CN113005055A - 预防和/或治疗牙周炎的植物乳杆菌、其培养物及其制备和应用 - Google Patents

预防和/或治疗牙周炎的植物乳杆菌、其培养物及其制备和应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及微生物技术领域，公开了预防和/或治疗牙周炎的植物乳杆菌、其培养物及其制备和应用。该植物乳杆菌，名称为植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)CCFM1137，于2020年8月1日保藏于广州市先烈中路100号大院59号楼5楼的广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No：61114。该植物乳杆菌可以抑制牙龈卟啉单胞菌、中间普氏菌和具核梭杆菌混菌生物膜的形成；可以使牙周炎细胞模型中炎症因子含量降低；可以使牙周炎细胞模型中跨膜转运蛋白的表达量增加；可用于预防和/或治疗口腔疾病及抑制中间普氏菌、牙龈卟啉单胞菌和/或具核梭杆菌。

Description

预防和/或治疗牙周炎的植物乳杆菌、其培养物及其制备和 应用
技术领域
本发明属于微生物技术领域，具体涉及预防和/或治疗牙周炎的植物乳杆菌、其培养物及其制备和应用。
背景技术
牙周炎是一种发生在口腔支持组织的感染性炎症疾病。牙周炎通常伴随口臭、牙龈肿痛出血、牙齿松动、咀嚼功能紊乱等症状，同时也是成人牙齿缺失的首要原因。越来越多的研究表明，牙龈卟啉单胞菌、具核梭杆菌、中间普氏菌等牙周炎致病菌与多种全身疾病密切相关，如糖尿病、阿尔兹海默症、结肠癌等。
牙周炎是多因素疾病，除牙菌斑微生物及其产物是必不可少的始动因子以外，牙周炎的发生还受其他局部刺激因素的影响和全身因素的调控。牙菌斑微生物是牙周炎发生的先决条件，宿主与牙周炎致病菌之间的相互作用很大程度上决定了牙周炎的发展与严重程度。牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis)和中间普氏菌(Prevotellaintermedia)是目前公认的主要牙周炎致病菌。牙龈卟啉单胞菌可以侵入宿主细胞，释放多种毒力因子，从而促进骨质的吸收和破坏，影响病变牙槽骨重建。而中间普氏菌通过直接侵袭口腔细胞、干扰宿主的免疫反应等方式造成破坏牙周组织的破坏。除牙龈卟啉单胞菌和中间普氏菌外，在牙周炎患者病灶位点中也经常检测到具核梭杆菌。具核梭杆菌(Fusobacterium nucleatum)能分泌多种凝集素，主导属内和属间的细菌黏附共聚，因此认为具核梭杆菌在牙菌斑生物膜的形成和成熟过程中，起到了“桥梁”的作用。
除了牙菌斑微生物作用外，牙龈组织的损伤更多是由机体产生的免疫反应引起。虽然牙周组织破坏的机制仍不完全明确，但随着对牙周炎发病机制的进一步了解发现，菌斑微生物及其代谢产物可以刺激宿主引发症反应，产生释放多种炎症因子，例如IL-1β、IL-8、TNF-α等，引起牙周组织炎性损伤，最终导致牙槽骨丧失。
细胞间的紧密连接是结合上皮细胞中最重要的结构，通常由细胞间跨膜转运蛋白和支架蛋白组成。当牙周炎进一步恶化时，便会破坏细胞间的紧密连接。Claudin、Occludin作为常见的跨膜转运蛋白，控制着细胞旁路和各个细胞之间的半渗透压。
牙周洁治术是治疗牙周炎使用范围最为广泛的方法。洁治术利用物理破碎刮除的方式除去患牙附近的牙菌斑、牙结石，而后对患牙的病灶区进行治疗。除了基础的牙周洁治以外，临床上会根据牙周炎的严重程度和病因使用不同的辅助手段。在众多的辅助手段中，药物治疗是目前最常见的方法。通过使用抗生素类药物，治疗这类由细菌感染导致的牙周疾病。但临床调查发现，长期使用甲硝唑、盐酸米诺等药物会引起部分患者胃部不适并增加药品不良反应的概率，导致人体中的微生物出现耐药性的现象，同时也会破坏口腔正常的微生态环境。而以乳酸菌为主的细菌替代疗法越来越受到的关注。乳酸菌通过代谢抑菌产物、竞争粘附致病菌所在位点抑制致病菌的增殖和调节机体口腔免疫，维持口腔生态的平衡，对改善口腔健康，具有潜在的应用价值。
发明内容
本发明的第一方面的目的，在于提供一株植物乳杆菌。
本发明的第二方面的目的，在于提供一种植物乳杆菌培养物。
本发明的第三方面的目的，在于提供第二方面的植物乳杆菌培养物的制备方法。
本发明的第四方面的目的，在于提供一种第一方面的植物乳杆菌和/或第二方面的植物乳杆菌培养物在制备产品中的应用。
本发明的第五方面的目的，在于提供一种产品。
本发明的第六方面的目的，在于提供一种产品的制备方法。
为了实现上述目的，本发明所采取的技术方案是：
本发明的第一个方面，提供一株植物乳杆菌，名称为植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)CCFM1137，于2020年8月1日保藏于广州市先烈中路100号大院59号楼5楼的广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No：61114。
所述植物乳杆菌来源于重庆地区的泡菜水样本；其16S rDNA序列如SEQ ID NO.1所示；其菌落为圆形，呈乳白色，表面光滑，边缘整齐。菌体形态为杆状，不运动、不产芽孢，革兰氏染色结果为阳性。
本发明的第二个方面，提供一种植物乳杆菌培养物，其通过培养第一方面的植物乳杆菌得到。
本发明的第三个方面，提供第二方面的植物乳杆菌培养物的制备方法，包括如下步骤：将第一方面的植物乳杆菌接种于培养基中，培养，得到植物乳杆菌培养物。
优选地，所述植物乳杆菌的接种量为所述培养基的1～5％(v/v)。
优选地，所述培养基为MRS培养基。
优选地，所述培养的条件为35～39℃下培养20～28h。
