TWI842366B - 抑制植體周圍炎的組成物及其用途 - Google Patents
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Abstract
本發明關於一種包含乳酸菌(
Lactobacillus)的菌體或其活性物質的組合物，以及其改善植體周圍炎的用途。藉由該組合物降低相關促炎性細胞因子的mRNA表現量，減少促炎性細胞因子的分泌量，進而改善植體周圍炎。
Description
本發明係關於一種改善植體周圍炎之組合物及其用途。具體而言，該組合物包含乳酸菌（
Lactobacillus）菌體或其活性物質，以改善植體周圍的發炎反應。
植體周圍炎為一種植牙後會產生的併發症， 2019美國哥倫比亞大學醫學中心的統計顯示，在進行植牙手術後兩年，有34%的患者罹患植體周圍炎，而全部植體中有21%的發生機率 (Kordbacheh Changi et al., 2019)，隨著植牙的人數越來越多，且植體周圍炎會影響術後植體的穩定性和植體與齒槽骨的結合，因此植體周圍炎是值得注意的課題。
植體周圍炎與牙周炎的致病機轉相似，牙周炎是在自然牙周圍的發炎現象，植體周圍炎為口腔中的細菌在人工牙根周圍組織產生的一系列發炎反應，例如:牙齦紅腫、化膿、流血，初期在軟組織的發炎稱為植體周黏膜炎，經過治療是可恢復的，若再進一步惡化，造成植體周圍骨頭流失，甚至植體脫落，則稱為植體周圍炎。判斷植體周圍炎的方式有測量牙周囊袋探測深度 (≧ 4mm)、測量骨質流失的程度 (≧ 1.5mm)、是否有探測流血、化膿。
植體周圍炎的主要成因為細菌感染，大多是革蘭氏陰性的厭氧菌，例如:
Aggregatibacter actinomycetemcomitans、
Porphyromonas gingivalis、
Tannerella forsythia、
Treponema denticola 。口腔清潔不完全會造成牙菌斑聚積於植體上，進而引起牙周組織發炎。另外，植體設計不良、咬合壓力過大、糖尿病、骨質疏鬆和抽菸等都是植體周圍炎的致病原因。
現有植體周圍炎治療與缺點
治療植體周圍炎的方法有兩大類，非手術型和手術型治療，非手術型治療有機械式清創、超音波治療、雷射治療、殺菌治療和抗生素治療，淺層的植體周圍炎通常透過非手術型的治療即可改善，如果仍無法改善發炎的症狀，必須採取手術型治療。手術型治療包含植體周圍清創、清潔植體表面、植體周圍骨再生、骨整合手術，首先利用翻瓣手術清潔受汙染的植體並且清創發炎的植體周圍組織，接著添加骨粉和再生膜重建植體周圍的硬組織。如果植體周圍的骨組織流失太多，無法透過手術重建，則會將植體移除。
機械式清創是治療植體周圍炎最基礎的方式，雖然可以去除大部分病原菌，但菌株會在短時間內重新附著於牙周袋，因此常搭配超音波、雷射治療，減少菌株重新附著，上述輔助療法雖然可以改善植體周圍炎的臨床症狀，然而口腔菌相並沒有顯著差異，因此會搭配抗生素治療，抗生素除了作用於有害菌，也會破壞益生菌，因此改變口腔菌相甚至腸道菌相，另外，不當使用抗生素衍生的抗生素抗藥性菌株問題，讓植體周圍炎的治療變得更加困難，因此尋找替代抗生素的治療方法有其必要性。
近年來雖有研究發現益生菌有助於降低發炎，但皆是以活菌形式進行，對於商品化的保存或劑型受限多。因此，尋求替代傳統植體周圍炎治療方式或是如何突破現有益生菌保存或劑型的限制，仍是值得開發的課題。
為達成上述目的，本發明係提供一種改善植體周圍炎之組合物，其包含一乳酸菌（
Lactobacillus）菌體或其活性物質。
較佳地，該乳酸菌係包含乾酪乳桿菌(
