CN116162569A - 动物双歧杆菌乳亚种bl03及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了动物双歧杆菌乳亚种BL03及其应用。属于微生物技术领域。本发明公开的一株动物双歧杆菌乳亚种BL03，保藏编号为CGMCCNo.23451。动物双歧杆菌乳亚种BL03在体内能显著降低斑马鱼体内的黑色素含量和酪氨酸酶活性，表现出良好的淡斑美白养颜的功效。本发明公开的动物双歧杆菌乳亚种BL03在淡斑美白养颜方面有巨大的潜在应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及微生物技术领域，更具体的说是涉及动物双歧杆菌乳亚种BL03及其应用。
背景技术
近年来，皮肤问题一直是人们关注的焦点。皮肤色素沉着一直是让人感到困扰的问题。研究人员一直致力于寻找解决该皮肤问题的方法。微生态护肤是当今流行的概念，通过使用益生菌来改善皮肤健康是一个热门的讨论话题。益生菌是对宿主健康和生理功能产生有益作用的活性微生物，最初是从人类胃肠道分离出来的。益生菌已被证明具有多种皮肤有益特性，如调节皮肤炎症、预防过敏性接触性皮炎、缓解皮肤色素沉着。它们还在平衡皮肤内的有益细菌、加强皮肤屏障、促进更好的水分吸附和帮助延缓皮肤衰老方面发挥着至关重要的作用。有多项研究表明，植物乳杆菌具有抗皮肤癌、抗光皮肤老化、抗皮肤衰老、促进皮肤伤口愈合、促进免疫和美白的特性。因此，益生菌在预防和缓解皮肤黑色素沉着以及作为一种化妆品资源方面具有多种潜力。
虽然当前国内市场上益生菌制品种类繁多，但是国内生产企业所用益生菌菌种大多依赖进口，而且国外菌株未必适合我国居民肠道生理状况。另外，益生菌的功能缺乏有力的科学研究证据，严重影响了益生菌及其制品的推广。基于此，针对菌种资源的功能进行深入挖掘，筛选出具有特定功能性质、适合中国人群生理特性的新型益生菌菌株，对提高我国益生菌生产企业的核心竞争力，促进我国益生菌制品发展尤为重要。
因此，提供一株具有淡斑美白养颜功效的益生菌是本领域技术人员亟需解决的问题。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了动物双歧杆菌乳亚种BL03及其应用。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一株动物双歧杆菌乳亚种(Bifidobacteriumanimalissubsp.lactis)BL03，保藏编号为CGMCCNo.23451，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏日期为2021年09月18日，分类命名为动物双歧杆菌乳亚种Bifidobacteriumanimalissubsp.lactis。
上述的动物双歧杆菌乳亚种BL03在制备淡斑美白产品中的应用。
上述的动物双歧杆菌乳亚种BL03在降低黑色素含量中的应用。
上述的动物双歧杆菌乳亚种BL03在降低酪氨酸酶活性中的应用。
本发明的动物双歧杆菌乳亚种BL03可显著降低斑马鱼体内黑色素的含量和酪氨酸酶的活性，具备应用于体内淡斑美白养颜的潜能，表现出良好的淡斑美白养颜的功效。
一种淡斑美白产品，包括动物双歧杆菌乳亚种BL03，其保藏编号为CGMCCNo.23451。
进一步的，所述动物双歧杆菌乳亚种BL03为菌悬液。
经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明公开提供了一株动物双歧杆菌乳亚种BL03及其在制备淡斑美白养颜产品中的应用，该动物双歧杆菌乳亚种BL03是从广东省梅州市蕉岭县的长寿老人粪便中分离筛选得到的，能够显著降低斑马鱼体内黑色素的含量和酪氨酸酶的活性，具备应用于体内淡斑美白养颜的潜能，此为利用动物双歧杆菌乳亚种BL03开发淡斑美白养颜的药品、保健品、化妆品提供了理论参考和指导依据。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。