本发明的第四个方面，提供第一方面的植物乳杆菌和/或第二方面的植物乳杆菌培养物制备产品中的应用。
优选地，所述产品为：
(1)预防和/或治疗口腔疾病的产品；或
(2)抑制中间普氏菌、牙龈卟啉单胞菌和/或具核梭杆菌的产品。
优选地，所述口腔疾病为牙周炎和龋齿中的至少一种。
优选地，所述产品为食品、药品和日化产品中的至少一种。
优选地，所述食品包括酸奶、口香糖。
优选地，所述日化产品包括漱口水、牙膏。
本发明的第五个方面，提供一种产品，包含第一方面的植物乳杆菌和/或第二方面的植物乳杆菌培养物。
优选地，所述植物乳杆菌在所述产品中的含量大于等于5.49×107CFU/g。
优选地，所述产品还包含植物提取物。
优选地，所述植物提取物在所述产品中的含量大于等于90.6mg/g。
优选地，所述植物提取物为金银花和黄芩的提取物。
优选地，所述金银花和黄芩的提取物的制备方法为：取金银花、黄芩与水混合，煎煮，过滤得滤液，浓缩滤液，加麦芽糊精，干燥，得到金银花和黄芩的提取物。
优选地，所述产品为：
(1)预防和/或治疗口腔疾病的产品；或
(2)抑制中间普氏菌、牙龈卟啉单胞菌和/或具核梭杆菌的产品。
优选地，所述口腔疾病为牙周炎和龋齿中的至少一种。
优选地，所述产品为食品、药品和日化产品中的至少一种。
优选地，所述食品包括酸奶、口香糖。
优选地，所述日化产品包括漱口水、牙膏。
本发明的第六个方面，提供一种产品的制备方法，将第一方面的植物乳杆菌和/或第二方面的植物乳杆菌培养物与植物提取物混合，得到。
优选地，所述植物乳杆菌在所述产品中的含量大于等于5.49×107CFU/g。
优选地，所述植物提取物在所述产品中的含量大于等于90.6mg/g。
优选地，所述植物提取物为金银花和黄芩的提取物。
优选地，所述金银花和黄芩的提取物的制备方法为：取金银花、黄芩与水混合，煎煮，过滤得滤液，浓缩滤液，加麦芽糊精，干燥，得到金银花和黄芩的提取物。
优选地，所述产品为：
(1)预防和/或治疗口腔疾病的产品；或
(2)抑制中间普氏菌、牙龈卟啉单胞菌和/或具核梭杆菌的产品。
优选地，所述口腔疾病为牙周炎和龋齿中的至少一种。
优选地，所述产品为食品、药品和日化产品中的至少一种。
优选地，所述食品包括酸奶、口香糖。
优选地，所述日化产品包括漱口水、牙膏。
本发明的有益效果是：
本发明提供了一株植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)CCFM1137，该植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)：(1)可以抑制牙龈卟啉单胞菌、中间普氏菌和具核梭杆菌混菌生物膜的形成，使生物膜量减少42.18％；(2)可以使牙周炎细胞模型中炎症因子含量降低：其中，TNF-α的含量由134.33pg/mL降低到98.44pg/mL、IL-8的含量由147.70pg/mL降低到127.67pg/mL、IL-1β的含量由18.32pg/mL降低到15.44pg/mL；(3)可以使牙周炎细胞模型中跨膜转运蛋白的表达量增加：其中，Occludin的表达量由0.42升高到0.74，Claudin-1的表达量由0.55升高到0.92；可见，该植物乳杆菌可用于预防和/或治疗口腔疾病及抑制中间普氏菌、牙龈卟啉单胞菌和/或具核梭杆菌。
本发明提供了一种包含植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)CCFM1137和/或植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)CCFM1137培养物的产品，该产品：(1)可使患有牙周炎的大鼠体重，尤其包含植物乳杆菌和植物提取物的产品可使患有牙周炎的大鼠体重从245.20g增加到342.58g；(2)可使患有牙周炎的大鼠牙龈指数GI降低，并且显著缓解牙龈出血，同时降低探诊深度PD，抑制牙周袋的形成，尤其包含植物乳杆菌和植物提取物的产品使患有牙周炎的大鼠牙龈指数GI降低86％(与模型组相比)，接近空白对照组；(3)可以有效减少牙龈卟啉单胞菌和具核梭杆菌在大鼠口腔中的定植量；(4)可以减少患有牙周炎的大鼠牙槽骨吸收量，缓解牙周炎大鼠牙槽骨的骨质流失，尤其包含植物乳杆菌和植物提取物的产品使患有牙周炎的大鼠牙槽骨吸收量从6.841mm减少到2.142mm；可见，本发明提供的产品能够预防和或治疗牙周炎。
植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)是益生菌的一种，目前已被纳入卫生部下发的《可用于食品的菌种名单》，而植物提取物由金银花和黄芩提取而成，用于预防和/或治疗牙周炎的产品(如药品、食品或日化产品等)中时，安全性较高。
附图说明
图1是不同组的牙周炎细胞模型中TNF-α的含量图：两者之间不存在相同字母表示两者之间存在显著性差异性。
图2是不同组的牙周炎细胞模型中IL-1β的含量图：两者之间不存在相同字母表示两者之间存在显著性差异性。
图3是不同组的牙周炎细胞模型中IL-8的含量图：两者之间不存在相同字母表示两者之间存在显著性差异性。
图4是不同组的牙周炎细胞模型中Occludin的表达量图：*表示差异性显著(p＜0.05)。
图5是不同组的牙周炎细胞模型中Claudin-1的表达量图：*表示差异性显著(p＜0.05)。
图6是植物乳杆菌CCFM1137对溶菌酶的耐受性图。
图7是大鼠牙周炎建模及防治实验流程图：其中，P.g表示牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis)；F.n表示具核梭杆菌(Fusobacterium nucleatum)。
图8是不同组的牙周炎大鼠的体重变化图。
图9是不同组的牙周炎大鼠口腔中牙龈卟啉单胞菌定植情况图。
