CN110713960B

CN110713960B - 植物乳杆菌ln66及在降低口臭风险产品中的应用

Info

Publication number: CN110713960B
Application number: CN201911218939.4A
Authority: CN
Inventors: 不公告发明人
Original assignee: Jiaxing Yinuokang Biotechnology Co ltd
Current assignee: Jiaxing Yinuokang Biotechnology Co ltd
Priority date: 2019-12-03
Filing date: 2019-12-03
Publication date: 2021-02-05
Anticipated expiration: 2039-12-03
Also published as: CN110713960A

Abstract

本发明提供了植物乳杆菌LN66及在降低口臭风险产品中的应用，涉及口臭防治技术领域，所述LN66菌株已完成保藏，保藏编号为CGMCC No.17369。本发明所述LN66菌株直接分离自健康人体中，为革兰氏染色阳性杆菌，不生成芽孢，在好氧及厌氧环境均能生长。本发明所述LN66菌株对溶菌酶有很好的耐受性、适应口腔环境，不以杀死具核梭杆菌为目的，而是通过下调具核梭杆菌中与生物膜形成的相关基因表达水平、降低具核梭杆菌胞外聚合物(EPSs)分泌、特异性地抑制或降低具核梭杆菌生物膜的形成，以降低口臭发生和发展的风险。

Description

植物乳杆菌LN66及在降低口臭风险产品中的应用

技术领域

本发明属于口臭防治技术领域，具体涉及植物乳杆菌LN66及在降低口臭风险产品中的应用。

背景技术

口臭是一种常见的临床症状，严重时甚至会影响到人们的社交心理等。口臭的形成主要是某些口腔致臭菌分解口腔中的残渣等形成难闻的挥发性硫化物(VSCs)，具核梭杆菌是主要的口腔致臭菌之一，除形成VSCs外还是形成口腔致臭菌生物膜不可缺少的菌，对于生物膜的形成起着至关重要的搭桥作用。致臭菌形成生物膜后其对抗生素的抗性明显提高且不易随洗刷冲洗离开口腔，会加剧口臭症状。目前采用抗生素法治疗口臭的主要问题是致臭菌形成生物膜后对抗生素的抗性大为提高、抗生素过多使用还会造成一些副作用及口腔正常菌群失调等，停止治疗后复发率也较高。机械洗刷法也很难将致臭菌生物膜完全去除。益生菌方法治疗口臭也正得到越来越多的重视，目前主要是选择对致臭菌有抑制作用或者能中和致臭菌产生的VSCs的益生菌，但是治疗效果不佳。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一株植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)LN66，显著下调具核梭杆菌中与生物膜形成相关的基因的表达水平、显著降低具核梭杆菌胞外聚合物(EPSs)分泌、特异性地抑制或降低具核梭杆菌生物膜的形成，以降低口臭发生和发展的风险。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一株植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)LN66菌株，保藏编号为CGMCCNo.17369。

本发明提供了所述LN66菌株在调控具核梭杆菌(Fusobacterium nucleatum)生物膜形成相关基因表达中的应用。

优选的，所述调控为下调。

优选的，具核梭杆菌生物膜形成相关基因包括编码外膜粘附相关蛋白基因。

优选的，所述外膜粘附相关蛋白基因包括：具核梭杆菌外膜上的四个类自转运蛋白基因radD、fap2、aim1和cmpA，介导粘附及刺激宿主免疫细胞的热修改蛋白基因fomA和菌体表面粘附素蛋白基因fadA。

本发明提供了所述LN66菌株在降低具核梭杆菌胞外聚合物分泌量中的应用。

优选的，所述具核梭杆菌胞外聚合物包括：胞外蛋白和胞外多糖。

本发明提供了所述LN66菌株在降低具核梭杆菌生物膜形成中的应用。

本发明提供了所述LN66菌株在制备预防和/或治疗口臭药物中的应用。

优选的，所述药物中LN66菌株的活菌数量为不低于10⁶CFU/mL或10⁶CFU/g。

本发明提供了一株植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)LN66菌株，保藏编号为CGMCC No.17369，所述LN66菌株直接分离自健康人体中，为革兰氏染色阳性杆菌，不生成芽孢，在好氧及厌氧环境均能生长。本发明所述LN66菌株对溶菌酶有很好的耐受性、适应口腔环境，不以杀死具核梭杆菌为目的，而是通过下调具核梭杆菌中与生物膜形成的相关基因表达水平、降低具核梭杆菌胞外聚合物(EPSs)分泌、特异性地抑制或降低具核梭杆菌生物膜的形成，以降低口臭发生和发展的风险。

