CN114703092B - 一株能够抑制具核梭菌并改善口气的植物乳杆菌 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一株能够抑制具核梭菌并改善口气的植物乳杆菌，属于微生物技术领域。本发明的植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)CCFM1214，于2021年12月17日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，保藏编号为GDMCC No:62140。该植物乳杆菌可显著抑制或降低具核梭杆菌生物膜的形成，且能降低其产VSCs的量，在体内具有改善口臭的作用效果，能降低口臭发生和发展的风险。
Description
技术领域
本发明涉及一株能够抑制具核梭菌并改善口气的植物乳杆菌，属于微生物技术领域。
背景技术
口臭作为第三大口腔健康问题在中国的患病率约为27.5％。口臭不仅仅是个口腔疾病，还会给患者的社会交往和心理带来不良影响。80％～90％的口臭与口腔因素相关，称为口源性口臭。口臭气味主要是因为口腔内的微生物分解含硫氨基酸或血清从而产生了代谢产物。这些代谢产物主要是挥发性硫化物(Volatile Sulfur Compounds，VSCs)，其中90％是硫化氢和甲硫醇，还有二甲基硫醚等。产生VSCs的细菌主要是具核梭杆菌、牙龈卟啉单胞菌、中间普氏菌、Solobacterium moorei等等。
目前治疗口臭的方法，有采用物理的方式刮舌，但是效果短暂，且容易破坏微生态；有使用化学疗法如洗必泰、精油等漱口水产品来治疗口臭，但此类方法温和性和安全性欠佳，且精油仅能遮盖气味，并没有从本质上降低VSCs的浓度，治标不治本，所以效果不佳；而中药起效慢，起效一般。对于由微生物引起的口源性口臭，应“对症下药”，用微生物的方法解决因微生物引起的问题。目前，益生菌以其安全、温和的特点，正逐步应用于口腔领域。
对于采用益生菌改善口臭的方法，CN111991429A披露了能够抑制口腔致病菌的罗伊氏乳杆菌，类似的，US2006171901披露了一种能够抑制厌氧菌的唾液链球菌。简单的说，这些益生菌都是有抑菌的效果，但是，口臭厌氧菌在口腔中，尤其是龈下，以生物膜的形式存在，生物膜抗逆性强，仅有抑菌效果的益生菌，在口腔中可能无法发挥其作用。专利CN201911218939.4披露了一株以降低具核梭杆菌生物膜为靶向的植物乳杆菌，能特异性地抑制或降低具核梭杆菌生物膜的形成量和致密度，但无实验证明其降低具核梭杆菌产VSCs的量，能在体外降低生物膜不一定就能降低其产生VSCs。此外，CN201811441014.1披露了添加铁皮石斛低聚甘露糖作为益生元成分、添加多种益生菌成分，以得到一种清新口气的固体饮料，但却无改善口气的效果评价；CN201910453030.0评估了复合益生菌含片漱口3min后对志愿者口气的一个短期的改善效果，但没有一个较长时间的效果跟踪和评估。
发明内容
[技术问题]
本发明要解决的技术问题是现有技术中能够缓解口臭的益生菌多是以抑菌为靶向，且益生菌的添加量大时才起效，难以破坏具核梭杆菌生物膜，没有能够降低VSCs量的确切效果。
[技术方案]
本发明提供一株植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)CCFM1214，可显著抑制或降低具核梭杆菌生物膜的形成，且能降低其产VSCs的量，在体内具有改善口臭的作用效果，能降低口臭发生和发展的风险。
所述植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)CCFM1214在MRS培养基上的菌落呈光滑、白色、圆形小凸起。
所述植物乳杆菌CCFM1214能够降低具核梭杆菌生物膜量，是指植物乳杆菌CCFM1214的上清液能够降低具核梭杆菌形成的生物膜量。
所述植物乳杆菌CCFM1214能够降低具核梭杆菌生物膜量，是指在具核梭杆菌生物膜形成阶段中仍可抑制或破坏其生物膜的形成。