图10是不同组的牙周炎大鼠口腔中具核梭杆菌定植情况图。
图11是不同组的牙周炎大鼠的牙槽骨流失情况图。
具体实施方式
以下通过具体的实施例对本发明的内容作进一步详细的说明。
本实施例中所使用的材料、试剂等，如无特别说明，为从商业途径得到的试剂和材料。
下述实施例中涉及的牙龈卟啉单胞菌购自广东省微生物菌种保藏中心，产品编号为：GDMCC 1.851；下述实施例中涉及的具核梭杆菌购自广东省微生物菌种保藏中心，产品编号为：GDMCC 1.1290；下述实施例中涉及的中间普氏菌购自广东省微生物菌种保藏中心，产品编号为：GDMCC 1.849；下述实施例中涉及的口腔上皮癌细胞Ca9-22购自北纳生物有限公司；下述实施例中涉及的牙龈卟啉单胞菌脂多糖购自法国InvivoGen公司；下述实施例中涉及的溶菌酶购自生工生物工程(上海)股份有限公司；下述实施例中DMEM培养液、胎牛血清购于美国Gibco公司；下述实施例中涉及的菌株CCFM8724记载于ZL2012100464308的专利文本中。
下述实施例中涉及的培养基如下：
MRS培养基：酵母粉5.0g/L、牛肉膏10.0g/L、蛋白胨10.0g/L、葡萄糖20.0g/L、无水乙酸钠2.0g/L、柠檬酸氢二铵2.0g/L、三水合磷酸氢二钾2.6g/L、一水合硫酸锰0.25g/L、七水合硫酸镁0.5g/L和吐温-80 1mL/L，pH 6.2～6.4。
BHI培养基：胰蛋白胨10.0g/L、牛心浸粉17.5g/L、氯化钠5.0g/L、酵母提取物5.0g/L、葡萄糖2.0g/L、十二水合磷酸氢二钠2.5g/L、一水合L-半胱氨酸盐酸盐0.4g/L、0.5％维生素K1-氯化血红素1mL/L，pH 7.2～7.4。
下述实施例中涉及的菌悬液的制备方法如下：
具核梭杆菌菌悬液：将具核梭杆菌菌体以占BHI培养基总体积2％的接种量接种至BHI培养基中，于37℃厌氧培养48h后用BHI培养基调节菌液浓度为1×109CFU/mL。
牙龈卟啉单胞菌菌悬液：将牙龈卟啉单胞菌菌体以占BHI培养基总体积2％的接种量接种至BHI培养基中，于37℃厌氧培养48h后用BHI培养基调节菌液浓度为1×109CFU/mL。
中间普氏菌菌悬液：将中间普氏菌菌体以占BHI培养基总体积2％的接种量接种至BHI培养基中，于37℃厌氧培养48h后用BHI培养基调节菌液浓度为1×109CFU/mL。
下述实施例中涉及的PBS缓冲液的配备方法如下：
PBS缓冲液：氯化钠8g/L，十二水合磷酸氢二钠3.63g/L，磷酸二氢钾0.24g/L，氯化钾0.2g/L，pH 7.4。
下述实施例中涉及的饲料配方如下：
Keyes 2000饲料(w/w)：奶粉28％，蔗糖56％，小麦粉6％，酵母4％，苜蓿粉3％，肝粉1％，盐2％。
实施例1植物乳杆菌的筛选及菌种鉴定
1、筛选
以来源于重庆地区的泡菜水为样本，将样本经预处理后，在20％甘油中保存于-80℃冰箱，取出解冻后，混匀样本，吸取0.5mL样本加到4.5mL 9g/L生理盐水进行梯度稀释，选择合适的梯度稀释液涂布100μL涂布在含有20g/L琼脂的MRS培养基上，于37℃倒置培养48h，此时平板上能观察到白色菌落出现。用接种环挑取若干植物乳杆菌的典型菌落，在含有20g/L琼脂的MRS培养基上划线纯化三次，挑取若干纯化后的单菌落转接至MRS培养基中增菌，30％甘油保藏，分别得到菌株CCFM1137和同期同法筛选的菌株1～14；其中，植物乳杆菌的典型菌落呈小的白色半透明圆形。
2、鉴定
分别提取菌株CCFM1137和菌株1～14的基因组，将菌株CCFM1137和菌株1～14的16SrDNA进行扩增和测序(由英维捷基公司进行，CCFM1137扩增得到的16S rDNA的核苷酸序列为：CCCCATCGTTGTGTTTGGCCTTCCCAGAAATGTCATCAGCAATGATCAACAATGGCTTGCCTTGTTCAACGATGGATTGTAATAGTGGTAAGATATCTTGAATGTTTGAAATCTTCTTATCAGTAATTAAGATATATGGATTGTCAAGATCCGCTTCCATCTTATCATTATCAGTAACCATGTATTGTGATAAGTAGCCGCGGTCGAATTGCATCCCTTCAACAACGTCTAAGCTAGTATCAACACCACGTGATTCTTCAATCGTGATAACACCGTCATGACCAACTTTTTCCATGGCTTCGGCAATCAATTTACCAGTTTCTTCACTTGCTGAAGATACAGAAGCGATTTGCGCAATATCTTCTTGCGTCTTAACTTCGTGTGCCATAGCGTGTAATGAGTCAACCGCCGTCTTAGTAGCTTCTTCAATCCCACGACGAATGCCAACAGGGTTGGC(SEQ ID NO.1)，将该序列在NCBI中进行核酸序列比对，结果显示菌株CCFM1137和菌株1～14均为植物乳杆菌，分别命名为植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)CCFM1137和植物乳杆菌(Lactobacillus plantar um)1～14。
实施例2植物乳杆菌对混菌生物膜量的影响
实验分为两组，分别为植物乳杆菌介导组和空白对照组，每组重复6次；
其中，植物乳杆菌介导组按照如下方法处理：
(1)将植物乳杆菌CCFM1137、植物乳杆菌CCFM8724、植物乳杆菌1～14的菌体分别以占MRS培养基总体积2％的接种量接种至MRS培养基中，于37℃培养24h，获得培养液，将培养液分别于8000r/min、4℃下离心5min，获得上清液，将上清液分别以0.22μm无菌滤膜过滤，分别获得菌浓为109CFU/mL的植物乳杆菌CCFM1137、植物乳杆菌CCFM8724、植物乳杆菌1～14的上清；