生物保藏信息

植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)LN66菌株，保藏编号为CGMCC No.17369。保藏单位为中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏时间为2019年03月20日。

附图说明

图1为非接触共培养LN66菌株和具核梭杆菌的模式图；

图2为具核梭杆菌生物膜形成电镜图，其中A为具核梭杆菌在无LN66菌株时形成的生物膜(1000×)；B为具核梭杆菌在LN66菌株存在时形成的生物膜(1000×)；C为具核梭杆菌在无LN66菌株时形成的生物膜(3000×)；D：具核梭杆菌在LN66菌株存在时形成的生物膜(3000×)。

具体实施方式

本发明提供了一株植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)LN66菌株，保藏编号为CGMCC No.17369。本发明所述LN66菌株直接自健康人体中分离获得，是革兰氏染色阳性杆菌，不生成芽孢，在好氧及厌氧环境均能生长。本发明所述LN66菌株的16S rRNA序列如SEQ ID NO.1所示。本发明所述LN66菌株具有较强的亮氨酸转肽酶、β-半乳糖甙酶、α-葡萄糖甙酶、β-葡萄糖甙酶和N-乙酰-β-葡萄糖胺酶活性。本发明所述LN66菌株可在浓度0.2～1mg/mL的溶菌酶溶液中正常生长，因而完全能够耐受口腔高溶菌酶浓度。

本发明提供了所述LN66菌株在调控具核梭杆菌生物膜形成相关基因表达中的应用。本发明所述调控优选为下调；所述具核梭杆菌生物膜形成相关基因优选包括外膜粘附相关蛋白基因。本发明所述外膜粘附相关蛋白基因优选包括：具核梭杆菌外膜上的四个类自转运蛋白基因radD、fap2、aim1和cmpA，介导粘附及刺激宿主免疫细胞的热修改蛋白基因fomA和菌体表面粘附素蛋白基因fadA。

本发明提供了所述LN66菌株在降低具核梭杆菌(Fusobacterium nucleatum)胞外聚合物分泌量中的应用。本发明所述具核梭杆菌胞外聚合物优选包括：胞外蛋白和胞外多糖。

本发明提供了所述LN66菌株在降低具核梭杆菌(Fusobacterium nucleatum)生物膜形成中的应用。本发明所述LN66菌株可降低生物膜的致密度和形成量。

本发明提供了所述LN66菌株在制备预防和/或治疗口臭药物中的应用。本发明对所述药物的剂型并没有特殊限定，利用本领域的常规药物剂型即可。本发明对所述药物中的辅料种类和含量并没有特殊限定，利用本领域的常规药学可接受的辅料即可。在本发明中，以所述LN66菌株作为所述药物中的有效成分/活性成分，其活菌数量优选为不低于10⁶CFU/mL或10⁶CFU/g。

下面结合实施例对本发明提供的株植物乳杆菌LN66菌株及其应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

1、糖代谢试验

在MRS固体培养基上对所述LN66菌株进行37℃培养24h后，刮取平板上的单个菌落，使用API 50CH生化鉴定试剂盒进行生化反应检测，结果如表1所示：

表1植物乳杆菌LN66糖代谢谱测试结果

注：“+”表示阳性，“-”表示阴性

结果表明所述LN66菌株属于乳杆菌属、植物乳杆菌种。

2、酶代谢试验

用API ZYM试剂盒(法国梅里埃公司)对LN66菌株的酶活进行半定量分析。根据试剂盒操作说明，收集MRS培养液中生长的菌体细胞，用无菌水制备菌悬液用于下一步的酶活分析。加入菌体和试剂后，试剂条的色泽深度由浅到深由“—”、“+”、“++“、”+++“4个等级，表明酶活由弱至强，实验结果如表2所示：

