抗幽门螺杆菌、降血糖、 调理肠胃和增加免疫力的复合乳酸杆菌制剂及其制备方法。
背景技术
幽门螺杆菌是一种螺旋形、微厌氧、对生长条件要求十分苛刻的细菌。幽 门螺杆菌感染首先引起慢性胃炎，并导致胃溃疡和胃萎缩，严重者则发展为胃 癌。慢性胃炎和消化道溃疡患者的普遍症状为：食后上腹部饱胀、不适或疼痛， 常伴有其它不良症状，如嗳气、腹胀、反酸和食欲减退等。有些患者还可出现 反复发作性剧烈腹痛、上消化道少量出血等。据统计：大约有1％的慢性胃炎、 胃溃疡患者会发展成胃癌，而胃癌是全球最常见的恶性肿瘤之一，在癌症死亡 原因中位列第二。因此，及时而有效地用抗菌素杀灭幽门螺杆菌，对预防和控 制胃癌有重大意义。便秘与腹泻是由肠道功能紊乱引起的两个极端排泄症状。前者是肠道内的废物排泄困难，粪便非常干燥和坚硬；后者是粪便的水分增加， 呈泥状或水状，排泄不止。
近年来，益生菌调理肠胃的效果已在国内外获得了广泛的认可，并已经有 许多含有益生菌的调理肠胃功能的产品应用于实际生产。
申请号为201110059827.6的发明专利“一种抗幽门螺杆菌感染的植物乳 杆菌及其用途”公布了一种具有抗幽门螺杆菌作用的植物乳杆菌；申请号为 201911327960.8的发明专利“一株可以抑制幽门螺旋杆菌的嗜酸乳杆菌LA-10A 及其应用”公布了一种抑制幽门螺杆菌的嗜酸乳杆菌，可以减轻或者预防幽门 螺杆菌感染；申请号为202010478076.0的发明专利“一株鼠李糖乳杆菌及其 在抑制幽门螺杆菌中的应用”公布了一种具有抗幽门螺杆菌作用的鼠李糖乳杆 菌；申请号为201810988132.8的发明专利“一种抑制幽门螺旋杆菌的复合益 生菌功能性食品”公布了一种具有抗幽门螺杆菌作用的复合益生菌制剂，该制 剂由双歧杆菌、嗜酸乳杆菌、干酪乳杆菌、罗伊氏乳杆菌、副干酪乳杆菌、格 氏乳杆菌、鼠李糖乳杆菌及益生元等组成，能够有效抑制幽门螺杆菌的感染， 同时增强抵抗力；申请号为201910825079.4的发明专利“植物乳杆菌LP10及 其应用”公布了一种能够提升肠道屏障与降低肝脏病理损伤的植物乳杆菌；申 请号为201911012546.8的发明专利“一株植物乳杆菌及其在提高肠道IL-17F 表达量方面的应用”公布了一种具有调理肠胃作用的植物乳杆菌；申请号为 201910648236.9的发明专利“一株可改善肠道菌群和调节免疫力的嗜酸乳杆菌及其应用”公布了一株科调节肠道菌群和调节免疫力的嗜酸乳杆菌LA-06，通 过人体试验证明嗜酸乳杆菌具有增强人体免疫力的作用；申请号为 201610390305.7的发明专利“鼠李糖乳杆菌grx19在调节肠道菌群中的应用” 公布了一种具有调节肠道菌群作用的鼠李糖乳杆菌；申请号为201580023644.5 的发明专利“鼠李糖乳杆菌促进生态失调后肠道菌群多样性恢复的应用”公布 了一种具有促进肠道菌群多样性恢复作用的鼠李糖乳杆菌。这些专利为复合乳 酸杆菌类益生菌制剂在抗幽门螺杆菌、降血糖、调理肠胃和增加免疫力的方面的应用提供了一条新思路。但单一菌种抗幽门螺杆菌的效果比较受限，而且长 时间使用效果不理想；复合菌剂需要的菌种较多，有些还需要除菌种外的其他 原料，或者菌种选择不科学，配比不合理，制备方法不合理，致使得到的菌剂 不稳定或抗幽门螺杆菌的效果不明显。
目前，益生菌生产行业在生产各种益生菌菌粉的过程中，几乎全部采用液 态发酵，在液态发酵完成后经离心分离或其它的固液分离方法去除水分而得到 湿菌体，然后添加干燥保护剂或载体混匀、冷冻干燥、粉碎、造粒、包衣、包 装等。由于在固液分离过程中，去除了益生菌在液态发酵过程中所产生的细菌 素、有机酸等具有抑菌作用的物质，在产品中无法体现复合益生菌代谢产物的 抑菌效果，因此，这种方法所生产的益生菌产品仅仅利用了益生菌本身的抗幽 门螺杆菌、降血糖、调理肠胃和增加免疫力的效果，而未能利用其中抑菌物质 的抗幽门螺杆菌、降血糖、调理肠胃和增加免疫力的效果；此外，由于从液态发酵液中分离得到的湿菌体水分含量高，干燥时菌体应激死亡率高，并且由于 在湿菌体中添加适量的干燥保护剂或载体，使得液态发酵的产品在干燥后实际 所得到的菌体数量也有所减少。
申请号为201310187056.8的发明专利“一种嗜酸乳杆菌的制备方法”公 布了一种采用液态发酵和固态发酵结合生产嗜酸乳杆菌的工艺，即首先进行液 态发酵，然后利用液态发酵的产物作为菌种与固态培养基混合，再进行固态发 酵，产品中含有嗜酸乳杆菌活菌及其代谢产物，例如：乳酸菌素、正丁酸、乙 酸、甲酸等；申请号为201510559188.8的发明专利“高密度固态发酵培养乳 杆菌的培养基及方法”公布了一种固态发酵培养乳杆菌的方法：将乳杆菌菌种 按3-5％v/v的接种量接种到培养基中混匀，于30-37℃的条件下密闭发酵。这 两个专利采用的菌种都是用三角瓶或小型发酵罐制备的液态菌种，也可以算是 “液态培养-固态培养”结合的工艺，即在固态培养基中添加液态培养所获得 的液态菌种，混合均匀后进行固态发酵，从而获得固态发酵产品。但由于液态 发酵液中的固含量很低(2-5％)，所以即使添加的液态培养液用量达到50％，在 固态培养基中也只能加入少量的液态菌种(1-2.5％)作为固态发酵的菌种，从而 造成固态发酵培养基中的初始菌体浓度不高，导致固态发酵时间长，产品中活 菌浓度小。
综上所述，无论是传统的益生菌实际生产工艺“液态培养+离心分离”， 还是上述发明的“液态培养+固态培养”工艺，都存在菌种含量低、发酵效果 差、干燥时菌体死亡率高因而成品中菌种活力低等缺陷。
鉴于此，申请此专利。
发明内容
为了解决现有技术存在的问题，本发明提供了一种抗幽门螺杆菌、降血糖、 调理肠胃和增加免疫力的复合乳酸杆菌制剂及其制备方法，新制备工艺使产品 菌体数量大且活性高，并含有复合乳酸杆菌所产生的代谢产物等(含有一定量 的细菌素、有机酸等抑菌物质以及α-葡萄糖苷酶抑制剂、细菌多糖等降血糖、 增加免疫力的代谢产物)，所生产的复合乳酸杆菌制剂在人体胃肠道中具有更 好的抗幽门螺杆菌和降血糖、调理肠胃的和增加免疫力等多方面的功能效果。
本发明的目的是提供一种抗幽门螺杆菌、降血糖、调理肠胃和增加免疫力 的复合乳酸杆菌制剂。
本发明的再一目的是提供上述抗幽门螺杆菌、降血糖、调理肠胃和增加免 疫力的复合乳酸杆菌制剂的制备方法。
根据本发明的具体实施方式的抗幽门螺杆菌、降血糖、调理肠胃和增加免 疫力的复合乳酸杆菌制剂，所述抗幽门螺杆菌、降血糖、调理肠胃和增加免疫 力的复合乳酸杆菌制剂包括以下组分：
植物乳杆菌MiuCul-01、嗜酸乳杆菌MiuLac-01、干酪乳杆菌MiaoTech-01、 鼠李糖乳杆菌MiaoTech-11和嗜热链球菌MiaoPro-01；优选的，所述抗幽门螺 杆菌、降血糖、调理肠胃和增加免疫力的复合乳酸杆菌制剂按重量份包括以下 组分：10-15份植物乳杆菌MiuCul-01、5-10份嗜酸乳杆菌MiuLac-01、3-7份 干酪乳杆菌MiaoTech-01、2-6份鼠李糖乳杆菌MiaoTech-11和8-12份嗜热链 球菌MiaoPro-01。
根据本发明的具体实施方式的抗幽门螺杆菌、降血糖、调理肠胃和增加免 疫力的复合乳酸杆菌制剂，其中，所述抗幽门螺杆菌、降血糖、调理肠胃和增 加免疫力的复合乳酸杆菌制剂按重量份包括以下组分：
12-13份植物乳杆菌MiuCul-01、7-8份嗜酸乳杆菌MiuLac-01、4-6份干 酪乳杆菌MiaoTech-01、3-5份鼠李糖乳杆菌MiaoTech-11和9-11份嗜热链球 菌MiaoPro-01；优选的，所述抗幽门螺杆菌、降血糖、调理肠胃和增加免疫力 的复合乳酸杆菌制剂按重量份包括以下组分：12.5份植物乳杆菌MiuCul-01、 7.5份嗜酸乳杆菌MiuLac-01、5份干酪乳杆菌MiaoTech-01、4份鼠李糖乳杆 菌MiaoTech-11和10份嗜热链球菌MiaoPro-01；所述复合乳酸杆菌制剂的活 菌数为(4-5)×1011CFU/g。
根据本发明的具体实施方式的抗幽门螺杆菌、降血糖、调理肠胃和增加免 疫力的复合乳酸杆菌制剂，其中，所述植物乳杆菌MiuCul-01从泡菜中分离得 到，培养条件为：MRS培养基；pH6.2～6.4，温度37℃。
根据本发明的具体实施方式的抗幽门螺杆菌、降血糖、调理肠胃和增加免 疫力的复合乳酸杆菌制剂，其中，所述嗜酸乳杆菌MiuLac-01从发酵乳制品中 分离得到，培养条件为：MRS培养基；pH6.2～6.4，温度37℃。
根据本发明的具体实施方式的抗幽门螺杆菌、降血糖、调理肠胃和增加免 疫力的复合乳酸杆菌制剂，其中，所述干酪乳杆菌MiaoTech-01从发酵乳制品 中分离得到，培养条件为：MRS培养基；pH6.2～6.4，温度37℃。
根据本发明的具体实施方式的抗幽门螺杆菌、降血糖、调理肠胃和增加免 疫力的复合乳酸杆菌制剂，其中，所述鼠李糖乳杆菌MiaoTech-11从益生菌制 剂中分离得到，培养条件为：MRS培养基；pH6.2～6.4，温度37℃。
根据本发明的具体实施方式的抗幽门螺杆菌、降血糖、调理肠胃和增加免 疫力的复合乳酸杆菌制剂，其中，所述嗜热链球菌MiaoPro-01从酸奶发酵剂 中分离得到，培养条件为：MRS培养基；pH6.2～6.4，温度37℃。
根据本发明的具体实施方式的抗幽门螺杆菌、降血糖、调理肠胃和增加免 疫力的复合乳酸杆菌制剂的制备方法，所述方法包括以下步骤：