图1附图为本发明动物双歧杆菌乳亚种BL03在BS琼脂平板上的菌落形态；
图2附图为本发明动物双歧杆菌乳亚种BL03对斑马鱼体内黑色素含量影响的直观图；
图3附图为本发明动物双歧杆菌乳亚种BL03对斑马鱼体内黑色素含量影响的统计图；
图4附图为本发明动物双歧杆菌乳亚种BL03对斑马鱼体内酪氨酸酶活性的影响。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明所需药剂为常规实验药剂，采购自市售渠道；未提及的实验方法为常规实验方法，在此不再一一赘述。
实施例1动物双歧杆菌乳亚种BL03分离、鉴定及保藏
(1)分离：
1)将广东省梅州市蕉岭县的长寿老人新鲜粪便(约0.1g)溶解于装有1mL无菌生理盐水的1.5mL离心管中，用1mL无菌枪头充分吹打混匀，备用。
2)在6个无菌1.5mL离心管中各加入900uL的无菌生理盐水。
3)从第1个装有10-1样品稀释液的离心管中，吸取100uL的液体加入第2个离心管(10-2)，稀释到10-2。
4)从第2个装有10-2样品稀释液的离心管中，吸取100uL的液体加入第3个离心管(10-3)，稀释到10-3。
5)重复上个步骤，一直稀释到10-4、10-5、10-6、10-7。
6)从装有10-4样品稀释液的离心管中吸取100uL的样品稀释液分别涂布在MRS固体培养基、BS固体培养基中上，将100uL的菌液摊平涂干，注意涂布的手法要温和，动作快速，必须在酒精灯火焰附近操作。涂布完成后，在培养皿侧面做好标记，包括姓名、样品编号、培养基名称、培养时间、稀释梯度、培养条件(厌氧/好氧)等信息。
7)重复上个步骤，完成10-5、10-6、10-7稀释梯度的稀释涂布。
8)涂布完成后，将培养皿分别放在37℃、厌氧养条件下进行培养，48h后可进行观察记录。
9)用接种环挑取平板上的单菌落划线至MRS固体培养基中，37℃厌氧培养48h，分离得到纯菌落。
10)将平板上的纯菌落接种于MRS液体培养基中，37℃厌氧培养12～16h，加入20％甘油，置于-80℃冰箱中保存。
(2)菌株的分子生物学鉴定：对所获得的菌株提取基因组DNA，通过PCR技术利用16SrDNA通用引物27F和1492R扩增16SrDNA全长片段，之后进行测序，鉴定菌株的种属。
其中，通用引物27F和1492R的引物序列如下：
27F：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’；SEQ ID NO.1；
1492R：5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’；SEQ ID NO.2。
实验结果：从广东省梅州市蕉岭县长寿老人粪便中筛选出的菌株，经形态观察、16SrDNA鉴定，其中菌株BL03被鉴定为动物双歧杆菌乳亚种，其16SrDNA序列如SEQ ID NO.3所示。
AGGGTCGGGCCACCGGCTTCGGGTGCTACCCACTTTCATGACTTGACGGGCGGTGTGTACAAGGCCCGGGAACGCATTCACCGCGGCGTTGCTGATCCGCGATTACTAGCGACTCCGCCTTCACGCAGTCGAGTTGCAGACTGCGATCCGAACTGAGACCGGTTTTCAGCGATCCGCCCCACGTCACCGTGTCGCACCGCGTTGTACCGGCCATTGTAGCATGCGTGAAGCCCTGGACGTAAGGGGCATGATGATCTGACGTCATCCCCACCTTCCTCCGAGTTGACCCCGGCGGTCCCACATGAGTTCCCGGCATCACCCGCTGGCAACATGCGGCGAGGGTTGCGCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACATCTCACGACACGAGCTGACGACGACCATGCACCACCTGTGAACCGGCCCCGAAGGGAAACCGTGTCTCCACGGCGATCCGGCACATGTCAAGCCCAGGTAAGGTTCTTCGCGTTGCATCGAATTAATCCGCATGCTCCGCCGCTTGTGCGGGCCCCCGTCAATTTCTTTGAGTTTTAGCCTTGCGGCCGTACTCCCCAGGCGGGATGCTTAACGCGTTGGCTCCGACACGGGACCCGTGGAAAGGGCCCCACATCCAGCATCCACCGTTTACGGCGTGGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTTCGCTCCCCACGCTTTCGCTCCTCAGCGTCAGTGACGGCCCAGAGACCTGCCTTCGCCATTGGTGTTCTTCCCGATATCTACACATTCCACCGTTACACCGGGAATTCCAGTCTCCCCTACCGCACTCCAGCCCGCCCGTACCCGGCGCAGATCCACCGTTAGGCGATGGACTTTCACACCGGACGCGACGAACCGCCTACGAGCCCTTTACGCCCAATAAATCCGGATAACGCTCGCACCCTACGTATTACCGCGGCTGCTGGCACGTAGTTAGCCGGTGCTTATTCGAACAATCCACTCAACACGGCCGAAACCGTGCCTTGCCCTTGAACAAAAGCGGTTTACAACCCGAAGGCCTCCATCCCGCACGCGGCGTCGCTGCATCAGGCTTGCGCCCATTGTGCAATATTCCCCACTGCTGCCTCCCGTAGGAGTCTGGGCCGTATCTCAGTCCCAATGTGGCCGGTCACCCTCTCAGGCCGGCTACCCGTCAACGCCTTGGTGGGCCATCACCCCGCCAACAAGCTGATAGGACGCGACCCCATCCCATGCCGCAAAAGCATTTCCCACCCCACCATGCGATGGAGCGGAGCATCCGGTATTACCACCCGTTTCCAGGAGCTATTCCGGTGCACAGGGCAGGTTGGTCACGCATTACTCACCCGTTCGCCACTCTCACCCCGACAGCAAGCTGCCAGGGATCCCGTTCGACTGCA；SEQ ID NO.3。
菌株BL03单菌落接种到BS固体培养基上，37℃厌氧生长良好，菌落白色、呈圆形、凸起、表面光滑、不透明、边缘整齐(图1)。菌株BL03已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏日期为2021年09月18日，分类命名为动物双歧杆菌乳亚种Bifidobacteriumanimalissubsp.lactis，保藏编号为CGMCCNo.23451。
实施例2动物双歧杆菌乳亚种BL03菌悬液(菌体)的制备
将动物双歧杆菌乳亚种BL03活化培养后接种于BS液体培养基中，37℃培养15h后，4℃，6000r/min离心10min，菌体沉淀。菌体沉淀经PBS两次洗涤后，将菌体用PBS重新悬浮，调整细胞浓度为1×104CFU/mL、1×105CFU/mL、1×106CFU/mL得到菌悬液(菌体)。
实施例3动物双歧杆菌乳亚种BL03对斑马鱼体内的黑色素含量和酪氨酸酶活性的影响
挑选发育至9hpf(hourpost fertilization)的健康野生型AB系斑马鱼胚胎置于6孔细胞培养板中，每孔20枚斑马鱼胚胎。
实验设置正常组、干预组(1×104CFU/mL、1×105CFU/mL、1×106CFU/mL)、阳性对照组(3mg/mLβ-熊果苷)，每组设置6个复孔。正常组加入PBS，1×104CFU/mL干预组加入1×104CFU/mL动物双歧杆菌乳亚种BL03，1×105CFU/mL干预组加入1×105CFU/mL动物双歧杆菌乳亚种BL03，1×106CFU/mL干预组加入1×106CFU/mL动物双歧杆菌乳亚种BL03，阳性对照组加入3mg/mLβ-熊果苷(上海源叶生物科技有限公司)，每孔5mL；28℃孵育72h后，用体视显微镜观察斑马鱼色素沉着情况并拍照记录(图2)；用PBS冲洗两遍后，收集每孔的斑马鱼置于1.5mL离心管，将离心管中的水吸干后，加入150μL脱氧胆酸钠溶液(5mg/mL)，将离心管用超声波破碎仪在冰浴中处理，工作5s、间隔8s，超声破碎10次，12000×g，4℃离心10min，收集上清液至另外一只1.5mL离心管中。