所述植物乳杆菌CCFM1214能够抑制具核梭杆菌的生长，是指能够降低其生长的量。
所述植物乳杆菌CCFM1214能够降低具核梭杆菌产挥发性硫化物(简称VSCs)量，是指乳杆菌的上清液。
所述植物乳杆菌CCFM1214能降低具核梭杆菌产VSCs的基因Fn1220的表达量，是指乳杆菌的上清液和热灭活菌。
所述植物乳杆菌CCFM1214能够缓解口臭，是指植物乳杆菌CCFM1214活菌在口腔内能够有效缓解人群的口臭，有效降低口臭患者VSCs的量。
本发明所述植物乳杆菌CCFM1214可用于制备抑制具核梭杆菌生物膜形成、抑制具核梭杆菌生长、抑制具核梭杆菌表达基因Fn1220、减少具核梭杆菌生成挥发性硫化物的量和/或改善口臭的产品。所述产品含有但不仅限于上述植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)CCFM1214活细胞或死细胞或胞外代谢物。所述死细胞包括但不限于自然失去活性的细胞或经灭活处理后的细胞。所述产品的形式包括但不限于微生物制剂、固体饮料、口气清新剂、牙膏、漱口水。
[有益效果]
本发明筛选得到了一株植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)CCFM1214在体外有抑制抑制具核梭杆菌的能力，在体内具有缓解口臭的作用，具体体现在：
(1)可以预防具核梭杆菌生物膜的形成，CCFM1214在添加10％的上清液时，可抑制68.61％。
(2)对具核梭杆菌的生长有一定的抑制。
(3)与具核梭杆菌有良好的共聚能力。
(3)能够抑制具核梭杆菌产H2S的基因Fn1220。
(4)能够改善志愿者的口气值，VSCs值降低44.29％。
生物材料保藏
所述植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)CCFM1214于2021年12月17日，保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，保藏编号为GDMCC No:62140。
附图说明
图1：不同乳杆菌上清液对具核梭杆菌生物膜形成的影响，注：**p<0.01，***p<0.001，与MRS组相比。
图2：5％的乳杆菌上清液对具核梭杆菌生物膜形成的影响。
图3：具核梭杆菌的生长曲线。
图4：植物乳杆菌CCFM1214在不同时间点干预对具核梭杆菌生物膜形成的影响，注：*p<0.05，***p<0.001，与MRS组相比。
图5：植物乳杆菌CCFM1214与具核梭杆菌的共聚能力。
图6：具核梭杆菌Fn1220基因的相对表达量，注：**p<0.01，***p<0.001，与MRS组相比。
具体实施方式
下述实施例中涉及的培养基如下：
MRS培养基：酵母粉5.0g/L、牛肉膏10.0g/L、蛋白胨10.0g/L、葡萄糖20.0g/L、无水乙酸钠2.0g/L、柠檬酸氢二胺2.0g/L、磷酸氢二钾2.6g/L、一水合硫酸锰0.25g/L、七水合硫酸镁0.5g/L、吐温-80 1mL/L，pH 6.2～6.4。
食品级MRS培养基(/L)：食用级酵母抽提物10g(购自安琪酵母股份有限公司)、食用级葡萄糖20g(购自山东海容生物技术有限公司)、大豆蛋白胨10g(河南万邦化工科技有限公司)、食用级硫酸镁0.1g(购自莱州市莱玉化工有限公司)、食用级硫酸锰0.05g(购自连云港龙泰威食品配料有限公司)、食用级醋酸钠5g(购自江苏科伦多食品配料有限公司)、食用级柠檬酸铵2g(购自江苏科伦多食品配料有限公司)、食用级磷酸氢二钾2g(购自徐州丰瑞生物科技有限公司)
BHI培养基：购买于青岛海博，另外添加0.05％的氯化血红素和0.1％的维生素K1，pH7.2～7.4。
下述实施例中涉及的上清液的制备方法如下：
乳杆菌上清液：在MRS液体培养基中以1％接种量接种，于37℃培养箱培养24h后，10,000r/min、4℃离心10min，再经0.22μm滤膜过滤除菌，于4℃短期保存，于-20℃长期保存。