(1)按配比将植物乳杆菌MiuCul-01、嗜酸乳杆菌MiuLac-01、干酪乳杆 菌MiaoTech-01、鼠李糖乳杆菌MiaoTech-11和嗜热链球菌MiaoPro-01混合均 匀，形成复合乳酸杆菌，放入液体培养基中进行第一次厌氧培养，产生的培养 液经离心分离后获得复合乳酸杆菌湿菌体，备用；
(2)向步骤(1)得到的所述复合乳酸杆菌湿菌体与固体培养基混合，在 密封状态下进行第二次厌氧培养，培养完成后进行低温干燥或冷冻干燥或真空 干燥，形成复合乳酸杆菌固体；
(3)将步骤(2)得到的复合乳酸杆菌固体粉碎、造粒、包衣，即得所述 抗幽门螺杆菌、降血糖、调理肠胃和增加免疫力的复合乳酸杆菌制剂。
根据本发明的具体实施方式的抗幽门螺杆菌、降血糖、调理肠胃和增加免 疫力的复合乳酸杆菌制剂的制备方法，其中，步骤(1)中，采用碟式离心机 或管式离心机在无菌条件下进行离心分离后获得复合乳酸杆菌湿菌体；所述液 体培养基包括葡萄糖、蛋白胨、酵母浸膏；所述第一次厌氧培养的温度为 36-38℃，时间为48-72小时。
根据本发明的具体实施方式的抗幽门螺杆菌、降血糖、调理肠胃和增加免 疫力的复合乳酸杆菌制剂的制备方法，其中，步骤(2)中，所述固体培养基 包括葡萄糖、大豆肽、酵母提取物、食品级碳酸钙，所述固体培养基在使用前 经过高温干热灭菌，并无菌冷却到38℃以下备用；所述第二次厌氧培养前将所 述复合乳酸杆菌湿菌体与固体培养基混合物的水分含量调节到45％-55％；所述 第二次厌氧培养的温度为36-38℃，时间为72-120小时；所述低温干燥或真空 干燥的温度为30-40℃；所述复合乳酸杆菌固体的含水率为4-6％。
本发明在固态培养完成后不进行菌种或代谢产物的分离操作，而是将培 养后的菌种和代谢产物等一起直接进行低温干燥(冷冻干燥或真空干燥)而得 到高活力的复合乳酸杆菌固体。因此，这种产品中还含有固态培养时菌种所产 生的有机酸、细菌素等具有抑菌能力的代谢产物，还能产生降血糖、增加免疫 力的代谢产物，能增强复合乳酸杆菌制剂在使用时的抗幽门螺杆菌、降血糖、 调理肠胃和增加免疫力等多方面的功能效果。
本发明使用的复合乳酸杆菌类益生菌制剂包括几种培养条件类似的乳酸 杆菌，例如：植物乳杆菌、嗜酸乳杆菌、干酪乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、嗜热链 球菌等，这些乳酸杆菌在肠道内的生长过程中都具有抑制或杀死其它致病微生 物的功能。通过多菌种的协同作用，可以增加各菌种之间的协同杀菌效果。
乳酸杆菌属为革兰氏染色阳性、无芽孢杆菌，在营养琼脂上的菌落凸起、 全缘无色，直径2mm-5mm。乳杆菌细胞形态多样，长或细长杆状、弯曲形短杆 状及棒形球杆状，通常成短链。乳酸杆菌在自然界中分布很广，存在于植物体 表、乳制品、肉制品、啤酒、葡萄酒、果汁、麦芽汁、发酵面团、污水以及人 畜粪便中。
本发明所使用的复合乳酸杆菌菌种的特征如下：
植物乳杆菌为直或弯的杆状，圆端直杆菌，厌氧或兼性厌氧，通常缺乏鞭 毛，但能运动。革兰氏阳性，不生芽孢。植物乳杆菌常存在于发酵的蔬菜和果 汁中，最适生长温度为30-35℃，最适pH6.5左右，能耐pH2.0左右的胃酸和 胆盐环境。属于同型发酵乳酸菌，能产生DL-乳酸，有1,6～二磷酸果糖醛缩 酶和单磷酸己糖途径的活性，能在葡萄酸盐中生长，并产C02。发酵1分子的 核糖或其它的戊糖生成1分子的乳酸和1分子的乙酸。此菌在繁殖过程中能产 出特有的乳酸杆菌素，乳酸杆菌素是一种生物型的防腐剂。植物乳杆菌作为人体胃肠道的益生菌群，具有维持肠道内菌群平衡、提高机体免疫力和促进营养 物质吸收等多种功能。植物乳杆菌制剂在食品工业中应用十分广泛。由于对食 盐、亚硝酸盐具有良好的耐受性，对蛋白质、脂肪无明显直接的分解作用等特 点，在发酵肉制品和发酵植物性食品中获得广泛的应用。
嗜酸乳杆菌属于革兰氏阳性杆菌，乳杆菌属，呈短杆状，杆的末端呈圆形， 无鞭毛，无荚膜，以单个、成双和短链出现，兼性厌氧或微需氧菌。主要存在 于人及一些动物肠道中，其最适生长温度为35-38℃，最适pH为5.5-6.2。在 MRS培养基上可以形成明显的菌落，菌落圆形，白色凸起，表面光滑。嗜酸乳 杆菌具有耐酸、耐胆汁酸盐的特性，在小肠中，释放乳酸、乙酸和具有抑菌作 用的抗生物素类物质(嗜酸乳菌素、嗜酸杆菌素、乳酸菌素等),对肠道致病 菌具有一定的拮抗作用。嗜酸乳杆菌是目前乳酸菌家族中研究与开发比较广泛 的益生菌之一，是人体肠道中重要的微生物，具有平衡肠道微生物区系、调节 肠道功能紊乱、增强机体肠粘膜屏障、调节肠道内免疫系统、抗癌抗肿瘤的作 用。嗜酸乳杆菌在肠道内定殖，能激活机体巨噬活性，诱发体内特异性及非特 异性免疫反应，提高人和动物的抗感染能力。因嗜酸乳杆菌的主要代谢产物是 有机酸，可降低环境中的氧化还原电位和pH，抑制酸性细菌和需氧细菌生长。
干酪乳杆菌属于乳杆菌属，是革兰氏阳性菌，不产芽孢，无鞭毛，不运动， 兼性异型发酵乳糖，不液化明胶；最适生长温度为37℃，菌体长短不一，两端 呈方形，常成链；菌落粗糙，灰白色，有时呈微黄色，能发酵多种糖。干酪乳 杆菌存在于人的口腔、肠道中，也常常出现在牛奶和干酪、乳制品、饲料、面 团和垃圾中。干酪乳杆菌进入人体后可以在肠道内大量存活，起到调节肠内菌 群平衡、促进人体消化吸收等作用。同时，干酪乳杆菌具有高效降血压、降胆 固醇，促进细胞分裂，产生抗体免疫，增强人体免疫及预防癌症和抑制肿瘤生长等功能；还具有缓解乳糖不耐症、过敏等益生保健作用。
鼠李糖乳杆菌多存在于人和动物的肠道内，细菌分类学属于乳杆菌属，鼠 李糖亚种，是厌氧耐酸、不产芽孢的一种革兰氏阳性益生菌。鼠李糖乳杆菌不 能利用乳糖，可发酵多种单糖(葡萄糖、阿拉伯糖、麦芽糖等)，大多数菌株能 产生少量的可溶性氨，但不产生吲哚和硫化氢，它具有耐酸、耐胆汁盐、耐多 种抗生素等生物学特点。在耐胃酸和胆汁方面的性能非常突出，可以活体进入 人体肠道。
嗜热链球菌是制作酸奶的常用菌株。研究表明这种细菌只能到达小肠的上 半部，而不像双歧杆菌那样可以去到大肠。嗜热链球菌能乳糖酶，能帮助乳糖 不耐受的人们消化乳糖。
糖尿病是由遗传因素、免疫功能紊乱、微生物感染及其毒素、自由基毒素、 精神因素等等各种致病因子作用于机体导致胰岛功能减退、胰岛素抵抗等而引 发的糖、蛋白质、脂肪、水和电解质等一系列代谢紊乱综合征。糖尿病是全球 最严重的慢性病之一，长期的高血糖会导致人体发生慢性并发症，由此引起血 管、神经的慢性损伤，最终可能影响到心脏、肾脏、眼睛和神经，并造成严重 的并发症。人体必须通过肠内的关键消化酶(α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶)将 食物中的多糖类物质水解成葡萄糖才能被人体吸收，因此，抑制α-葡萄糖苷 酶就能减少身体摄入葡萄糖。α-葡萄糖苷酶是一种存在于小肠黏膜刷状缘的 低聚糖水解酶，能将低聚糖、麦芽糖等水解成葡萄糖，从而促进葡萄糖的吸收， 增加血糖含量。因此，通过抑制α-葡萄糖苷酶活性降低餐后血糖已成为糖尿 病临床干预的有效靶点。目前临床上使用的药物主要包括阿卡波糖、伏格列波 糖和米格列醇。有资料报道：乳酸杆菌在培养过程中也能产生一些α-葡萄糖 苷酶抑制剂，因此，服用乳酸杆菌既可以通过乳酸杆菌在肠道内的生长繁殖消 耗葡萄糖，又可以通过其培养过程中所产生的代谢产物(α-葡萄糖苷酶抑制剂) 来降低肠道内的葡萄糖吸收率，从而降低人体血糖。
免疫力是人体自身的防御机制，是人体识别和消灭外来侵入的任何异物 (病毒、细菌等)、处理衰老、损伤、死亡、变性的自身细胞以及识别和处理 体内突变细胞和病毒感染细胞的能力。当人体免疫功能失调，或者免疫系统不 健全时，就容易引起人体疾病，特别是引起感冒、扁桃体炎、哮喘、支气管炎、 肺炎、腹泻等疾病的反复发作。医学研究表明：肠道是人体微生物聚集最密集 的部位，也是人体最大的免疫器官。人体60％的机体免疫细胞位于肠道粘膜， 肠道菌群能促进肠道淋巴组织的成熟和免疫稳态的建立，在免疫调节中起重要 作用，也就是说：维持微生态平衡和肠道菌群健康是增加免疫能力的重要因素。 乳酸杆菌类益生菌是能在胃肠道正常生长繁殖的有益微生物，补充乳酸杆菌类 益生菌有助于恢复肠道微生态平衡，修复肠道菌膜屏障，调节全身免疫功能等， 是增强抵抗力、抗击病毒的有效措施。
革兰氏阴性菌细胞壁含有肽聚糖(PG)、脂多糖(LPS)和多糖(PS)；阳性菌 虽然没有LPS，但是含有脂磷壁酸(LTA)。这些大分子成分是细菌对宿主发挥生 理功能的主要物质基础，包括细菌对宿主细胞的黏附定植、免疫诱导、防御肿 瘤发生等。在肠道细菌增殖和死亡过程中，这些大分子成分不断向外释放，不 断刺激肠道粘膜产生免疫因子，从而对机体免疫功能产生影响。许多实验证据 均表明：乳酸杆菌类益生菌的细胞壁成分、代谢产物、菌体细胞等均可能刺激 人和动物的肠道黏膜免疫系统。
免疫力的测定方法较多，例如：NK细胞活性测定、细胞免疫功能测定、体 液免疫功能测定、单核-巨噬细胞功能测定等多种免疫功能检测方法。本发明 选用“NK细胞活性测定”或“细胞免疫功能测定”这两种方法进行免疫功能的 测定。结果表明，本发明的抗幽门螺杆菌、降血糖、调理肠胃和增加免疫力的 复合乳酸杆菌制剂具有较好的降血糖、增加免疫力的效果。