(2)在96孔板中加入中间普氏菌、牙龈卟啉单胞菌和具核梭杆菌菌悬液各40μL，得到混合菌液；再分别加入步骤(1)得到的植物乳杆菌CCFM1137、植物乳杆菌CCFM8724、编号为1～14植物乳杆菌(表1)的上清80μL，于37℃厌氧培养48h，分别得到混菌生物膜；
(3)分别将在96孔板上得到的混菌生物膜用PBS缓冲液清洗2遍，并在25℃下静置晾干后，向96孔板中分别加入100μL浓度为0.1％(v/v)的结晶紫溶液，对混菌生物膜染色30min，将染色后的混菌生物膜分别用PBS缓冲液清洗2遍后，在96孔板中加入100μL浓度为95％(v/v)的乙醇溶解，于酶标仪中读取OD600下的吸光度值，得到介导后的混菌生物膜量，通过介导后的混菌生物膜量计算植物乳杆菌CCFM1137或植物乳杆菌1～14介导后混菌生物膜的减少量；
空白对照组为：在植物乳杆菌介导组的基础上，将植物乳杆菌CCFM1137上清替换为PBS缓冲液，得到空白对照组的混菌生物膜量；
介导后混菌生物膜的减少量(％)＝(空白对照组的混菌生物膜量-介导后的混菌生物膜量)/空白对照组的混菌生物膜量。
计算结果见表1，16株植物乳杆菌对混菌生物膜的减少量在43％～10％之间，其中，植物乳杆菌CCFM1137的抑制效果最好，经植物乳杆菌CCFM1137介导后，混菌生物膜量减少了42.18％。
可见，植物乳杆菌CCFM1137能够有效抑制由中间普氏菌、牙龈卟啉单胞菌和具核梭杆菌所形成的混菌生物膜，有效缓解牙周炎的形成。
表1不同植物乳杆菌介导后混菌生物膜的减少量
组别 吸光度 生物膜减少量
空白对照组 3.639±0.158 0.00％
植物乳杆菌CCFM1137 2.104±0.049 42.18％
植物乳杆菌CCFM8724 2.470±0.042 32.12％
植物乳杆菌1 2.252±0.052 38.13％
植物乳杆菌2 2.318±0.096 36.29％
植物乳杆菌3 2.393±0.049 34.23％
植物乳杆菌4 2.447±0.049 32.76％
植物乳杆菌5 2.470±0.042 32.12％
植物乳杆菌6 2.545±0.119 30.07％
植物乳杆菌7 2.593±0.039 28.74％
植物乳杆菌8 2.657±0.033 26.99％
植物乳杆菌9 2.868±0.055 21.20％
植物乳杆菌10 3.037±0.056 16.53％
植物乳杆菌11 3.078±0.532 15.42％
植物乳杆菌12 3.083±0.262 15.29％
植物乳杆菌13 3.221±0.022 11.50％
植物乳杆菌14 3.252±0.024 10.63％
实施例3植物乳杆菌对牙周炎细胞模型中TNF-α、IL-8、IL-1β含量的影响
牙周炎细胞模型构建：将口腔上皮癌细胞Ca9-22接种于含有10％(v/v)胎牛血清的DMEM培养基中，于37℃、气相含5％(v/v)CO2的细胞培养箱中培养活化至细胞浓度为2×105个/mL后，将Ca9-22细胞培养液添加至6孔板中，每孔加入2mL；将6孔板于37℃预孵育2h后，向每孔中加入1μg/mL的牙龈卟啉单胞菌脂多糖(LPS)。
实验分为三组，分别为植物乳杆菌介导组、阴性对照组(CELL+LPS组)和空白对照组(CELL组)，每组重复6次；
其中，植物乳杆菌介导组按照如下方法处理：
(1)将植物乳杆菌CCFM1137、植物乳杆菌CCFM8724、植物乳杆菌1～6的菌体分别以占MRS培养基总体积2％的接种量接种至MRS培养基中，于37℃培养24h，获得培养液，将培养液分别于8000r/min、4℃下离心5min，获得上清液，将上清液分别以0.22μm无菌滤膜过滤，分别获得菌浓为109CFU/mL的植物乳杆菌CCFM1137、植物乳杆菌CCFM8724、植物乳杆菌1～6的上清；
(2)分别向牙周炎细胞模型中加入3％(v/v)步骤(1)得到的植物乳杆菌CCFM1137、植物乳杆菌CCFM8724、植物乳杆菌1～6的上清，于37℃继续孵育4h；收集6孔板中的细胞上清液，3000r/min、4℃下离心20min；使用ELISA试剂盒测定细胞上清液中TNF-α、IL-1β和IL-8的含量；
阴性对照组(CELL+LPS组)为：在牙周炎细胞模型中加入3％(v/v)的MRS培养基；
空白对照组(CELL组)为：在植物乳杆菌介导组的基础上，不在6孔板中添加牙龈卟啉单胞菌脂多糖，以及3％(v/v)的植物乳杆菌CCFM1137、植物乳杆菌CCFM8724、植物乳杆菌1～6的上清。
检测结果见图1～3：相比较空白对照组，阴性对照组牙周炎细胞模型中各项炎症因子都显著上升；而植物乳杆菌CCFM1137可以显著降低各项炎症因子，其中，植物乳杆菌CCFM1137对调节IL-1β的效果为所有植物乳杆菌中最佳，对于TNF-α、IL-8也具有显著的下调作用，具体体现在：CCFM1137可以将牙周炎细胞模型中TNF-α的含量由134.33pg/mL降低到98.44pg/mL，降低了26％；IL-8的含量由147.70pg/mL降低到127.67pg/mL，降低了14％；IL-1β的含量由18.32pg/mL降低到15.44pg/mL，降低了16％。
实施例4植物乳杆菌对牙周炎细胞模型中Occludin、Claudin-1表达量的影响
牙周炎细胞模型构建：将口腔上皮癌细胞Ca9-22接种于含有10％(v/v)胎牛血清的DMEM培养基中，于37℃、气相含5％(v/v)CO2的细胞培养箱中培养活化至细胞浓度为2×105个/mL后，将Ca9-22细胞培养液添加至6孔板中，每孔加入2mL；将6孔板于37℃预孵育2h后，向每孔中加入1μg/mL的牙龈卟啉单胞菌脂多糖。