乳杆菌灭活菌悬液：将乳杆菌以1％的接种量接种至MRS培养基中，于37℃培养24h，获得培养液；将培养液10,000r/min、4℃离心10min，收集菌泥；将菌泥用无菌生理盐水清洗后，重悬于无菌PBS缓冲溶液中至菌液浓度为109CFU/mL，得到菌悬液；将菌悬液60℃灭活30min，得到乳杆菌灭活菌悬液。
唾液链球菌K12上清液：在MRS液体培养基中以1％接种量接种，于37℃培养箱培养24h后，10,000r/min、4℃离心10min，再经0.22μm滤膜过滤除菌，于4℃短期保存，于-20℃长期保存。
下述实施例中的植物乳杆菌CCFM1214筛选于卷心菜，以抑制具核梭菌VSCs的产量为指标进行筛选，经鉴定为植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)。
实施例1：10％的乳杆菌上清液对具核梭杆菌生物膜形成的影响
上清液干预组：在96孔板每孔中加入107CFU/mL具核梭杆菌菌悬液180μL，随后加入20μL乳杆菌上清液，使两者总体积达到200μL，37℃厌氧培养48h，每种上清液设置6个平行孔。
阴性对照组：以同体积的MRS代替乳杆菌上清液。
空白Control对照组：以同体积的BHI代替乳杆菌上清液。
培养后，以PBS清洗2遍，接着用99％的甲醇固定15min，弃上清后，室温干燥。待干燥完全后，每孔中加入100μL的0.1％结晶紫溶液，染色5min，染色结束后以无菌水清洗2次，然后置于室温下放置至完全干燥。最后加入33％的乙酸溶液200μL进行溶解，用枪吹打混匀后，每孔移取175μL加至一个新的96孔板中，于酶标仪570nm处读取吸光值。生物膜介导后的减少量计算方式为抑制率(％)＝(阴性对照生物膜-上清液干预生物膜量)/阴性对照生物膜。
结果如图1所示，实验共涉及6株植物乳杆菌及1株唾液链球菌K12，其中，植物乳杆菌3的上清液在仅添加10％(20μL/(180μL+20μL))时，对具核梭杆菌生物膜的抑制率可达72.18％，是几株乳杆菌中效果最佳的，植物乳杆菌CCFM1214的抑制效果为68.61％，两株植物乳杆菌之间的抑制能力无显著差异。
实施例2：5％的乳杆菌上清液对具核梭杆菌生物膜形成的影响
根据实施例1的方法，改变乳杆菌上清液的添加量至5％，即在96孔板每孔中加入107CFU/mL具核梭杆菌菌悬液190μL，随后加入10μL过滤后的乳杆菌上清液，使两者总体积达到200μL，其余步骤一致。
结果图2所示，植物乳杆菌CCFM1214上清液在仅添加5％时，对具核梭杆菌生物膜仍有显著的抑制率，达27.60％，植物乳杆菌3的抑制率达29.67％，均高于阳性对照唾液链球菌K12的15.45％。
实施例3：乳杆菌上清液对具核梭杆菌产VSCs的影响
将107CFU/mL的具核梭杆菌菌悬液与15％的乳杆菌上清液(或MRS)或唾液链球菌K12上清液共2mL加至亨盖特试管中，共培养9h，用2个50mL注射器针头插入试管中，一头连接Halimeter口臭仪，一头用来平衡气压，边用振荡器振荡，边测量。由于Halimeter检出上限为2000，故对照组进行气体稀释后进行计算。具体操作为：振荡混匀后，用1mL注射器吸取1mL气体，立即加入一管空的亨盖特试管中，边振荡边测量。结果如表1所示，唾液链球菌K12的抑制率为67.81％，植物乳杆菌CCFM1214的抑制率达92.70％，效果显著优于唾液链球菌K12和植物乳杆菌3。
表1乳杆菌上清液对具核梭杆菌产VSCs的影响
实施例4：乳杆菌上清液对具核梭杆菌生长的影响
在96孔板每孔中加入107具核梭杆菌菌悬液190μL，随后分别加入过滤后的乳杆菌上清液10μL、过滤后的唾液链球菌K12上清液10μL、MRS 10μL，用Tecan infinite F50仪器37℃厌氧培养，每隔30min在600nm处测定吸光值，绘制成生长曲线。结果如图3，到达稳定期时，CCFM1214对具核梭杆菌的生长抑制为13.32％，唾液链球菌K12对具核梭杆菌的生长抑制为6.54％，植物乳杆菌3对具核梭杆菌的生长抑制为15.15％。