本发明中的植物乳杆菌MiuCul-01(拉丁名称：Lactobacillus plantarum)、 嗜酸乳杆菌MiuLac-01(拉丁名称：Lactobacillus acidophilus)、干酪乳杆 菌MiaoTech-01(拉丁名称：Lactobacillus casei)、鼠李糖乳杆菌MiaoTech-11 (拉丁名称：Lactobacillusrhamnosus)、嗜热链球菌MiaoPro-01(拉丁名 称：Streptococcus thermophilus)，均于2020年10月12日保存于北京市 朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管 理委员会普通微生物中心，保藏号分别为CGMCC 20865、CGMCC 20864、CGMCC 20863、CGMCC 20862、CGMCC 20861。
本发明采用“混合菌接种”、“液态培养+固液分离+固态培养”的新工艺 进行复合乳酸杆菌菌体培养，得到的复合乳酸杆菌制剂能增强其抗幽门螺杆 菌、降血糖、调理肠胃和增加免疫力的效果，获得具有更高活力的复合乳酸杆 菌菌体，同时还能保留固态培养过程中所产生的细菌素和有机酸等抗菌物质， 能抑制或杀死幽门螺杆菌和引起肠道感染的细菌，具有抗幽门螺杆菌和调理肠 胃的功能；同时，还能产生多种具有降血糖、增加免疫力的代谢产物。此外， 固态培养物水分含量较低，容易干燥，能减少复合乳酸杆菌在干燥期间的应激 死亡，结合适当的造粒、包衣工序，能大幅提高产品中复合乳酸杆菌的活力。 综合采用这些措施生产的复合乳酸杆菌制剂可增加产品的抗幽门螺杆菌、降血 糖、调理肠胃和增加免疫力等多方面的功能效果。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
(1)本发明得到的抗幽门螺杆菌、降血糖、调理肠胃和增加免疫力的复 合乳酸杆菌制剂菌体数量大且活性高，并含有乳酸杆菌所产生的代谢产物(含 有一定量的细菌素、有机酸等抑菌物质以及α-葡萄糖苷酶抑制剂、细菌多糖 等降血糖、增加免疫力的代谢产物)；生产的复合乳酸杆菌制剂在人体胃肠道 中具有更好的抑制幽门螺杆菌和调理肠胃的效果；
(2)本发明在制备过程中采用液态厌氧培养，产生的培养液经离心分离 后获得复合乳酸杆菌的湿菌体；再将湿菌体与无菌固体培养基混合，在密封状 态下进行第二次固态厌氧培养；固态培养完成后进行低温干燥而得到高活力复 合乳酸杆菌固体。
(3)本发明得到的复合乳酸杆菌制剂菌具体的具有以下优点：
①活菌数高
采用多种乳酸杆菌混合培养，且由于厌氧液态发酵后离心分离出来的 湿菌体在固态培养基中再进行一段时间的厌氧固态培养，菌体数量会大幅 增加，活力也明显增加；
②干燥应激小，菌种干燥损失小
固态培养物含水量仅为45-55％，远低于液态培养物得到的湿菌体，因 此，干燥固态培养物对其所造成的损伤和死亡率要远低于干燥液态培养物， 使发明所得到的产品活菌数能达到1011cfu/g以上；
③产品中含有菌种繁殖过程中所产生的抗菌物质多种代谢产物
在菌种固态生长繁殖的过程中会产生有机酸、细菌素等抗菌物质以及 α-葡萄糖苷酶抑制剂、细菌多糖等降血糖、增加免疫力的代谢产物。与传 统方法制成的复合乳酸杆菌制剂相比，含有抗菌、降血糖、增加免疫力的 等代谢产物的复合益生菌制剂在人体胃肠道中具有更好的抑制抗幽门螺杆 菌和、降血糖、调理肠胃的和增加免疫力等多方面的功能效果。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明的技术方 案进行详细的描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不 是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创 造性劳动的前提下所得到的所有其它实施方式，都属于本发明所保护的范围。
在一些较为具体的实施例中，所述抗幽门螺杆菌、降血糖、调理肠胃和增 加免疫力的复合乳酸杆菌制剂按重量份包括以下组分：10-15份植物乳杆菌 MiuCul-01、5-10份嗜酸乳杆菌MiuLac-01、3-7份干酪乳杆菌MiaoTech-01、 2-6份鼠李糖乳杆菌MiaoTech-11和8-12份嗜热链球菌MiaoPro-01。
在一些具体的实施例中，所述抗幽门螺杆菌、降血糖、调理肠胃和增加免 疫力的复合乳酸杆菌制剂按重量份包括以下组分：
12-13份植物乳杆菌MiuCul-01、7-8份嗜酸乳杆菌MiuLac-01、4-6份干 酪乳杆菌MiaoTech-01、3-5份鼠李糖乳杆菌MiaoTech-11和9-11份嗜热链球 菌MiaoPro-01；
制备方法包括以下步骤：
(1)按配比将植物乳杆菌MiuCul-01、嗜酸乳杆菌MiuLac-01、干酪乳杆 菌MiaoTech-01、鼠李糖乳杆菌MiaoTech-11和嗜热链球菌MiaoPro-01混合均 匀，形成复合乳酸杆菌，放入液体培养基中进行第一次厌氧培养，产生的培养 液经离心分离后获得复合乳酸杆菌湿菌体，备用；
(2)向步骤(1)得到的所述复合乳酸杆菌湿菌体与固体培养基混合，在 密封状态下进行第二次厌氧培养，培养完成后进行低温干燥或冷冻干燥或真空 干燥，形成复合乳酸杆菌固体；
(3)将步骤(2)得到的复合乳酸杆菌固体粉碎、造粒、包衣，即得所述 抗幽门螺杆菌、降血糖、调理肠胃和增加免疫力的复合乳酸杆菌制剂。
以下为更为具体的实施例：
实施例1菌株的分离、菌种特性与鉴定
1.1样品采集：
植物乳杆菌样品从泡菜中采集、分离；嗜酸乳杆菌样品从自然发酵乳制品 中采集、分离、纯化后得到；干酪乳杆菌样品从自然发酵乳制品中采集、分离、 纯化后得到；鼠李糖乳杆菌样品从本公司销售的益生菌制剂中分离、纯化后得 到；嗜热链球菌从本公司销售的酸奶发酵剂样品分离、纯化后得到。
1.2菌株的分离
1.2.1植物乳杆菌MiuCul-01的分离：
泡菜样品来自于四川农家自制泡菜。取泡菜样品5-10g，剪碎后用研钵充 分粉碎，置于无菌的50mL离心管中，加入20mL无菌生理盐水，振荡混匀后置 于30℃隔水式培养箱中，静置培养过夜，吸取1mL样液，以无菌生理盐水依次 进行10倍梯度稀释至10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6，每个梯度分别取100 μL菌悬液涂布于MRS平板上，放置于37℃厌氧培养箱中倒置培养，48h后， 从不同梯度的涂布的培养平板中挑选菌落转接培养。在此基础上，挑取符合植 物乳杆菌典型特征的菌落进行MRS平板反复划线培养分离，挑取符合植物乳杆菌菌落生长形态的单菌落接入MRS液态培养基中，于37℃厌氧培养箱中培养。 最后获得一株具有良好生长性能的菌株。
1.2.2嗜酸乳杆菌MiuLac-01的分离：
发酵乳样品来自于自然发酵的牛奶。取牛奶公司已经发酵变质的酸牛奶 5ml，置于无菌的50mL离心管中，加入20mL新鲜牛奶，振荡混匀后置于30℃ 隔水式培养箱中，静置培养过夜，吸取1mL样液，以无菌生理盐水依次进行10 倍梯度稀释至10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6，每个梯度分别取100μL菌悬 液涂布于MRS平板上，放置于37℃厌氧培养箱中倒置培养，48h后，从不同梯 度的涂布的培养平板中挑选菌落转接培养。在此基础上，挑取符合嗜酸乳杆菌 典型特征的菌落进行MRS平板反复划线培养分离，挑取符合嗜酸乳杆菌菌落生长形态的单菌落接入MRS液态培养基中，于37℃厌氧培养箱中培养。最后获得 一株具有良好生长性能的菌株。
1.2.3干酪乳杆菌MiaoTech-01的分离：
发酵乳样品来自于自然发酵的牛奶。取牛奶公司已经发酵变质的酸牛奶5ml，置于无菌的50mL离心管中，加入20mL新鲜牛奶，振荡混匀后置于30℃ 隔水式培养箱中，静置培养过夜，吸取1mL样液，以无菌生理盐水依次进行10 倍梯度稀释至10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6，每个梯度分别取100μL菌悬 液涂布于加有碳酸钙的MRS平板上，放置于37℃厌氧培养箱中倒置培养，48h 后，从不同梯度的涂布的培养平板中挑选有典型溶钙圈的单个菌落转接培养。 在此基础上，挑取符合干酪乳杆菌典型特征的菌落进行MRS平板反复划线培养分离，挑取符合干酪乳杆菌菌落生长形态的单菌落接入MRS液态培养基中，于 37℃厌氧培养箱中培养。最后获得一株具有良好生长性能的菌株。
1.2.4鼠李糖乳杆菌MiaoTech-11的分离：
在本公司销售的益生菌制剂样品中进行分离纯化。取益生菌制剂4g，置于 无菌的50mL离心管中，加入20mL无菌生理盐水，振荡混匀后置于30℃隔水式 培养箱中，静置培养过夜，吸取1mL样液，以无菌生理盐水依次进行10倍梯 度稀释至10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6，每个梯度分别取100μL菌悬液涂 布于MRS平板上，放置于37℃厌氧培养箱中倒置培养，48h后，从不同梯度的 涂布的培养平板中挑选菌落转接培养。在此基础上，挑取符合鼠李糖乳杆菌典 型特征的菌落进行MRS平板反复划线培养分离，挑取符合鼠李糖乳杆菌菌落生长形态的单菌落接入MRS液态培养基中，于37℃厌氧培养箱中培养。最后获得 一株具有良好生长性能的菌株。
1.2.5嗜热链球菌MiaoPro-01的分离：