实验分为三组，分别为植物乳杆菌介导组、阴性对照组(CELL+LPS组)和空白对照组(CELL组)，每组重复6次；
其中，植物乳杆菌介导组按照如下方法处理：
(1)将植物乳杆菌CCFM1137、植物乳杆菌CCFM8724、植物乳杆菌1～2的菌体分别以占MRS培养基总体积2％的接种量接种至MRS培养基中，于37℃培养24h，获得培养液，将培养液分别于8000r/min、4℃下离心5min，获得上清液，将上清液分别以0.22μm无菌滤膜过滤，获得菌浓为109CFU/mL的植物乳杆菌CCFM1137、植物乳杆菌CCFM8724、植物乳杆菌1～2的上清；
(2)分别向牙周炎细胞模型中添加3％(v/v)的植物乳杆菌CCFM1137、植物乳杆菌CCFM8724、植物乳杆菌1～2的上清，于37℃继续孵育12h；用Trizol法提取孵育后的6孔板中的细胞总RNA，根据反转录试剂盒说明书反转录成cDNA，通过荧光定量PCR检测细胞中Occludin和Claudin-1的表达量；
阴性对照组(CELL+LPS组)为：在牙周炎细胞模型中加入3％(v/v)的MRS培养基；
空白对照组(CELL组)为：在植物乳杆菌介导组的基础上，不在6孔板中添加牙龈卟啉单胞菌脂多糖，以及，3％(v/v)的植物乳杆菌CCFM1137、植物乳杆菌CCFM8724、植物乳杆菌1～2的上清。
Claudin、Occludin作为常见的跨膜转运蛋白，控制着细胞旁路和各个细胞之间的半渗透压。牙龈卟啉单胞菌通过释放脂多糖等毒力因子降解Occludin和Claudin-1等连接蛋白，导致上皮细胞，内皮细胞和间皮细胞的结构被破坏，功能受损，破坏细胞内环境的稳定。而由检测可知(结果见图4～5)，相比于空白对照组，阴性对照组牙周炎细胞模型中Occludin和Claudin-1的表达量明显下调，相较于植物乳杆菌1～2，植物乳杆菌CCFM1137可显著上调Occludin和Claudin-1，表达量与空白组接近(使牙周炎细胞模型中Occludin的表达量由0.42升高到0.74、Claudin-1的表达量由0.55升高到0.92)。可见，植物乳杆菌CCFM1137对口腔上皮屏障具有很好的保护作用。
实施例5植物乳杆菌对溶菌酶的耐受性
实验分为两组，分别为植物乳杆菌介导组和空白对照组，每组重复6次；
植物乳杆菌介导组：
(1)在96孔培养板中分别加入200μL MRS培养基后，分别添加不同浓度的溶菌酶溶液使得MRS培养基中溶菌酶的终浓度分别为0.4、0.8、1.2、1.6、2.0、3.0mg/mL，将植物乳杆菌CCFM1137菌体以占MRS培养基总体积2％的的接种量接种至MRS培养基中，于37℃培养24h，获得菌液；
(2)将菌液以5％(v/v)的接种量接种到96孔培养板中，37℃培养24h；24h后，测定96孔培养板中培养液在OD600下的吸光度；
空白对照组继续于96孔培养板中添加与溶菌酶溶液等体积的无菌水；
根据吸光度值判断植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)CCFM1137对溶菌酶的耐受性，检测结果见图6。
如图6所示，以实验组OD值/对照组OD值×100％>60％为依据，作为植物乳杆菌CCFM1137对溶菌酶具有高耐受性的标准，植物乳杆菌CCFM1137对溶菌酶的耐受临界值在1.6～2.0mg/mL之间，远高于人口腔唾液中溶菌酶的浓度(0～57μg/mL)，说明，植物乳杆菌CCFM1137具备在口腔环境中存活的能力。
实施例6预防和/或治疗牙周炎的产品的制备
具体步骤如下：
1、制备益生菌组分(本实施例仅以菌悬液为例制备益生菌组分)：
制备植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)CCFM1137菌悬液：将植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)CCFM1137菌体以占MRS培养基总体积2％的接种量接种至MRS培养基中，于37℃厌氧培养24h后，调节菌液浓度为1×109CFU/mL。
2、制备植物提取物组分：
(1)取金银花和黄芩按质量比1：1混合置于容器中，向容器中加水(按照与原生药质量比为1：10的比例)混合后煎煮2h后，过滤得滤液；
(2)按照步骤(1)相同的方法，向步骤(1)中除去滤液的容器中加水(按照与原生药质量比为1：10的比例)混合后煎煮2h后，得到滤液；
(3)将步骤(1)和(2)两次滤液合并，采用减压浓缩的方式进行浓缩提取后，得到提取液，向提取液中加入1倍质量麦芽糊精，搅拌至完全溶解后，采用喷雾干燥的方式，获得植物提取物粉末。
将植物提取物粉末以0.65％(w/w)充分溶于无菌水中，得到植物提取物溶液。
实施例7牙周炎大鼠实验设计方案
选择雄性、5周龄、体重为150～170g的SPF级Wistar大鼠30只，按每组平均体重一致的原则随机分成5组，每组6只。5组分别为空白组(Control组)、模型组(Model组)、植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)CCFM1137组(CCFM1137组)、植物提取物组(Z组)、预防和/或治疗牙周炎的产品即：植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)CCFM1137与植物提取物溶液混合组(ZJ组)。
具体实验步骤如下：
1、牙周炎建模：
(1)丝线结扎:除空白组(不做建模处理，正常饮食)外，分别对Model组、CCFM1137组、Z组、ZJ组的大鼠肌肉注射200mg/kg的盐酸氯胺酮对大鼠进行麻醉，用0.22mm的正畸钢丝对大鼠左上颌第二磨牙进行丝线结扎。7天恢复期过程中，每只老鼠每2天口服一次20mg氨苄青霉素。