表2植物乳杆菌LN66API ZYM酶谱测试结果

表2结果表明，LN66具有较强的亮氨酸转肽酶、β-半乳糖甙酶、α-葡萄糖甙酶、β-葡萄糖甙酶和N-乙酰-β-葡萄糖胺酶活性。

3、植物乳杆菌LN66对溶菌酶的耐受能力测试

在新鲜的MRS液体培养基中加入不同浓度的溶菌酶，接入5×(10⁷～10⁸)CFU/mL的LN66菌液，37℃培养24小时，检测菌液中的活菌数，以不添加溶菌酶的活菌数作为对照，计算存活率。

存活率％＝含溶菌酶的活菌数/不含溶菌酶的活菌数×100％。

结果如表3所示：

表3溶菌酶对植物乳杆菌LN66的影响

表3结果表明，高达1.0mg/mL的溶菌酶不影响LN66菌株的正常生长。口腔中溶菌酶的浓度约为13.8±3.7μg/mL，因此，LN66菌株不受口腔中的溶菌酶影响，能耐受口腔环境。

4、LN66菌株对具核梭杆菌生物膜形成的影响

采用带tranwell小室的24孔细胞培养板(如图1所示)非接触共培养益生菌和具核梭杆菌的方法，图1中LN66菌株上层为乳杆菌层，Fn下层为具核梭杆菌层。考察LN66菌株在与具核梭杆菌不直接接触的情况下，共培养24h和48h对具核梭杆菌生物膜形成的影响：

分别用新鲜的MRS培养基和TSB肉汤培养基将过夜培养的LN66菌株和具核梭杆菌菌浓度调节至OD₆₀₀＝0.5±0.05(5×(10⁷～10⁸)CFU/mL)。向带有transwell小室的24孔细胞培养板下层加入1000μLTSB肉汤培养基及50μL具核梭杆菌菌液。随后，放入transwell小室，向小室内加入50μL LN66菌株的菌液。对照组向transwell小室内加入50μL MRS液体培养基。37℃厌氧培养24h或48h。取出transwell小室，1mL ddH₂O清洗具核梭杆菌生物膜，风干。500μL 0.1％番红O染色30min。ddH₂O清洗3次，除去未吸附的番红O染色液，风干。随后，500μL 33％乙酸溶解。用酶标仪检测492nm波长下的吸光值，即代表具核梭杆菌生物膜的形成量。独立实验共做三次，结果见表4所示：

表4植物乳杆菌LN66对具核梭杆菌生物膜形成的影响

表4结果表明，与对照组相比，LN66菌株在与具核梭杆菌不直接接触的情况下共培养24h时，可显著降低具核梭杆菌生物膜量；共培养48h时，具核梭杆菌生物膜量仍持续下降。可见，LN66菌株与具核梭杆菌共培养，无需直接接触，即可对具核梭杆菌生物膜形成量产生显著抑制作用。

5、LN66菌株对具核梭杆菌生物膜形成的影响

在细胞培养板下层放入灭菌的面积约为0.5cm×0.5cm的盖玻片，用试验4中描述的方法共培养LN66菌株和具核梭杆菌。24h后，取出transwell小室，取出盖玻片，PBS清洗3次。将玻片置于含2.5％戊二醛的PBS中，4℃过夜固定。依次用30％、50％、70％、80％、90％和100％的梯度乙醇溶液脱水，随后进行临界点干燥，喷金，扫描电镜观察。

具核梭杆菌在LN66菌株存在但不直接接触的情况下，在玻片上形成生物膜。经过24h的共培养过后，取出transwell小室，通过肉眼观察具核梭杆菌生物膜的形成状态，在没有LN66菌株存在的情况下，具核梭杆菌形成的生物膜光滑、均匀、致密；而当LN66菌株存在时，具核梭杆菌形成的生物膜量明显减少，且生物膜较粗糙，出现较大空隙。

在扫描电镜下的具核梭杆菌生物膜形态如图2所示：与对照组相比，LN66菌株存在的情况下，形成的具核梭杆菌生物膜对玻片的粘附力明显降低，极容易被水流破坏。在放大1000倍的视野下，没有LN66菌株存在时，具核梭杆菌菌体排列紧凑，交织在一起，而LN66菌株的存在使得具核梭杆菌的菌体与菌体之间产生了较大的间隙。在放大3000倍的视野下，LN66菌株的存在使以生物膜状态存在的具核梭杆菌菌量减少，菌体之间空隙增大，且菌体与菌体倾向于形成长链。