在本公司销售的酸奶发酵剂样品中进行分离纯化。取酸奶发酵剂样品4g， 置于无菌的50mL离心管中，加入20mL无菌生理盐水，振荡混匀后置于30℃隔 水式培养箱中，静置培养过夜，吸取1mL样液，以无菌生理盐水依次进行10 倍梯度稀释至10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6，每个梯度分别取100μL菌悬 液涂布于MRS平板上，放置于37℃厌氧培养箱中倒置培养，48h后，从不同梯 度的涂布的培养平板中挑选菌落转接培养。在此基础上，挑取符合嗜热链球菌 典型特征的菌落进行MRS平板反复划线培养分离，挑取符合嗜热链球菌菌落生长形态的单菌落接入MRS液态培养基中，于37℃厌氧培养箱中培养。最后获得 一株具有良好生长性能的菌株。
1.3菌株的鉴定
1.3.1菌落形态与生理生化实验分析
菌落形态和细胞形态观测实验、微生物生化分析实验等参考文献(1)和(2)的 方法进行：
(1)凌代文，东秀珠.乳酸细菌分类鉴定及实验方法[M].北京：中国轻工 业出版社，1999；
(2)李玉峰，唐洁.工科微生物学实验[M].四川：西南交通大学出版社， 2007。
实验结果见表1、表2和表3：
表1菌落和细胞的形态特征
表2菌株的生化分析结果
注：“+”为阳性；“－”为阴性。
表3糖类发酵试验
注：“+”为阳性；“－”为阴性。
大部分都能发酵葡萄糖、蔗糖、果糖、麦芽糖、乳糖等；有些能发酵棉籽 糖、木糖、海藻糖、纤维二糖、山梨醇、甘露醇等。发酵葡萄糖时产酸、不产 气。
1.3.2 16S rRNA部分序列分析
将筛选菌株的基因组DNA进行PCR扩增，用1％琼脂糖进行凝胶电泳检测。 使用细菌通用引物27F(5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’)，1492R(5’ GGTTACCTTGTTCGACTT-3’)进行PCR扩增，纯化后测序，得到的PCR产物序列， 并进行菌种鉴定。
综合菌落形态分析、生理生化实验分析和16S rRNA部分序列分析的结果， 将本发明分离纯化所得到的5个菌株分别鉴定为：植物乳杆菌、嗜酸乳杆菌、 干酪乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、嗜热链球菌，并分别命名为“植物乳杆菌 MiuCul-01”、“嗜酸乳杆菌MiuLac-01”、“干酪乳杆菌MiaoTech-01”、“鼠 李糖乳杆菌MiaoTech-11”、“嗜热链球菌MiaoPro-01”。
实施例2菌株的特性
2.1产品中活菌数的测定方法
用灭菌生理盐水梯度稀释至一定倍数后，采用MRS琼脂培养基平板倾注法， 37℃培养48h后计菌落总数。
2.2耐酸性
将经过活化的上述5株菌种接种于MRS液体培养基中，培养后得到菌种种 子液，取1mL种子液接种于19mL pH分别为5.0、5.5和6.0的MRS液体培养 基中，在37℃下厌氧培养24h，测定初始和结束后的OD600值(即在600nm波 长处的吸光度值，通常可以用来比较培养液中的菌体细胞密度或菌体生长情 况)，以pH6.0的OD600值作对照(即以pH6.0培养的菌数为100％计)，按照下 列公式计算不同pH培养基中的菌体生长情况：
菌体生长情况(％)＝(其它pH培养的OD)/pH6.0培养的OD×100％。
结果见表4：
表4各菌种在不同pH培养基中的生长情况
结果如表4所示，在初始pH5.0和5.5的培养基中培养得到的菌液，与pH6.0 的培养基培养的菌液OD值相比，有一定程度的降低，但与不进行培养的空白 对照组比较，仍然具有较高的生长速率。因此，各菌种在pH5.0、5.5较低pH 环境下仍然具有一定的生长能力。
将上述在pH6.0条件培养的各菌种，经过离心分离、磷酸缓冲液(PBS)洗 涤2次后用PBS重悬。取1mL重悬液分别与9mL pH2.0、2.5、3.0人工胃液混 合，在37℃处理3h，然后分别测定处理前后的乳酸杆菌总数。
以未经人工胃液处理的菌数作对照，按照下列公式计算人工胃液处理前后 的存活率：
存活率(％)＝(处理前的菌数-处理后的菌数)/处理前的菌数×100％。
结果见表5：
表5各菌种在不同pH人工胃液处理后的存活率
结果如表5所示，在pH6.0培养得到的菌体，经过不同pH的人工胃液处 理后，存活率为75％以上，仍然具有较高的存活率，因此，能够在正常的食用 条件下以活菌形式进入肠道。
各菌种在pH5.0以上的环境下培养生长良好，最适pH为6.0。在pH6.0培 养得到的菌体，置于pH2.0的人工胃液中3h仍然具有较高的存活率。
2.3耐温性
将经过活化的各菌种接种于MRS液体培养基中，培养后得到菌种种子液， 取1mL各菌种种子液接种于19mL pH分别为3.0的MRS液体培养基中，分别在 31℃、34℃、37℃、40℃的温度下厌氧培养24h，测定初始和结束后的OD600 值。
以最适生长温度时的OD600值作对照(即以生长速度最大时培养的菌数为 100％计)，按照下列公式计算不同温度的菌体生长情况：
菌体生长情况(％)＝其它温度时培养的菌数/最适生长温度时培养的菌数 ×100％。
根据实验，植物乳杆菌的最适生长温度为34℃，嗜酸乳杆菌、干酪乳杆菌 和鼠李糖乳杆菌的最适生长温度为37℃，其不同温度下的生长情况见见表6：
表6各菌种在不同温度下的生长情况
而嗜热链球菌耐温性较高，其最适生长温度为45℃，因此，嗜热链球菌再 不同温度时的生长情况见表7：
表7嗜热链球菌在不同温度下的生长情况
综合表6和表7的实验结果，可以得出如下的结论：
植物乳杆菌在34℃的温度下培养得到的菌体数量最高，在其它的温度条件 下，与34℃的温度相比，培养产生的菌数较少，但与不进行培养的对照相比， 仍然具有较高的生长速率。因此，植物乳杆菌MiuCul-01的最适生长温度为 34℃，其在31～40℃温度环境下生长良好，具有在良好的耐温性；
嗜酸乳杆菌、干酪乳杆菌和鼠李糖乳杆菌的最适生长温度为37℃，具有与 人体体温类似的最适生长温度。其在31～40℃温度环境下也生长良好，具有在 良好的耐温性；
嗜热链球菌的最适生长温度为45℃，其在36～48℃温度环境下生长良好， 属于耐高温的菌种。
综上所述：本发明所分离纯化的上述5种菌株在pH6.0时生长良好，在 pH5.0时仍然能缓慢生长；最适生长温度：嗜酸乳杆菌MiuLac-01、干酪乳杆 菌MiaoTech-01、鼠李糖乳杆菌MiaoTech-11等均为37℃；而植物乳杆菌 MiuCul-01为34℃；嗜热链球菌MiaoPro-01为45℃。
2.4各菌株的功能效果
本发明对上述菌株进行了一系列的功能实验，确认了各菌株的功能效果。
2.4.1植物乳杆菌的抗幽门螺杆菌效果
参考文献的方法(喻钢等.体外拮抗幽门螺杆菌抑菌方法的研究.药物分 析杂志.2014(10))，采用体外抑菌试验(打孔法)进行植物乳杆菌的抗幽门 螺杆菌实验。
2.4.2嗜酸乳杆菌的降血糖效果
参考文献的方法(朱运平等.产α-葡萄糖苷酶抑制剂菌株筛选及固态发 酵条件优化.食品工业科技.2014(3))，测定了嗜酸乳杆菌的α-葡萄糖苷酶 抑制率，从而推测其具有降血糖作用，在此基础上，进一步采用人体试验确认 了其降血糖的效果。
2.4.3干酪乳杆菌的调理肠胃功能效果
参考文献的方法(范治云等.全蝎保健酒的增强免疫力功能研究.食品研 究与开发.2017(19))，采用人体试验的方法，确认了干酪乳杆菌的调理肠胃 功能的效果。
2.4.4鼠李糖乳杆菌和嗜热链球菌的增加人体免疫力的功能效果
参考文献的方法(范治云等.全蝎保健酒的增强免疫力功能研究.食品研 究与开发.2017(19))，采用小鼠NK细胞活性和对ConA诱导的小鼠脾淋巴细 胞转化反应，确认了鼠李糖乳杆菌和嗜热链球菌具有增加人体免疫力功能的效 果。
实验结果见表8：
表8各菌株的功效实验方法及结果
实施例3液态法制备的复合乳酸杆菌原粉及其制剂
3.1培养基
(1)MRS固体培养基(用于斜面培养和平板培养)：
葡萄糖20g/L、蛋白胨10g/L、牛肉浸膏10g/L、酵母浸膏5g/L、琼脂15g/L、 K2HP042g/L、柠檬酸氢二铵2g/L、乙酸钠5g/L、Tween-80 1g/L、MgS04·7H20 0.5g/L、MnS04·4H200.05g/L，用1mol/L NaOH调节pH为7.0，121℃高温 杀菌20min。
(2)MRS液体培养基(用于三角瓶培养和发酵罐培养)：
葡萄糖20g/L、蛋白胨10g/L、牛肉浸膏10g/L、酵母浸膏5g/L、乳清粉 10g/L、番茄酱10g/L、K2HP04 2g/L、柠檬酸氢二铵2g/L、乙酸钠5g/L、Tween-80 1g/L、MgS04·7H200.5g/L、MnS04·4H20 0.05g/L，用1mol/L NaOH调节pH 为7.0，121℃高温杀菌20min。
3.2菌剂的制备方法
本发明的复合乳酸杆菌菌剂的制备方法，包括以下步骤：
(1)菌种培养：
使用上述MRS固体培养基进行菌种的斜面培养或平板培养，所使用的菌种 包括：
植物乳杆菌MiuCul-01、嗜酸乳杆菌MiuLac-01、干酪乳杆菌MiaoTech-01、 鼠李糖乳杆菌MiaoTech-11、嗜热链球菌MiaoPro-01等5种。
(2)三角瓶培养或菌种罐培养：
将斜面或平板培养得到的各菌种分别接种于三角瓶MRS液体培养基中，于 厌氧培养箱中在37℃下培养24h得到三角瓶液体菌种。
(3)液态培养：