实施例5：植物乳杆菌CCFM1214在不同时间干预对具核梭杆菌生物膜形成的影响
综合考虑生物膜、生长和VSCs的抑制能力，由于唾液乳杆菌CCFM1215抑制VSCs的能力显著优于植物乳杆菌3，而生物膜和生长两者均无显著的差异，故进一步探究植物乳杆菌CCFM1214在不同时间干预对具核梭杆菌生物膜形成的影响。基于实施例1的方法，在具核梭杆菌生物膜形成6h、12h、24h后添加5％的乳杆菌上清液进行干预。结果如图4所示，上清液添加时间越早，即在生物膜形成前干预效果好，生物膜形成初期(6h)效果减弱，为59.17％，低于0h的68.61％，生物膜开始形成到形成(12、24h)这两个时间点添加，效果逐渐下降，抑制率分别为28.19％和11.68％。阳性对照唾液链球菌K12在6h添加有显著效果，可达24.24％，在12、24h时便没有显著的抑制效果了。
实施例6：植物乳杆菌CCFM1214与具核梭杆菌的共聚能力
乳杆菌与致病菌的共聚能力也是其发挥口腔益生特性的关键，将培养好的具核梭杆菌(或乳杆菌)菌液，在6000r/min、4℃的条件下离心10min，弃上清，将收集到的菌体用PBS缓冲液重悬洗涤，6000r/min，4℃，离心10min，重复两次，向最后收集到的菌体中加入原始菌液体积的PBS缓冲液并混匀，在600nm波长下测定菌悬液吸光度，记录此时的吸光值，乳杆菌为A1，具核梭杆菌为A2。
将乳杆菌菌悬液与具核梭杆菌菌悬液等体积混合，于37℃下，分别孵育2h，4h，8h，在600nm波长下测定混合菌悬液吸光度，记录此时的吸光值为Axh，Axh是静止孵育xh后细菌悬液上清的吸光值。共聚率C(％)＝[1-2Axh/(A1+A2)]×100。图5结果显示，植物乳杆菌CCFM1214与具核梭杆菌有较强的共聚能力，共聚率是71.44％。
实施例7：乳杆菌上清液对具核梭杆菌产VSCs相关基因的影响
具核梭杆菌产VSCs相关基因中，Fn1220贡献80％以上的作用。采用荧光定量PCR方法分别考察具核梭杆菌中与产VSCs相关的基因Fn1220在有无乳杆菌上清液(或灭活菌悬液)存在的情况下的表达差异情况。提取总RNA，并反转录成cDNA，将合成的cDNA模板于-20℃保存备用。采用表1中设计获得的引物进行荧光定量PCR，并以16S rRNA基因作内参基因。结果如图6所示，CCFM1215上清液、灭活菌悬液都能通过显著降低Fn1220的表达量，从而抑制具核梭杆菌产VSCs。
表2引物序列
实施例8：益生菌菌粉的制备
菌泥：植物乳杆菌CCFM1214用食品级MRS培养基37℃培养24h，离心弃上清收集菌泥，无菌水洗涤再离心弃上清收集菌泥。
冻干保护剂：脱脂乳粉200g/L，甘露醇300g/L，菌泥和冻干保护剂的质量比例是1:3。
冻干：将菌泥与冻干保护剂混合均匀后，于-80℃预冷过夜，再置于冻干机进行冻干。
菌粉：将冻干的菌粉与低聚果糖混合，使得每克含有109CFU/g的活菌。包装，每袋菌粉2g。
安慰剂：每袋2g低聚果糖，形状、气味、包装等与菌粉一致。
实施例9：益生菌粉改善口臭的人群实验
一、志愿者招募及实验流程
志愿者招募的纳入标准：Halimeter检测值>200ppb，1个月内未使用抗生素；排除标准：抽烟，处于孕期。
志愿者共招募30名，随机分成2组，安慰剂组15人，益生菌组15人。实验共为期5周，4周服用菌粉(安慰剂组服用安慰剂)，期间每日餐后30min服用一袋菌粉，1周洗脱期，期间不服用菌粉(安慰剂组不服用安慰剂)。从服用菌粉的第一天起算为第1天，第7、14、28、35天需要用Halimeter口臭仪进行口气的检查。
二、检测方法
Halimeter口臭仪检测：要求志愿者检查前禁食禁水2h，采样前，受试者闭口3min，将吸管的末端插入患者口中，深度约为2.5cm，嘴唇应几乎闭合，嘴唇与吸管间允许有一点空隙，不能将嘴唇与牙齿压在吸管上。采样过程中，应该通过鼻子进行呼吸。当仪器显示板数值升至最高值稳定后开始下降时，记录最高值，并检测三次取平均值，结果见表3。