(2)管饲致病菌：7天恢复期结束后，用牙龈卟啉单胞菌和具核梭杆菌菌悬液进行侵染，同时对CCFM1137组、Z组和ZJ组进行防治；每2天一次，持续3次。具体方法如下：
其中，侵染的具体操作手法为：用无菌针管吸取牙龈卟啉单胞菌和具核梭杆菌菌悬液各1mL，进行管饲并禁食禁水半小时。
Model组：用无菌针管吸取牙龈卟啉单胞菌和具核梭杆菌菌悬液各1mL，进行管饲并禁食禁水半小时。
CCFM1137组：用无菌针管吸取牙龈卟啉单胞菌和具核梭杆菌菌悬液各1mL，进行管饲并禁食禁水半小时后，用无菌针管吸取实施例6中制备的益生菌组分植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)CCFM1137菌悬液1mL，进行防治并禁食禁水半小时；
Z组：用无菌针管吸取牙龈卟啉单胞菌和具核梭杆菌菌悬液各1mL，进行管饲并禁食禁水半小时后，用无菌针管吸取实施例6中制备的植物提取物组分植物提取物溶液1mL，进行防治并禁食禁水半小时；
ZJ组：用无菌针管吸取牙龈卟啉单胞菌和具核梭杆菌菌悬液各1mL，进行管饲并禁食禁水半小时后，用无菌针管分别吸取植物乳杆菌CCFM1137菌悬液和植物提取物溶液各0.5mL，先管饲植物提取物溶液30s后管饲植物乳杆菌CCFM1137菌悬液并禁食禁水半小时。
2、建模成功后继续防治
建模成功后，按照下述方法，每天对CCFM1137组、Z组和ZJ组再继续进行连续防治，持续21天，空白组、Model组正常喂食。
CCFM1137组：用无菌针管吸取实施例6中制备的益生菌组分植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)CCFM1137菌悬液1mL，进行管饲并禁食禁水半小时；
Z组：用无菌针管吸取实施例6中制备的植物提取物组分植物提取物溶液1mL，进行管饲并禁食禁水半小时；
ZJ组：用无菌针管分别吸取植物乳杆菌CCFM1137菌悬液和植物提取物溶液各0.5mL，先管饲植物提取物溶液30s后管饲植物乳杆菌CCFM1137菌悬液并禁食禁水半小时。
实验期间，Model组、CCFM1137组、Z组、ZJ组均喂以饲料Keyes 2000并在饮食中辅以添加有10％(m/m)蔗糖的蒸馏水，空白对照组正常饮食。大鼠分组情况见表2，实验流程见图7。
表2大鼠分组情况
组别 数量 饮食
空白组(Control组) 6 正常饮食
模型组(Model组) 6 饲料Keyes 2000加10％蔗糖水
CCFM1137组 6 饲料Keyes 2000加10％蔗糖水
Z组 6 饲料Keyes 2000加10％蔗糖水
ZJ组 6 饲料Keyes 2000加10％蔗糖水
实施例8植物提取物和/或植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)CCFM1137对牙周炎大鼠体重的影响
具体实验设计方案同实施例7，整个实期间，每隔一周对各组大鼠进行称重，比较各组大鼠生长情况。共测得6次体重，结果用平均值±标准差表示，如表3所示，其中第-1周为建模一周的体重；第0周为建模结束后各大鼠的体重；第1周～第4周为连续防治期间各大鼠体重。
表3不同组别的大鼠体重表
Figure BDA0002939159000000131
由图8及表3可知，在第四周时，模型组大鼠的平均体重为245.20±11.72g，相较于空白组大鼠体重(376.64±22.97g)显著下降(P＜0.05)，牙周炎能够明显影响模型组大鼠的进食造成体重下降。相较于模型组，CCFM1137组、Z组、ZJ组都可以缓解牙周炎造成的大鼠体重下降。其中植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)CCFM1137菌悬液和植物提取物溶液组合的效果最好，在第4周时，相较于模型组的平均体重，ZJ组的平均体重可以恢复至342.58±10.93g。
实施例9植物提取物和/或植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)CCFM1137对牙周炎大鼠牙龈指数GI和探诊深度PD的影响
具体实验设计方案同实施例7，待实验结束后，对大鼠进行肌肉注射200mg/kg的盐酸氯胺酮麻醉，使用牙周袋探诊针对牙龈指数和探诊深度进行评价。
采用Loe与Silness在1967年修订的检查方法对大鼠牙龈进行评分。评分标准如下：0＝牙龈健康；1＝牙龈轻度炎症：牙龈的颜色有轻度改变并轻度水肿，探诊不出血；2＝牙龈中等炎症：牙龈色红，水肿光亮，探诊出血；3＝牙龈严重炎症：牙龈明显红肿或有溃疡，并有自动出血倾向。结果用平均值±标准差表示。
探诊深度测量方法如下：使用牙周袋探诊针测量牙龈缘至牙周袋底或龈沟底的深度。分别检查大鼠左上颌第二磨牙的腭侧近中，腭侧正中，腭侧远中三点。结果用平均值±标准差表示。
由表4可知，模型组的牙龈指数GI和探诊深度PD均显著高于空白组(P＜0.05)。由Z组的数据可知，采用植物提取物溶液虽可以在一定程度上抑制牙龈出血，但其对于防治牙周袋形成的效果为所有组别中最差，效果并不理想。由CCFM1137组的数据可知，植物乳杆菌CCFM1137同样可以缓解由牙周炎引起的牙龈出血；并且，对于牙周袋的形成，植物乳杆菌CCFM1137菌悬液的治疗效果要优于植物提取物溶液。但是，由ZJ组的数据可知，使用本发明的产品的大鼠的牙龈指数GI与模型组相比，降低了86％，接近空白对照组；并且探诊深度PD与模型组相比，降低了64％，证明，采用本发明的产品，可显著缓解由牙周炎引起的牙龈出血和牙周袋的形成(P＜0.05)。
表4各组大鼠牙龈指数GI和探诊深度PD
组别 GI PD
空白组(Control组) 0.250±0.433<sup>c</sup> 0.488±0.119<sup>c</sup>