按照“某种菌种液:液体培养基＝1:100”的比例接种上述5种菌种，全部 接种于发酵罐，这样总接种量为5:100，在发酵罐中37℃下厌氧液态培养24h， 获得菌体培养液；
(4)离心分离：
将上述液态培养液用管式离心机或碟式离心机进行分离，离心机转速为 10000r/min，离心时间为20min，得到湿菌体，水分含量为80％；
(5)干燥
将湿菌体置于冷冻干燥机中在-40℃冷冻干燥20h即得到液态法复合乳酸 杆菌原粉；经测定：本发明制备所得的复合乳酸杆菌原粉产品，其总菌数为5.65 ×1011CFU/g。
(6)造粒、包衣和包装。
在乳酸杆菌原粉中加入适量的辅料(如：海藻糖、脱脂奶粉等)，即得到 液态法制备的复合乳酸杆菌制剂产品；
经测定：本实例所制备的复合乳酸杆菌制剂产品，其总菌数为4.16× 1011CFU/g。
实施例4制备的复合乳酸杆菌原粉及其制剂(固态法1)
4.1培养基
(1)MRS固体培养基(用于斜面培养和平板培养)：
葡萄糖20g/L、蛋白胨10g/L、牛肉浸膏10g/L、酵母浸膏5g/L、琼脂15g/L、 K2HP042g/L、柠檬酸氢二铵2g/L、乙酸钠5g/L、Tween-80 1g/L、MgS04·7H20 0.5g/L、MnS04·4H200.05g/L，用1mol/L NaOH调节pH为7.0，121℃高温 杀菌20min。
(2)MRS液体培养基(用于三角瓶培养和发酵罐培养)：
葡萄糖20g/L、蛋白胨10g/L、牛肉浸膏10g/L、酵母浸膏5g/L、番茄酱 10g/L、K2HP04 2g/L、柠檬酸氢二铵2g/L、乙酸钠5g/L、Tween-80 1g/L、 MgS04·7H20 0.5g/L、MnS04·4H20 0.05g/L，用1mol/L NaOH调节pH为7.0， 121℃高温杀菌20min。
(3)固体培养的培养基(用于固态培养)：
按照下列配方的比例准备固态培养的原料：
湿菌体100g、葡萄糖20g、蛋白胨粉10g、酵母浸出物粉10g、乳清粉10g、 番茄粉10g、K2HP04 2g、食品级碳酸钙2g。
除了湿菌体外，其余各种原料分别杀菌(分别用高温瞬时杀菌设备在150℃ 杀菌10s)，冷却后无菌混合均匀，作为固态培养基的原料备用。
4.2菌剂的制备方法
本发明的复合乳酸杆菌菌剂的制备方法，包括以下步骤：
(1)菌种培养：
使用上述MRS固体培养基进行菌种的斜面培养或平板培养。
(2)三角瓶培养或菌种罐培养：
将斜面或平板培养得到的菌种接种于三角瓶MRS液体培养基中，于厌氧培 养箱中在37℃下培养24h得到三角瓶液体菌种，
(3)液态培养：
采用上述三角瓶液体菌种或种子罐液体菌种接种于发酵罐，在发酵罐中 37℃下厌氧液态培养24h，获得菌体培养液；
(4)离心分离：
将上述液态培养液用管式离心机或碟式离心机进行分离，离心机转速为 10000r/min，离心时间为20min，得到湿菌体，水分含量为80％；立即将湿菌 体转入固态培养基培养；
(5)固态培养：
在无菌室按照配方将上述湿菌体与无菌的固态培养基混合，其配方为：
湿菌体100g、葡萄糖20g、蛋白胨粉10g、酵母浸出物粉10g、乳清粉10g、 番茄粉10g、K2HP04 2g、食品级碳酸钙2g，控制固体培养基的水分含量为 50％-55％。然后置于厌氧固态发酵罐中，在37℃下密封厌氧固态培养72h。
(6)干燥：
在-40℃下冷冻干燥20h，即得到复合乳酸杆菌原粉。
经测定：本发明制备所得的复合乳酸杆菌原粉产品，其总菌数为5.98× 1011CFU/g。
(7)造粒、包衣和包装。
将复合乳酸杆菌原粉造粒、包衣，即得到复合乳酸杆菌制剂产品。
经测定：本实例所制备的复合乳酸杆菌制剂产品，其总菌数为4.88× 1011CFU/g。
实施例5制备的复合乳酸杆菌制剂(固态法2)
实施例5的工艺操作与实施例4基本相同，仅更改部分操作参数，用于说 明在不同的操作条件下生产的固态培养复合乳酸杆菌产品的效果。
5.1培养基
在实施例4的固体培养基的基础上增加乳清粉10g，其他同实施例4。
5.2菌剂的制备方法
实施例5控制固体培养基的水分含量为52％，在37℃下密封厌氧固态培养 96h。采用冷冻干燥方法对固体培养物进行干燥，其他步骤同实施例4，分别制 成原粉产品和制剂产品。
经测定：本实施例所制备的复合乳酸杆菌原粉产品总菌数为6.34×1011CFU/g；将其制成制剂所得到的制剂产品的总菌数为5.35×1011CFU/g。
实施例6制备的复合乳酸杆菌制剂(固态法3)
6.1培养基
实施例6培养基同实施例4。
6.2菌剂的制备方法
三角瓶培养、液体培养和固体培养的温度为37℃，控制固体培养基的水分 含量为55％，在37℃下密封厌氧固态培养120h，其他参数同实施例4，分别制 成原粉产品和制剂产品。
经测定：本实施例所制备的复合乳酸杆菌原粉产品总菌数为5.92× 1011CFU/g；将其制成制剂所得到的制剂产品的总菌数为5.06×1011CFU/g。
本发明的制备方法中，若发酵罐培养基较大，可将三角瓶液体菌种再接种 于1-3级菌种罐中扩大培养，从而获得用于发酵罐的液体菌种，小规模培养则 直接只用三角瓶培养的菌种进行接种。
实施例7复合乳酸杆菌的功能效果
7.1复合乳酸杆菌的抗幽门螺杆菌功能效果
参考文献的方法(喻钢等.体外拮抗幽门螺杆菌抑菌方法的研究.药物分 析杂志.2014(10))，采用体外抑菌试验(打孔法)进行植物乳杆菌的抗幽门 螺杆菌实验。
7.1.1相同重量浓度下产品的抗幽门螺杆菌效果对比
分别称取上述各组样品各1g，加入10mL无菌水，配成0.1g/mL的复合乳 酸杆菌溶液，备用。
用测量抑菌环直径大小，判断复合乳酸杆菌对HP的抑菌效果，结果以“平 均值±标准差”来表示，结果见表9：
表9相同重量浓度下不同工艺生产的复合乳酸杆菌产品的抗幽门螺杆菌效果
如表9所示：
对于复合乳酸杆菌原粉产品，本发明实施例4采用固态法所制备的复合乳 酸杆菌原粉的抑菌圈较实施例3采用液态法所制备的复合乳酸杆菌原粉的抑菌 圈更大。
对于复合乳酸杆菌制剂产品，本发明实施例4、5、6采用固态法所制备的 乳酸杆菌制剂的抑菌圈比采用液态法所制备的复合乳酸杆菌制剂的抑菌圈更 大；采用SPSS 24.0软件对实验数据进行单因素方差分析(ANOVA)，用LSD法 进行多重比较，以P<0.05为差异显著性判断标准，结果表明本发明的制备方 法得到的复合乳酸杆菌菌剂的抗幽门螺杆效果更明显。
7.1.2相同菌数时产品的抗幽门螺杆菌效果对比
分别称取复合乳酸杆菌成品1g，加入适量无菌水，经菌数测定后，加入无 菌水调整复合乳酸杆菌总数浓度为1x1010CFU/ml，每次服用10ml，故每次服用 的复合乳酸杆菌总数为10x1010CFU，即1x1011CFU。
抗幽门螺杆菌的实验方法见7.1.1。
测量抑菌环直径大小，判断复合乳酸杆菌对HP的抑菌效果，结果以“平 均值±标准差”来表示。结果见表10：
表10相同菌数时复合乳酸杆菌产品的抗幽门螺杆菌效果
如表10所示，当制剂中含有相同菌数时，4、5、6制备所得的菌剂的抑菌 圈较利用液态法所得菌剂的抑菌圈更大；采用SPSS 24.0软件对实验数据进行 单因素方差分析(ANOVA)，用LSD法进行多重比较，以P<0.05为差异显著性判 断标准，结果表明本发明制备方法所得菌剂的抗幽门杆菌效果，较液态法有显 著性差异。
复合乳酸杆菌对于幽门螺杆菌的抑制作用，如果仅仅是活菌的效果，那么 当采用相同的菌数时应该具有大致相同的抑制效果，但表10的结果表明：与 液态法所制备的复合乳酸杆菌菌剂相比，本发明的实施例4、5、6采用固态法 制备的复合乳酸杆菌菌剂的抑菌圈更大，说明其抗幽门螺杆菌的效果更明显。 液态法在制备过程中由于离心分离去除了液态培养过程所产生的代谢产物，所 以其抑菌效果主要来自于菌种本身；而本发明制备所得菌剂中除了含有复合乳 酸杆菌具体外，还含有固态培养过程中所产生的细菌素、有机酸等代谢产物， 复合乳酸杆菌与代谢产物协同增效，提高了菌剂整体的抗幽门螺杆菌效果。
7.1.3复合乳酸杆菌制剂治疗幽门杆菌感染的效果
将180名被诊断患有幽门螺杆菌感染的患者随机分成6组，每组30名。
空白对照组或安慰剂组采用未加药的空白淀粉片进行治疗，每天2次，每 次1袋，每袋2克，持续4周。
阳性实验组采用标准三联疗法治疗，奥美拉唑(0.8mg/kg.d)胶囊、阿莫西 林(50mg/kg.d)、克林霉素(15mg/kg.d)治疗2周，两周后停用抗生素，继续服 用奥美拉唑2周，总疗程4周。
液态法对照组采用传统的液态培养法制备复合乳酸杆菌，经离心分离后干 燥制备的复合乳酸杆菌菌体制剂，进行治疗，每天3次，每次1袋，每袋2克， 持续4周。
实施例组共分3组，分别口服实施例1-3中的制剂进行治疗，每天3次， 每次1袋，每袋2克，持续4周。
用药期间通过问诊来确定是否有不良反应。停药两周后，通过14C-尿素呼 气试验来评估治愈情况。结果见表11：
表11不同工艺生产的复合乳酸杆菌对幽门螺杆菌感染的治疗效果
说明：病人症状完全消失为治愈；症状有好转的为有效；症状没有好转的 为无效。
由表11可知，与传统的液态法制备所得菌剂相比，本发明的实施例4、5、 6的复合乳酸杆菌菌剂对幽门杆菌的总有效率更高，说明本发明制备的菌剂对 抗幽门杆菌的效果更显著。
7.2复合乳酸杆菌的降血糖功能效果
复合乳酸杆菌降血糖效果既可通过测定其α-葡萄糖苷酶抑制率来测定， 也可通过人体实验进行测定。
7.2.1相同重量浓度下产品的α-葡萄糖苷酶抑制效果对比