表3志愿者服用菌粉前后口气值的变化(ppb)
注：**p<0.01，益生菌组干预后与基线期相比；#p<0.05，安慰剂组干预后与基线期相比
三、实验结果
基线期，安慰剂组与益生菌组的口气值没有显著区别的，当服用菌粉1周后，益生菌组的口气值有了显著的下降(p<0.01)，下降了40.67％，而安慰剂组无显著的变化。服用两周后，益生菌组口气值下降极显著(p<0.01)，安慰剂组也有显著的降低(p<0.05)，可能是由于心理作用的影响，因为口气也会收到生理和心理的影响，但是安慰剂组的下降效果是短暂的，且不稳定的。益生菌组整体呈下降的趋势，服用四周后，口气值下降了44.29％，在洗脱一周后仍有显著效果(p<0.01)。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
SEQUENCE LISTING
<110> 江南大学
<120> 一株能够抑制具核梭菌并改善口气的植物乳杆菌
<130> BAA211888A
<160> 4
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
agagtttgat cctggctcag 20
<210> 2
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
gtcatcgtgc acacagaatt gctg 24
<210> 3
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
tgcttcatct ccattgcttt ca 22
<210> 4
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
atcataaact gctggaatac caccta 26
Claims (8)
1.植物乳杆菌，拉丁名为Lactobacillus plantarum CCFM1214于2021年12月17日，保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，保藏编号为GDMCC No: 62140。
2.权利要求1所述植物乳杆菌，拉丁名为Lactobacillus plantarum CCFM1214在制备用于抑制具核梭杆菌生物膜形成、用于抑制具核梭杆菌生长、用于缓解口臭或者用于减少具核梭杆菌生成挥发性硫化物的量的产品中的应用。
3.用于抑制具核梭杆菌生物膜形成的产品，其特征在于，含有权利要求1所述植物乳杆菌，拉丁名为Lactobacillus plantarum CCFM1214的活细胞。
4.用于抑制具核梭杆菌生长的产品，其特征在于，含有权利要求1所述植物乳杆菌，拉丁名为Lactobacillus plantarum CCFM1214的活细胞。
5.用于缓解口臭的产品，其特征在于，权利要求1所述植物乳杆菌，拉丁名为Lactobacillus plantarum CCFM1214的活细胞。
6.用于抑制具核梭杆菌表达基因Fn1220的产品，其特征在于，含有权利要求1所述植物乳杆菌，拉丁名为Lactobacillus plantarum CCFM1214的活细胞。
7.用于减少具核梭杆菌生成挥发性硫化物的量的产品，其特征在于，含有权利要求1所述植物乳杆菌，拉丁名为Lactobacillus plantarum CCFM1214的活细胞。
8.根据权利要求2~7任一所述的产品，其特征在于，所述产品包括：微生物制剂、固体饮料、口气清新剂、牙膏、漱口水。
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| GR01 | Patent grant | ||
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