黑色素含量的检测：向上述有沉淀的离心管中加入150μL NaOH溶液，在100℃水浴锅中水浴加热10min，并震动使离心管中黑色素充分溶解。取100μL溶液置于96孔板中，用酶标仪于405nm波长处测定吸光度(OD)。设置溶剂调零组(未有斑马鱼)：加入PBS。按下列公式计算斑马鱼体内黑色素的含量：
结果见图3。
酪氨酸酶活力的检测：取100μL上述上清液置于96孔板中，同时加入100μL左旋多巴溶液(5mmoL/L)，置于37℃孵育1h。用酶标仪于475nm波长处测定吸光度(OD)。设置溶剂调零组(未有斑马鱼)。按下列公式计算斑马鱼体内酪氨酸酶的活性：
结果见图4。
采用SPSS19.0软件统计处理数据，实验数据均用x±SD用单因素方差分析。与正常组相比：**P<0.01，***P<0.005。
由图2可知，正常组的斑马鱼体内有大量黑色素沉着，而阳性对照组(3mg/mLβ-熊果苷)和动物双歧杆菌乳亚种BL03干预组(1×104CFU/mL、1×105CFU/mL、1×106CFU/mL)斑马鱼体内的黑色素沉着明显减少。
由图3和图4可知，阳性对照组(3mg/mLβ-熊果苷)的斑马鱼体内黑色素含量和酪氨酸酶活性分别为39.61±8.43％和54.39±8.98％，与正常组(黑色素含量：100±6.92％；酪氨酸酶活性：100±3.67％)相比较均有显著性差异(P<0.005)，表明本次斑马鱼美白试验有效。
由图3可知，动物双歧杆菌乳亚种BL03浓度为1×104CFU/mL、1×105CFU/mL、1×106CFU/mL时，斑马鱼体内的黑色素含量分别86.50±7.19％、71.28±5.67％和49.26±3.14％，与正常组(100±6.92％)相比较均有显著性差异(P<0.01)。另外，由图4可知，动物双歧杆菌乳亚种BL03浓度为1×104CFU/mL、1×105CFU/mL、1×106CFU/mL时，斑马鱼体内的酪氨酸酶活性分别85.50±6.63％、78.87±5.47％和66.73±7.93％，与正常组(100±3.67％)相比较均有显著性差异(P<0.01)。因此，上述结果表明动物双歧杆菌乳亚种BL03可显著降低斑马鱼体内的黑色素含量和酪氨酸酶活性，表现出良好淡斑美白美颜的作用。
本说明书中各个实施例采用递进的方式描述，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处，各个实施例之间相同相似部分互相参见即可。
对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。
Claims (6)
1.一株动物双歧杆菌乳亚种BL03，其特征在于，保藏编号为CGMCC No.23451。
2.权利要求1所述的动物双歧杆菌乳亚种BL03在制备淡斑美白产品中的应用。
3.权利要求1所述的动物双歧杆菌乳亚种BL03在降低黑色素含量中的应用。
4.权利要求1所述的动物双歧杆菌乳亚种BL03在降低酪氨酸酶活性中的应用。
5.一种淡斑美白产品，其特征在于，包括动物双歧杆菌乳亚种BL03，所述动物双歧杆菌乳亚种BL03的保藏编号为CGMCCNo.23451。
6.如权利要求5所述的淡斑美白产品，其特征在于，所述动物双歧杆菌乳亚种BL03为菌悬液。
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|---|---|---|---|---|
| CN116622585A (zh) * | 2023-06-20 | 2023-08-22 | 广东南芯医疗科技有限公司 | 动物双歧杆菌乳亚种bl03在制备抗氧化和抗衰老产品中的应用 |
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