α-葡萄糖苷酶抑制率的测定参考文献的方法(朱运平等.产α-葡萄糖苷 酶抑制剂菌株筛选及固态发酵条件优化.食品工业科技.2014(3))。
分别称取上述各组样品各1g，加入10mL无菌水，配成0.1g/mL的复合乳 酸杆菌溶液，备用。PNPG法测定各组样品对α-葡萄糖苷酶的抑制效果，从而 判断复合乳酸杆菌的降血糖效果，结果以“平均值±标准差”来表示，详见表 12：
表12相同重量浓度下不同工艺生产的复合乳酸杆菌产品的α-葡萄糖苷酶抑 制效果
如表12所示：
对于复合乳酸杆菌原粉产品，比较了液态法和固态法(1)制备的复合乳酸 杆菌原粉的α-葡萄糖苷酶抑制效果，说明二者均具有一定的α-葡萄糖苷酶抑 制效果，但采用固态法制备的复合乳酸杆菌原粉具有更好的α-葡萄糖苷酶抑 制效果。
当复合乳酸杆菌原粉制成制剂之后，由于制剂工艺过程需要添加一些辅 料，并且制剂过程对复合乳酸杆菌有一定的损伤，因而其α-葡萄糖苷酶抑制 效果会略有损失，结果见表12。
对于制剂产品，液态法和三种固态法制备的复合乳酸杆菌制剂的α-葡萄 糖苷酶抑制效果也有明显的差异。固态法制备的复合乳酸杆菌制剂(实施例4、 5、6)与传统液态法制备的复合乳酸杆菌制剂(实施例3)相比，固态法制备的复 合乳酸杆菌制剂的α-葡萄糖苷酶抑制率更大，说明通过本发明的固态培养法 制备的复合乳酸杆菌制剂，其α-葡萄糖苷酶抑制效果比液态法制备的复合乳 酸杆菌制剂更明显。
上述实验结果，实际上是测定样品的α-葡萄糖苷酶活性与α-葡萄糖苷酶 标准品的活性之间的差异，即规定不含样品的缓冲液的α-葡萄糖苷酶抑制率 为0，而将样品的α-葡萄糖苷酶抑制率规定为样品与对照之间的吸光度的差值 百分比。需要说明的是：为简化测定程序，本发明未设置阳性对照，即未使用 阳性的α-葡萄糖苷酶抑制剂阿卡波糖或DNJ作为对照，也未扣除样品背景， 所以所测定的抑制率可能与实际略有差异，但由于差异不大，所以表12的结 果对于了解复合乳酸杆菌样品的对α-葡萄糖苷酶的抑制效果仍然具有良好的 参考价值。
根据表12的实验结果，本发明的复合乳酸杆菌产品比传统的液态法复合 乳酸杆菌产品具有更好的α-葡萄糖苷酶抑制率，因此，可以得出结论本发明 的产品具有比液态法生产的复合乳酸杆菌产品具有更好的降血糖效果。
7.2.2相同菌数时产品的α-葡萄糖苷酶抑制效果对比
分别称取复合乳酸杆菌成品1g，加入适量无菌水，经菌数测定后，加入无 菌水调整复合乳酸杆菌总数浓度为1x1010CFU/ml，每次服用10ml，故每次服用 的复合乳酸杆菌总数为10x1010CFU，即1x1011CFU。
按照实施例7.2.1类似的试验方法，测定相同菌数的实施例样品对α-葡 萄糖苷酶的抑制效果，结果以“平均值±标准差”来表示，详见表13：
表13相同菌数时制剂产品的α-葡萄糖苷酶抑制效果
如表13所示，实施例3为液态法制备的制剂产品对α-葡萄糖苷酶的抑制 效果，而实施例4、5、6则分别为3种固态法制备的制剂产品对α-葡萄糖苷 酶的抑制效果。
复合乳酸杆菌对α-葡萄糖苷酶的抑制作用，如果仅仅是活菌的效果，那 么当采用相同的菌数时应该具有大致相同的抑制效果，但表13的结果表明： 与液态法所制备的复合乳酸杆菌制剂相比，本发明的实施例4、5、6采用固态 法制备的复合乳酸杆菌制剂具有更大的α-葡萄糖苷酶的抑制率，说明其降血 糖的效果更明显。液态法制剂在制备过程中由于离心分离去除了液态培养过程 所产生的代谢产物，所以其抑菌效果主要来自于菌种本身；而本发明制备所得 固态法制剂中除了含有复合乳酸杆菌菌体外，还含有固态培养过程中所产生的 α-葡萄糖苷酶抑制剂等代谢产物，复合乳酸杆菌与代谢产物协同增效，提高 了菌剂整体的α-葡萄糖苷酶抑制效果。
7.2.3验证对高血糖的治疗效果
根据上述实施例3-6所得到的制剂产品，进行了产品的降血糖实验，实验 方案及实验结果如下：
实验材料与方法：
受试对象：选择空腹血糖≥7.8mmol/L的二型糖尿病患者作为实验对象， 将180名被诊断患有成人二型糖尿病的患者随机分成6组，每组30名。
空白对照组或安慰剂组：采用未加药的空白淀粉制剂进行治疗，每天3次， 每次1袋，每袋2克，持续4周。
阳性实验组：采用阿卡波糖治疗，75mg/d，分三次服用，每次25mg，治疗 4周。
液态法对照组：实施例3采用传统的液态发酵法发酵复合乳酸杆菌，经离 心分离后干燥制备的复合乳酸杆菌菌体制剂进行治疗，每天3次，每次1袋， 每袋2克，持续4周。
实施例组：共分3组，分别口服实施例4-6中的一种制剂进行治疗，每天 3次，每次1袋，每袋2克，持续4周。
用药期间通过问诊来确定是否有不良反应。
实验结果：
表14不同工艺生产的复合乳酸杆菌制剂的降血糖效果(空腹血糖值，mmol/L)
| 实施例 | 实验前(0天) | 第7天 | 第14天 | 第21天 | 第28天 |
| 空白对照 | 8.0±0.2 | 8.0±0.3 | 8.0±0.2 | 7.9±0.2 | 8.2±0.2 |
| 阳性对照 | 8.0±0.2 | 7.6±0.5 | 7.1±0.4 | 6.3±0.3 | 5.0±0.3 |
| 实施例3 | 8.0±0.4 | 7.7±0.2 | 7.5±0.3 | 7.5±0.3 | 7.2±0.4 |
| 实施例4 | 8.0±0.3 | 7.6±0.3 | 6.6±0.5 | 6.5±0.3 | 6.0±0.2 |
| 实施例5 | 8.1±0.2 | 7.5±0.2 | 6.4±0.3 | 5.3±0.4 | 5.0±0.2 |
| 实施例6 | 7.9±0.2 | 7.6±0.3 | 6.5±0.3 | 6.3±0.3 | 5.8±0.2 |
表15不同工艺生产的复合乳酸杆菌制剂的降血糖效果(餐后2h血糖值， mmol/L)
| 实施例 | 实验前(0天) | 第7天 | 第14天 | 第21天 | 第28天 |
| 空白对照 | 13.0±0.3 | 13.8±0.5 | 13.2±0.5 | 13.5±0.3 | 13.9±0.5 |
| 阳性对照 | 12.9±0.5 | 11.8±0.5 | 8.2±0.3 | 7.5±0.4 | 7.0±0.3 |
| 实施例3 | 13.0±0.3 | 12.6±0.5 | 10.6±0.3 | 10.1±0.2 | 9.6±0.5 |
| 实施例4 | 13.1±0.4 | 12.0±0.5 | 9.3±0.3 | 8.5±0.3 | 7.8±0.2 |
| 实施例5 | 12.9±0.3 | 11.5±0.3 | 8.3±0.2 | 7.8±0.5 | 7.0±0.2 |
| 实施例6 | 13.0±0.3 | 11.8±0.5 | 9.1±0.3 | 8.6±0.5 | 7.8±0.4 |
在表14、表15中，实施例3是液态法制备的复合乳酸杆菌制剂，而实施 例4、5、6则是采用不同工艺参数的固态培养法制备的复合乳酸杆菌制剂。由 表15可知：与传统的液态法制备所得制剂相比，本发明的实施例4、5、6的 复合乳酸杆菌制剂对空腹血糖和餐后血糖均具有良好的治疗效果，说明固态法 制备的复合乳酸杆菌制剂对高血糖的治疗效果更显著。
综上所述，采用本发明所制备的复合乳酸杆菌制剂，具有良好的降血糖作 用，其效果优于液态法复合乳酸杆菌制剂，虽然略低于常用的降血糖药物--阿 卡波糖，但由于其副作用小，且复合乳酸杆菌制剂还具有调节肠道、增加免疫 力等其它效果，且不受药品剂量限制。因此，可将复合乳酸杆菌作为糖尿病人 的辅助调理用品，协助其它降血糖药物发挥降血糖的作用。
7.3复合乳酸杆菌的调理肠胃功能效果
7.3.1复合乳酸杆菌的治疗腹泻效果
选取上述实施例3-6所得到的复合乳酸杆菌原粉和制剂产品，分别进行了 产品的调理肠胃实验，本实施例是治疗腹泻的实验，实验方案及实验结果如下：
7.3.1.1相同重量时产品的治疗腹泻效果对比
以实施例3(传统液态培养)所制备的复合乳酸杆菌原粉或制剂产品作为对 照，选取实施例4-6(三种固态培养法)所制备的复合乳酸杆菌原粉或制剂产 品对治疗腹泻的功效进行比较。
分别选取150名具有腹泻问题的成人服用，随机分为6组，每组25人。每 组分配的受试人员年龄、性别、身体状况基本一致。分别服用实施例或对照例 的复合乳酸杆菌成品，2g/次，3次/日，口服14日。口服期间饮食如常，不服 用其它乳酸菌饮料或药物。
观察服用后的效果：治疗后腹泻等伴随症状完全消失为特效；腹泻等伴随 症状改善为有效；腹泻等伴随症状没有改善为无效。结果以“平均值±标准差” 来表示，详见表16：
实验结果：
表16相同重量时不同工艺生产的复合乳酸杆菌对腹泻的治疗效果
对于原粉产品，比较了液态法和固态法(1)制备的复合乳酸杆菌原粉的治 疗腹泻效果，说明二者均具有良好的治疗腹泻效果，但采用固态法制备的复合 乳酸杆菌原粉治疗腹泻效果更好。
当复合乳酸杆菌原粉制成制剂之后，由于制剂工艺过程需要添加一些辅 料，并且制剂过程对复合乳酸杆菌有一定的损伤，因而其治疗效果会略有损失。
对于不同方法制备的制剂产品，液态法和三种固态法制备的复合乳酸杆菌 制剂的治疗腹泻效果也有明显的差异。固态法制备的复合乳酸杆菌制剂(实施 例4、5、6)与传统液态法制备的复合乳酸杆菌制剂(实施例3)相比，固态法制 备的复合乳酸杆菌制剂的治疗腹泻效果更好。
综上所述，根据表15、表16的实验结果，本发明采用固态培养法制备的 复合乳酸杆菌产品比传统的液态法制备的复合乳酸杆菌产品具有更好的治疗 腹泻效果。