模型组(Model组) 2.333±0.471<sup>a</sup> 1.500±0.119<sup>a</sup>
CCFM1137组 0.667±0.745<sup>b</sup> 0.622±0.161<sup>bc</sup>
Z组 0.500±0.500<sup>b</sup> 0.706±0.243<sup>b</sup>
ZJ组 0.333±0.471<sup>bc</sup> 0.539±0.133<sup>bc</sup>
注：表中两者之间不存在相同小写字母代表两者之间存在显著性差异。
实施例10植物提取物和/或植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)CCFM1137对牙周炎大鼠口腔致病菌的影响
具体实验设计方案同实施例7，实验期间，使用灭菌镊子将灭菌纸尖插入牙周袋，采集大鼠左上颌第二磨牙龈下菌斑，放置约20s后取出，将纸尖插入有1mL无菌PBS的EP管中，稀释涂布于相应平板并计数，作为致病菌定植检验。本次实验共进行四次采样，采样时间分别为造模结束后的每一周。
检查不同防治方式对牙周炎致病菌定植情况的影响。其中，菌落计数用到的固体平板为：添加氨苄青霉素(12μg/mL)、5％(v/v)羊血和20g/L的BHI固体培养基，并结合菌落形态特征对大鼠口腔中的具核梭杆菌和牙龈卟啉单胞菌进行计数。计数结果见图9～10及表5～6。
表5不同组别在不同采样时间的牙龈卟啉单胞菌计数(lg CFU/mL)
Figure BDA0002939159000000151
表6不同组别在不同采样时间的具核梭杆菌计数(lg CFU/mL)
Figure BDA0002939159000000152
两次采样中，牙龈卟啉单胞菌与具核梭杆菌两种致病菌在Control组中均无定植。由图9～10及表5～6可知，植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)CCFM1137菌悬液、植物提取物溶液以及植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)CCFM1137菌悬液与植物提取物溶液组合均能在一定程度上减少牙龈卟啉单胞菌和具核梭杆菌的定植。
对于牙龈卟啉单胞菌，在第3～4周时，植物提取物溶液的抑制效果要略优于植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)CCFM1137菌悬液约1个数量级。到第4周时，植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)CCFM1137菌悬液与植物提取物溶液组合的效果最好，可以控制牙龈卟啉单胞菌在大鼠口腔中定植的生物量在103CFU/mL左右。
对于具核梭杆菌，在第4周时，植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)CCFM1137菌悬液可以将定植于大鼠口腔中的具核梭杆菌生物量控制在104CFU/mL左右。而植物提取物溶液对具核梭杆菌的抑制效果则并不理想，在第2周结束后，Z组具核梭杆菌的定植量开始出现上升的情况，接近于105CFU/mL。ZJ组在第3周的时候同样出现了上升的情况，但是在第4周时具核梭杆菌的定植量又开始下降，控制在104CFU/mL左右。ZJ组最终的具核梭杆菌定植量少于CCFM1137组和Z组。
综上，定期保持摄入植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)CCFM1137菌悬液可以有效抑制牙龈卟啉单胞菌和具核梭杆菌在口腔中的定植与增殖。当植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)CCFM1137菌悬液与植物提取物溶液混合使用时，对牙周炎致病菌牙龈卟啉单胞菌和具核梭杆菌的抑制效果最好，通过控制具核梭杆菌与牙龈卟啉单胞菌在口腔中的定植量，可以改善牙菌斑的形成。
实施例11植物提取物和/或植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)CCFM1137对牙周炎大鼠牙槽骨吸收量的影响
具体实验设计方案同实施例7，实验结束后，取下大鼠左侧上颌骨，置于10％的多聚甲醛溶液中固定3天，而后用清水漂洗并去除牙槽骨周围的软组织，保留硬组织。用体式显微镜观测量第二磨牙的釉牙骨质界到牙槽嵴顶的距离，每牙测量6个位点：颊侧的近、中、远3点和舌侧的近、中、远3点。各位点测量值之和为该牙的总牙槽骨吸收值，结果见表7。
表7各组大鼠的牙槽骨吸收量
组别 牙槽骨吸收量(mm)
空白组(Control组) 1.256±0.473<sup>a</sup>
模型组(Model组) 6.841±0.355<sup>c</sup>
CCFM1137组 2.561±0.783<sup>b</sup>
Z组 3.335±0.460<sup>bc</sup>
ZJ组 2.142±0.591<sup>b</sup>
由表7可知，Model组的牙槽骨吸收量显著大于Control组(P＜0.05)，平均值达到了6.841mm，同时也大于其他3组。防治组中，虽然植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)CCFM1137菌悬液和植物提取物溶液单独作用时，对于抑制由牙周炎引起的牙槽骨吸收具有一定的效果，但是，防治效果最好的是采用本发明的产品，即植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)CCFM1137菌悬液和植物提取物溶液混合使用的组合，其平均牙槽骨的吸收量为2.142mm，其效果均优于CCFM1137组和植物提取物组的效果。