图2结果表明：LN66菌株与具核梭杆菌共培养，无需直接接触，即可对具核梭杆菌生物膜形成产生抑制，破坏具核梭杆菌生物膜的结构。

6、LN66菌株可抑制具核梭杆菌生物膜形成相关基因的表达

用试验4中描述的方法共培养LN66菌株和具核梭杆菌。LN66菌株与具核梭杆菌非接触共培养时，采用荧光定量PCR方法分别考察具核梭杆菌中与生物膜形成相关的基因在有无LN66菌株存在的情况下的表达差异情况。

方法：提取具核梭杆菌RNA，并反转录成cDNA，将合成的cDNA模板于-80℃保存备用。采用表5中设计获得的引物进行荧光定量PCR，并以16S rRNA基因作内参基因：

表5荧光定量PCR引物信息

反应条件：94℃预变性30s，随后进行40个循环(94℃变性5s，60℃退火30s)。根据2^-ΔΔCt法对目标基因进行相对定量，得出目标基因的差异表达倍数。

与具核梭杆菌生物膜形成相关的6个基因表达情况如表6所示：

表6与具核梭杆菌生物膜形成相关的6个基因表达

可见，当对照组标准化为100时，实验组即当LN66菌株与具核梭杆菌非接触共培养24h后，具核梭杆菌中的6个与生物膜形成相关的基因表达量显著下调，从而抑制具核梭杆菌生物膜的形成。radD、fap2、aim1、cmpA是编码具核梭杆菌外膜上四个类自转运蛋白的基因，这些蛋白均与具核梭杆菌的特异性粘附相关；fomA基因编码的热修改蛋白是具核梭杆菌的主要外膜孔蛋白，其作为受体蛋白参与细菌间共聚；fadA基因编码的菌体表面粘附素FadA与具核梭杆菌粘附细胞相关。在生物膜形成的初始阶段，具核梭杆菌需要通过外膜粘附相关蛋白粘附于宿主表面才能进一步形成生物膜，而LN66菌株抑制了上述基因的表达，通过影响初始粘附来抑制具核梭杆菌的生物膜形成。

7、LN66菌株对具核梭杆菌胞外聚合物(EPSs)分泌的影响

细菌粘附到宿主表面后，生物膜的形成就进入了微集落形成阶段，微集落由大量胞外聚合物(EPSs)将单个具核梭杆菌粘连形成，大量微集落逐渐聚集最终形成生物膜。

方法：用试验4中描述的方法共培养LN66菌株和具核梭杆菌24h。应用Bradford法和硫酸苯酚法分别测定了LN66菌株对具核梭杆菌生物膜中胞外蛋白、胞外多糖含量的影响。实验结果见表7。实验组中具核梭杆菌生物膜中胞外蛋白和胞外多糖的含量明显低于对照组，有显著性差异。LN66菌株可以通过影响具核梭杆菌胞外蛋白和胞外多糖含量，进而抑制生物膜结构发展。

表7LN66菌株对具核梭杆菌胞外聚合物(EPSs)分泌的影响

以每毫克生物膜含有的EPSs质量作为衡量指标。

本发明提供了一株植物乳杆菌LN66菌株及其应用，所述LN66菌株能够在含有溶菌酶的模拟口腔环境中正常生长，与具核梭杆菌非接触共培养，即可通过下调具核梭杆菌与生物膜形成相关的基因表达水平、降低具核梭杆菌胞外聚合物(EPSs)分泌，特异性地抑制或降低具核梭杆菌生物膜的形成量和致密度，达到预防和治疗口臭的目的。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 嘉兴益诺康生物科技有限公司