7.3.1.2相同菌数时制剂产品的治疗腹泻效果对比
分别称取复合乳酸杆菌制剂成品1g，加入适量无菌水，经菌数测定后，加 入无菌水调整复合乳酸杆菌总数浓度为1x1010CFU/ml，每次服用10ml，故每次 服用的复合乳酸杆菌总数为10x1010CFU，即1x1011CFU。
按照实施例7.3.1类似的试验方法，测定相同菌数的实施例样品对腹泻的 治疗效果，结果以“平均值±标准差”来表示，详见表17：
表17相同菌数时不同工艺生产的复合乳酸杆菌制剂产品对腹泻的治疗效果
如表17所示，实施例3为液态法制备的制剂产品的治疗腹泻效果，而实 施例4、5、6则分别为3种固态法制备的制剂产品的治疗腹泻效果。
复合乳酸杆菌的治疗腹泻效果，如果仅仅是活菌的效果，那么当采用相同 的菌数时应该具有大致相同的治疗效果，但表16、表17的结果表明：与液态 法所制备的复合乳酸杆菌制剂相比，本发明的实施例4、5、6采用固态法制备 的复合乳酸杆菌制剂具有更大的治疗腹泻效果。液态法制剂在制备过程中由于 离心分离去除了液态培养过程所产生的代谢产物，所以其抑菌效果主要来自于 菌种本身；而本发明制备所得固态法制剂中除了含有复合乳酸杆菌菌体外，还 含有固态培养过程中所产生的细菌素、有机酸等具有抑菌作用的代谢产物，复 合乳酸杆菌与代谢产物协同增效，提高了菌剂整体的治疗腹泻效果。
7.3.2效果对比试验(治疗便秘的效果)
选取上述实施例3-6所得到的复合乳酸杆菌原粉和制剂产品，分别进行了 产品的治疗便秘的实验，实验方案及实验结果如下：
7.3.2.1相同重量时产品的治疗便秘效果对比
以实施例3(传统液态培养)所制备的复合乳酸杆菌原粉或制剂产品作为对 照，选取实施例4-6(三种固态培养法)所制备的复合乳酸杆菌原粉或制剂产 品治疗便秘的功效进行比较。
分别选取150名具有便秘问题的成人服用，随机分为6组，每组25人。每 组分配的受试人员年龄、性别、身体状况基本一致。分别服用实施例或对照例 的复合乳酸杆菌成品，2g/次，3次/日，口服14日。口服期间饮食如常，不服 用其它乳酸菌饮料或药物。
观察服用后的效果：治疗后便秘等症状完全消失为特效；便秘等症状改善 为有效；便秘等症状没有改善为无效。结果如下：
实验结果：
表18相同重量的复合乳酸杆菌对便秘的治疗效果
结果如表18所示：
对于原粉产品，比较了液态法和固态法(1)制备的复合乳酸杆菌原粉的治 疗便秘效果，说明二者均具有良好的治疗便秘效果，但采用固态法制备的复合 乳酸杆菌原粉治疗便秘效果更好。
当复合乳酸杆菌原粉制成制剂之后，由于制剂工艺过程需要添加一些辅 料，并且制剂过程对复合乳酸杆菌有一定的损伤，因而其治疗效果会略有损失。
对于不同方法制备的制剂产品，液态法和三种固态法制备的复合乳酸杆菌 制剂的治疗便秘效果也有明显的差异。固态法制备的复合乳酸杆菌制剂(实施 例4、5、6)与传统液态法制备的复合乳酸杆菌制剂(实施例3)相比，固态法制 备的复合乳酸杆菌制剂的治疗便秘效果更好。
综上所述，根据表18的实验结果，本发明采用固态培养法制备的复合乳 酸杆菌产品比传统的液态法制备的复合乳酸杆菌产品具有更好的治疗便秘效 果。
7.3.2.2相同菌数时制剂产品的治疗便秘效果对比
分别称取复合乳酸杆菌制剂成品1g，加入适量无菌水，经菌数测定后，加 入无菌水调整复合乳酸杆菌总数浓度为1x1010CFU/ml，每次服用10ml，故每次 服用的复合乳酸杆菌总数为10x1010CFU，即1x1011CFU。
按照实施例8.1类似的试验方法，测定相同菌数的实施例制剂样品对便秘 的治疗效果，结果以“平均值±标准差”来表示，详见表19：
表19相同菌数时不同工艺生产的复合乳酸杆菌制剂产品对便秘的治疗效果
如表19所示，实施例3为液态法制备的制剂产品的治疗便秘效果，而实 施例4、5、6则分别为3种固态法制备的制剂产品的治疗便秘效果。
复合乳酸杆菌的治疗便秘效果，如果仅仅是活菌的效果，那么当采用相同 的菌数时应该具有大致相同的治疗效果，但表19的结果表明：与液态法所制 备的复合乳酸杆菌制剂相比，本发明的实施例4、5、6采用固态法制备的复合 乳酸杆菌制剂具有更大的治疗便秘效果。液态法制剂在制备过程中由于离心分 离去除了液态培养过程所产生的代谢产物，所以其抑菌效果主要来自于菌种本 身；而本发明制备所得固态法制剂中除了含有复合乳酸杆菌菌体外，还含有固 态培养过程中所产生的细菌多糖以及菌体细胞碎片等代谢产物，复合乳酸杆菌 与代谢产物协同增效，提高了菌剂整体的治疗便秘效果。
综上所述，复合乳酸杆菌具有良好的双向调理肠胃功效，即可以治疗腹泻， 又可以治疗便秘。
7.4复合乳酸杆菌的提高免疫力功能效果
7.4.1相同重量浓度时复合乳酸杆菌产品对小鼠NK细胞活性的影响
参考文献的方法(范治云等.全蝎保健酒的增强免疫力功能研究.食品研 究与开发.2017(19))，采用小鼠NK细胞活性和对ConA诱导的小鼠脾淋巴细 胞转化反应，确认了鼠李糖乳杆菌和嗜热链球菌具有增加人体免疫力功能的效 果。
复合乳酸杆菌制剂对小鼠NK细胞活性的影响实验结果见表20：
表20相同重量浓度时复合乳酸杆菌产品对小鼠NK细胞活性的影响
注：NK细胞活性转换值＝sin-1(A1/2)
由表20的结果可以看出：
与阴性对照相比，由实施例3和实施例4生产的复合乳酸杆菌原粉对小鼠 NK细胞活性具有特别显著的效果。
与阴性对照相比，由实施例3、实施例4、实施例5和实施例6等生产的复 合乳酸杆菌制剂对小鼠NK细胞活性具有特别显著的效果。并且由固态发酵法 实施例4-6制备的复合乳酸杆菌制剂对小鼠NK细胞活性具有特别显著的效果 比实施例3制备的制剂效果更好。
7.4.1.2相同菌数时制剂产品对小鼠NK细胞活性的影响
试验方法同实施例7.4.1。
分别称取复合乳酸杆菌制剂成品1g，加入适量无菌水，经菌数测定后，加 入无菌水调整复合乳酸杆菌总数浓度为1x1010CFU/ml，每次灌服10ml，故每次 服用的复合乳酸杆菌总数为10x1010CFU，即1x1011CFU。
按照实施例7.4.1类似的试验方法，测定相同菌数的实施例样品对小鼠NK 细胞活性的影响，结果以“平均值±标准差”来表示，详见表21：
表21相同菌数时制剂产品对小鼠NK细胞活性的影响
注：NK细胞活性转换值＝sin-1(A1/2)
如表21所示，实施例3为液态法制备的制剂产品对小鼠NK细胞活性的影 响，而实施例4、5、6则分别为3种固态法制备的制剂产品对小鼠NK细胞活 性的影响。
复合乳酸杆菌对小鼠NK细胞活性的影响，如果仅仅是活菌的效果，那么 当采用相同的菌数时应该具有大致相同的效果，但表5的结果表明：与液态法 所制备的复合乳酸杆菌制剂相比，本发明的实施例4、5、6采用固态法制备的 复合乳酸杆菌制剂对小鼠NK细胞活性具有更大的影响，说明其增强免疫力的 效果更明显。液态法制剂在制备过程中由于离心分离去除了液态培养过程所产 生的代谢产物，所以其增强免疫力的效果主要来自于菌种本身；而本发明制备 所得固态法制剂中除了含有复合乳酸杆菌菌体外，还含有固态培养过程中所产 生的细菌多糖等代谢产物，复合乳酸杆菌与代谢产物协同增效，提高了菌剂整体对小鼠NK细胞活性的影响。
7.4.2复合乳酸杆菌对ConA诱导的小鼠脾淋巴细胞转化反应的影响
7.4.2.1相同重量浓度下复合乳酸杆菌对ConA诱导的小鼠脾淋巴细胞转化 反应的影响
试验方法同实施例7.4.1。
1)实验结果：
复合乳酸杆菌制剂对ConA诱导的小鼠脾淋巴细胞转化反应的影响见表22：
表22相同重量的复合乳酸杆菌对ConA诱导的小鼠脾淋巴细胞转化反应 的影响
由表22的结果可以看出：
与阴性对照相比，由实施例3和实施例4生产的复合乳酸杆菌原粉对ConA 诱导的小鼠脾淋巴细胞转化反应均具有显著的效果；与液态法(即实施例3) 制备的复合乳酸杆菌原粉相比，固态法(即实施例4)制备的复合乳酸杆菌原 粉具有更强的增加免疫力的效果。
与阴性对照相比，由实施例3、实施例4、实施例5和实施例6等生产的复 合乳酸杆菌制剂对ConA诱导的小鼠脾淋巴细胞转化反应均具有特别显著的效 果；与液态培养法(实施例3)相比，由固态培养法(实施例4-6)制备的复合乳 酸杆菌制剂对ConA诱导的小鼠脾淋巴细胞转化反应具有更好的效果。
7.4.2.2相同菌数时制剂产品对ConA诱导的小鼠脾淋巴细胞转化反应的 效果对比
试验方法同实施例7.4.1。
分别称取复合乳酸杆菌制剂成品1g，加入适量无菌水，经菌数测定后，加 入无菌水调整复合乳酸杆菌总数浓度为1x1010CFU/ml，每次灌服10ml，故每次 服用的复合乳酸杆菌总数为10x1010CFU，即1x1011CFU。
按照实施例7.1类似的试验方法，测定相同菌数的实施例样品对ConA诱 导的小鼠脾淋巴细胞转化反应的影响，结果以“平均值±标准差”来表示，详 见表23：
表23相同菌数时制剂产品对ConA诱导的小鼠脾淋巴细胞转化反应的影响
如表23所示，实施例3为液态法制备的制剂产品对ConA诱导的小鼠脾淋 巴细胞转化反应，而实施例4、5、6则分别为3种固态法制备的制剂产品对ConA 诱导的小鼠脾淋巴细胞转化反应。