实施例12植物提取物和/或植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)CCFM1137对牙周炎大鼠牙槽骨流失情况的影响
具体实验设计方案同实施例7，实验结束后，取下大鼠左侧上颌骨，置于10％的多聚甲醛溶液中固定3天，而后用清水漂洗并去除牙槽骨周围的软组织，保留硬组织。用体式显微镜观察大鼠牙槽骨吸收的情况，于20放大倍数下进行拍摄，结果见图11。
根据图11可知，Control组大鼠牙槽骨平滑，无明显缺失的情况，而Model组明显出现牙槽骨丧失，磨牙间隙变大的情况，牙槽骨呈现弹坑状缺失，牙根暴露，牙齿松动接近脱落，为牙周炎晚期的症状。
而植物提取物虽能在一定程度上缓解骨质吸收的情况，但是在第二和三颗磨牙处仍出现了弹坑状牙骨质的吸收，效果显然不如单独使用植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)CCFM1137菌悬液以及植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)CCFM1137菌悬液和植物提取物溶液的组合。CCFM1137组和ZJ组对于牙槽骨吸收的效果近似，两者混合使用的效果要略优于植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)CCFM1137菌悬液单独使用。因此，植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)CCFM1137菌悬液和植物提取物溶液组合使用对牙槽骨吸收具有良好的防治作用，长期摄入可以减少由于牙周炎引起的牙槽骨吸收和牙骨质流失。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 无限极(中国)有限公司
<120> 预防和/或治疗牙周炎的植物乳杆菌、其培养物及其制备和应用
<130>
<160> 1
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 457
<212> DNA
<213> Lactobacillus plantarum
<400> 1
ccccatcgtt gtgtttggcc ttcccagaaa tgtcatcagc aatgatcaac aatggcttgc 60
cttgttcaac gatggattgt aatagtggta agatatcttg aatgtttgaa atcttcttat 120
cagtaattaa gatatatgga ttgtcaagat ccgcttccat cttatcatta tcagtaacca 180
tgtattgtga taagtagccg cggtcgaatt gcatcccttc aacaacgtct aagctagtat 240
caacaccacg tgattcttca atcgtgataa caccgtcatg accaactttt tccatggctt 300
cggcaatcaa tttaccagtt tcttcacttg ctgaagatac agaagcgatt tgcgcaatat 360
cttcttgcgt cttaacttcg tgtgccatag cgtgtaatga gtcaaccgcc gtcttagtag 420
cttcttcaat cccacgacga atgccaacag ggttggc 457

Claims (10)

1.一株植物乳杆菌，名称为植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)CCFM1137，于2020年8月1日保藏于广州市先烈中路100号大院59号楼5楼的广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No：61114。
2.一种植物乳杆菌培养物，通过培养权利要求1所述的植物乳杆菌得到。
3.权利要求2所述的植物乳杆菌培养物的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：将权利要求1所述的植物乳杆菌接种于培养基中，培养，得到植物乳杆菌培养物。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：
所述培养基为MRS培养基；
所述培养的条件为35～39℃下培养20～28h。
5.权利要求1所述的植物乳杆菌和/或权利要求2所述的植物乳杆菌培养物在制备产品中的应用；
优选地，所述产品为：
(1)预防和/或治疗口腔疾病的产品；或
(2)抑制中间普氏菌、牙龈卟啉单胞菌和/或具核梭杆菌的产品。
6.一种产品，包含权利要求1所述的植物乳杆菌和/或权利要求2所述的植物乳杆菌培养物。
7.根据权利要求6所述的产品，其特征在于：
所述产品还包含植物提取物。
8.根据权利要求7所述的产品，其特征在于：
所述植物乳杆菌在所述产品中的含量大于等于5.49×107CFU/g；
所述植物提取物在所述产品中的含量大于等于90.6mg/g。
9.根据权利要求7或8所述的产品，其特征在于：
所述植物提取物为金银花和黄芩的提取物。
10.权利要求7～9中任一项所述的产品的制备方法，其特征在于：
将植物乳杆菌和/或植物乳杆菌培养物与植物提取物混合，得到；
优选地，所述产品为食品、药品和日化产品中的至少一种；
优选地，所述食品包括酸奶、口香糖；
优选地，所述日化产品包括漱口水、牙膏。
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