<120> 植物乳杆菌LN66及在降低口臭风险产品中的应用

<160> 15

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1544

<212> DNA

<213> Lactobacillus plantarum

<400> 1

taccttgtta ggactgagcc aggaaccact ctacctttac ctggttaaaa tctcatggtg 60

tgacgggcgg tgtgtacaag gcccgggaac gtattcaccg cggcatgctg atccgcgatt 120

actagcgatt ccgacttcat gtaggcgagt tgcagcctac aatccgaact gagaatggct 180

ttaagagatt agcttactct cgcgagttcg caactcgttg taccatccat tgtagcacgt 240

gtgtagccca ggtcataagg ggcatgatga tttgacgtca tccccacctt cctccggttt 300

gtcaccggca gtctcaccag agtgcccaac ttaatgctgg caactgataa taagggttgc 360

gctcgttgcg ggacttaacc caacatctca cgacacgagc tgacgacaac catgcaccac 420

ctgtatccat gtccccgaag ggaacgtcta atctcttaga tttgcatagt atgtcaagac 480

ctggtaaggt tcttcgcgta gcttcgaatt aaaccacatg ctccaccgct tgtgcgggcc 540

cccgtcaatt cctttgagtt tcagccttgc ggccgtactc cccaggcgga atgcttaatg 600

cgttagctgc agcactgaag ggcggaaacc ctccaacact tagcattcat cgtttacggt 660

atggactacc agggtatcta atcctgtttg ctacccatac tttcgagcct cagcgtcagt 720

tacagaccag acagccgcct tcgccactgg tgttcttcca tatatctacg catttcaccg 780

ctacacatgg agttccactg tcctcttctg cactcaagtt tcccagtttc cgatgcactt 840

cttcggttga gccgaaggct ttcacatcag acttaaaaaa ccgcctgcgc tcgctttacg 900

cccaataaat ccggacaacg cttgccacct acgtattacc gcggctgctg gcacgtagtt 960

agccgtggct ttctggttaa ataccgtcaa tacctgaaca gttactctca gatatgttct 1020

tctttaacaa cagagtttta cgagccgaaa cccttcttca ctcacgcggc gttgctccat 1080

cagactttcg tccattgtgg aagattccct actgctgcct cccgtaggag tttgggccgt 1140

gtctcagtcc caatgtggcc gattaccctc tcaggtcggc tacgtatcat tgccatggtg 1200

agccgttacc ccaccatcta gctaatacgc cgcgggacca tccaaaagtg atagccgaag 1260

ccatctttca agctcggacc atgcggtcca agttgttatg cggtattagc atctgtttcc 1320

aggtgttatc ccccgcttct gggcaggttt cccacgtgtt actcaccagt tcgccactca 1380

ctcaaatgta aatcatgatg caagcaccaa tcaataccag agttcgttcg acttgcatgt 1440

attaggcacg ccgccagcgt tcgtcctgag ccaggatcaa actctacggc taccttgtta 1500

cgactgagcc aggatcaaac tctacggcta ccttgttacg actg 1544

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

agagtttgat cctggctcag 20

<210> 3

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gtcatcgtgc acacagaatt gctg 24

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

gaatggcagg atttgcttca 20

<210> 5

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

ttggttagtt ccctttgcgt a 21

<210> 6

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

ggatttatct ttgctaattg gggaaattat ag 32

<210> 7

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

actattccat attctccata atatttccca ttaga 35

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

cacaagctga cgctgctaga 20

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

ttaccagctc ttaaagcttg 20

<210> 10

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

ccaaatggtt cagatgatgt tca 23

<210> 11

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

taccagttgc ccagttttca t 21

<210> 12

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

aaaattggag caacaggagg a 21

<210> 13

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

ttcagaggca atagcgacaa c 21

<210> 14

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

gtttggagca ggaggttcaa 20

<210> 15

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

ccttggcatc attttcaata gtt 23

Claims

1.一株植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)LN66菌株，其特征在于，保藏编号为CGMCC No. 17369。

2.权利要求1所述LN66菌株在制备下调具核梭杆菌（Fusobacterium nucleatum）生物膜形成相关基因表达的药物中的应用。

3.根据权利要求2所述应用，其特征在于，具核梭杆菌生物膜形成相关基因包括编码外膜粘附相关蛋白基因，所述编码外膜粘附相关蛋白基因包括：具核梭杆菌外膜上的四个类自转运蛋白基因radD、fap2、aim1和cmpA，介导粘附及刺激宿主免疫细胞的热修改蛋白基因fomA和菌体表面粘附素蛋白基因fadA。

4.权利要求1所述LN66菌株在制备降低具核梭杆菌胞外聚合物分泌量的药物中的应用，所述具核梭杆菌胞外聚合物包括：胞外蛋白和胞外多糖。

5.权利要求1所述LN66菌株在制备抑制具核梭杆菌生物膜形成的药物中的应用。

6.权利要求1所述LN66菌株在制备预防和/或治疗口臭药物中的应用。

7.根据权利要求6所述应用，其特征在于，所述药物中LN66菌株的活菌数量为不低于10⁶CFU/mL或10⁶CFU/g。