复合乳酸杆菌对ConA诱导的小鼠脾淋巴细胞转化反应，如果仅仅是活菌 的效果，那么当采用相同的菌数时应该具有大致相同的效果，但表5的结果表 明：与液态法所制备的复合乳酸杆菌制剂相比，本发明的实施例4、5、6采用 固态法制备的复合乳酸杆菌制剂具有更大的对ConA诱导的小鼠脾淋巴细胞转 化反应，说明其增强免疫力的效果更明显。液态法制剂在制备过程中由于离心 分离去除了液态培养过程所产生的代谢产物，所以其抑菌效果主要来自于菌种 本身；而本发明制备所得固态法制剂中除了含有复合乳酸杆菌菌体外，还含有 固态培养过程中所产生的细菌多糖等代谢产物，复合乳酸杆菌与代谢产物协同增效，提高了菌剂整体对ConA诱导的小鼠脾淋巴细胞转化反应。
综合表20、表21、表22和表23的效果对比结果，所有进行实验的复合 乳酸杆菌制剂都有增强免疫力的效果，其中由固态培养法制备的复合乳酸杆菌 菌剂具有比液态培养法更好的增强免疫力的效果。
本发明针对传统工艺的缺陷，采用混合菌接种、液态培养、固液分离、固 态培养等结合的新工艺，在传统的液态培养、固液分离的基础上，再增加一个 固态培养的工序；或者也可以说：本发明是在传统的液态培养与固态培养结合 工艺的基础上，在中间再增加一个固液分离的工序。经过这样改进的发酵工艺， 充分利用了液态发酵速度快，固液分离后的湿菌种菌体数量高，以及固态发酵 可使复合乳酸杆菌的菌种活力有较大的恢复和增长，并且在固态发酵过程中还 能产生细菌素、有机酸等抗菌物质的优点，还能产生降血糖、增加免疫力的代 谢产物，能增强复合乳酸杆菌类益生菌制剂在使用时的抗幽门螺杆菌、降血糖、 调理肠胃和增加免疫力等多方面的功能效果。此外，固态发酵添加的固态培养 基及其培养产物还具有干燥保护剂的作用，且固态发酵产生的菌体在干燥时应 激小，菌体干燥时死亡率低，使最终获得的产品菌种活力高、并含有适量的细 菌素、有机酸以及一些具有降血糖、增加免疫力的代谢产物，在实际的使用过 程中具有更好的抗幽门螺杆菌和、降血糖、调理肠胃和增加免疫力的效果。本 发明所使用的复合菌为同一属的乳酸菌，其生长环境类似、产生的代谢产物类 似，但它们对于生长环境的要求还是略有一些区别，因此，当它们混合培养时， 能充分发挥它们各自对生长环境的适应能力，所以在培养结束时的总菌数比单一菌株培养时要高，而且其功能效果也更全面。
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于 此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到 变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应 以所述权利要求的保护范围为准。
Claims (10)
1.一种抗幽门螺杆菌、降血糖、调理肠胃和增加免疫力的复合乳酸杆菌制剂，其特征在于，所述抗幽门螺杆菌、降血糖、调理肠胃和增加免疫力的复合乳酸杆菌制剂按重量份包括以下组分：
10-15份植物乳杆菌MiuCul-01(Lactobacillus plantarum)，保藏号为CGMCC 20865；5-10份嗜酸乳杆菌MiuLac-01(Lactobacillus acidophilus)，保藏号为CGMCC 20864；3-7份干酪乳杆菌MiaoTech-01(Lactobacillus casei)，保藏号为CGMCC 20863；2-6份鼠李糖乳杆菌MiaoTech-11(Lactobacillus rhamnosus)，保藏号为CGMCC 20862；8-12份嗜热链球菌MiaoPro-01(Streptococcus thermophilus)，保藏号为CGMCC 20861；
所述的抗幽门螺杆菌、降血糖、调理肠胃和增加免疫力的复合乳酸杆菌制剂的制备方法，包括以下步骤：
（1）按配比将植物乳杆菌MiuCul-01、嗜酸乳杆菌MiuLac-01、干酪乳杆菌MiaoTech-01、鼠李糖乳杆菌MiaoTech-11和嗜热链球菌MiaoPro-01混合均匀，形成复合乳酸杆菌，放入液体培养基中进行第一次厌氧培养，产生的培养液经离心分离后获得复合乳酸杆菌湿菌体，备用；
（2）向步骤（1）得到的所述复合乳酸杆菌湿菌体与固体培养基混合，在密封状态下进行第二次厌氧培养，培养完成后进行低温干燥或冷冻干燥或真空干燥，形成复合乳酸杆菌固体；
（3）将步骤（2）得到的复合乳酸杆菌固体粉碎、造粒、包衣，即得所述抗幽门螺杆菌、降血糖、调理肠胃和增加免疫力的复合乳酸杆菌制剂。
2.根据权利要求1所述的抗幽门螺杆菌、降血糖、调理肠胃和增加免疫力的复合乳酸杆菌制剂，其特征在于，所述抗幽门螺杆菌、降血糖、调理肠胃和增加免疫力的复合乳酸杆菌制剂按重量份包括以下组分：
12-13份植物乳杆菌MiuCul-01、7-8份嗜酸乳杆菌MiuLac-01、4-6份干酪乳杆菌MiaoTech-01、3-5份鼠李糖乳杆菌MiaoTech-11和9-11份嗜热链球菌MiaoPro-01；所述复合乳酸杆菌制剂的活菌数为（4-5）×1011CFU/g。
3.根据权利要求1或2所述的抗幽门螺杆菌、降血糖、调理肠胃和增加免疫力的复合乳酸杆菌制剂，其特征在于，所述植物乳杆菌MiuCul-01从泡菜中分离得到，培养条件为：MRS培养基；pH6.2～6.4，温度37℃。
4.根据权利要求1或2所述的抗幽门螺杆菌、降血糖、调理肠胃和增加免疫力的复合乳酸杆菌制剂，其特征在于，所述嗜酸乳杆菌MiuLac-01从发酵乳制品中分离得到，培养条件为：MRS培养基；pH6.2～6.4，温度37℃。
5.根据权利要求1或2所述的抗幽门螺杆菌、降血糖、调理肠胃和增加免疫力的复合乳酸杆菌制剂，其特征在于，所述干酪乳杆菌MiaoTech-01从发酵乳制品中分离得到，培养条件为：MRS培养基；pH6.2～6.4，温度37℃。
6.根据权利要求1或2所述的抗幽门螺杆菌、降血糖、调理肠胃和增加免疫力的复合乳酸杆菌制剂，其特征在于，所述鼠李糖乳杆菌MiaoTech-11从益生菌制剂中分离得到，培养条件为：MRS培养基；pH6.2～6.4，温度37℃。
7.根据权利要求1或2所述的抗幽门螺杆菌、降血糖、调理肠胃和增加免疫力的复合乳酸杆菌制剂，其特征在于，所述嗜热链球菌MiaoPro-01从酸奶发酵剂中分离得到，培养条件为：MRS培养基；pH6.2～6.4，温度37℃。
8.制备权利要求1-7任一所述的抗幽门螺杆菌、降血糖、调理肠胃和增加免疫力的复合乳酸杆菌制剂的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
（1）按配比将植物乳杆菌MiuCul-01、嗜酸乳杆菌MiuLac-01、干酪乳杆菌MiaoTech-01、鼠李糖乳杆菌MiaoTech-11和嗜热链球菌MiaoPro-01混合均匀，形成复合乳酸杆菌，放入液体培养基中进行第一次厌氧培养，产生的培养液经离心分离后获得复合乳酸杆菌湿菌体，备用；
（2）向步骤（1）得到的所述复合乳酸杆菌湿菌体与固体培养基混合，在密封状态下进行第二次厌氧培养，培养完成后进行低温干燥或冷冻干燥或真空干燥，形成复合乳酸杆菌固体；
（3）将步骤（2）得到的复合乳酸杆菌固体粉碎、造粒、包衣，即得所述抗幽门螺杆菌、降血糖、调理肠胃和增加免疫力的复合乳酸杆菌制剂。
9.根据权利要求8所述的抗幽门螺杆菌、降血糖、调理肠胃和增加免疫力的复合乳酸杆菌制剂的制备方法，其特征在于，步骤（1）中，采用碟式离心机或管式离心机在无菌条件下进行离心分离后获得复合乳酸杆菌湿菌体；所述液体培养基包括葡萄糖、蛋白胨、酵母浸膏；所述第一次厌氧培养的温度为36-38℃，时间为48-72小时。
10.根据权利要求8所述的抗幽门螺杆菌、降血糖、调理肠胃和增加免疫力的复合乳酸杆菌制剂的制备方法，其特征在于，步骤（2）中，所述固体培养基在使用前经过高温干热灭菌，并无菌冷却到38℃以下备用；所述第二次厌氧培养前将所述复合乳酸杆菌湿菌体与固体培养基混合物的水分含量调节到45%-55%；所述第二次厌氧培养的温度为36-38℃，时间为72-120小时；所述低温干燥或真空干燥的温度为30-40℃；所述复合乳酸杆菌固体的含水率为4-6%。
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| PB01 | Publication | ||
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Effective date of registration: 20230629 Address after: 224300 Hede Town, Sheyang County, Yancheng, Jiangsu Province Applicant after: Jiangsu Lanze Biotechnology Co.,Ltd. Address before: 224000 north side of North Third Ring Road, Hede Town, Sheyang County, Yancheng City, Jiangsu Province, west side of Zhansheng electronics company Applicant before: Yancheng Weikang Biotechnology Co.,Ltd. |
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| GR01 | Patent grant | ||
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