Lactobacillus casei) GKC1或植物乳桿菌(
Lactobacillus plantarum) GKD7，其中GKC1於2018年2月12日以寄存編號BCRC 910825寄存於財團法人食品工業發展研究所之生物資源研究中心，GKD7於2019年3月6日以寄存編號BCRC910877寄存於財團法人食品工業發展研究所之生物資源研究中心。
較佳地，該乳酸菌的活性物質係以下列方法製備：
（a）取該乳酸菌接種於固態培養基以進行固態培養以形成菌落；
（b）將步驟（a）培養的菌落（colony）接種於液體培養基進行液態培養以得含菌體之液態培養基；
（c）將步驟（b）含菌體之液態培養基接種於發酵槽進行液態放大以得菌液。
較佳地，其形態為粉劑、錠劑、造粒、栓劑、微膠囊、安瓶（ampoule/ampule）、液劑噴劑、塞劑或膏狀劑。
較佳地，該組合物為一藥品、飼料、飲料、營養補充品、乳製品、食品或保健食品。
依據本發明的另一目的，提供一種用於製備改善植體周圍炎之醫藥組合物的用途，其中該醫藥組合物包含乳酸菌（
Lactobacillus）的菌體或其活性物質。
較佳地，該乳酸菌為乾酪乳桿菌(
Lactobacillus casei) GKC1或植物乳桿菌(
Lactobacillus plantarum) GKD7，其中GKC1以寄存編號BCRC 910825、GKD7以寄存編號BCRC910877寄存於財團法人食品工業發展研究所之生物資源研究中心。
較佳地，該醫藥組合物係施用於植體周圍。
較佳地，該醫藥組合物係降低促炎性細胞因子分泌。
較佳地，該促炎性細胞因子係包含IL-1β、TNF-α、IL-6。
較佳地，該醫藥組合物係降低IL-1β、TNF-α、IL-6的mRNA表現量。
較佳地，該醫藥組合物的施用量為0.1至0.5 ml/cm
2。
藉由上述技術特徵，本發明所提供的組合物可降低植體周圍的炎性細胞因子分泌，並且降低IL-1β、TNF-α、IL-6的mRNA表現量，繼而達到改善植體周圍炎的技術效果。
本文中所述「菌體」係指本揭露所採用的乳酸菌在各種培養階段中乳酸菌本身的結構。在一個具體態樣中，菌體係指完整或部分的乳酸菌結構。在一個具體態樣中，菌體係指由單一個細菌分裂、繁殖所形成的乳酸菌族群的菌落。在一個具體態樣中，培養階段係指固態培養、液態培養或接種於發酵槽的液態放大。
本文中所述「活性物質」係指本揭露所採用的乳酸菌菌體經過特定實驗步驟處理後所篩選出來的物質，或是菌體與培養基或培養液的混合物。在一個具體態樣中，活性物質係指經過離心分離的菌泥、冷凍乾燥的菌粉或溶劑萃取的萃取物。在一個具體態樣中，活性物質係指含有菌體的固態培養基、含菌體的液態培養基或經發酵槽液態放大後的菌液。
本揭露為改善植體周圍炎，係透過動物實驗篩選出具減緩植體周圍炎之乳酸菌，並研發出包含該乳酸菌菌體或其活性物質的組成物，藉由施加該組合物至植體周圍，達到改善植體周圍炎的效果。在一較佳實施例中，該乳酸菌係包含乾酪乳桿菌(
Lactobacillus casei) GKC1或植物乳桿菌(
Lactobacillus plantarum) GKD7。
關於菌種固態培養，將乳酸菌菌體接種於固態培養基上，以進行固態培養來活化菌體並形成菌落（colony formation）。在一較佳的實施態樣中，該固態培養的溫度為30至55℃，更佳為32至45℃。在一較佳的實施態樣中，該固態培養的時間為0.5至3天，更佳為1至2.5天。在一較佳的實施態樣中，該固態培養基為MRS agar。
關於液態培養，待固態培養基上的菌落生長完成後，將單一菌落挑起接種於含有MRS液態培養基的試管，以液態培養來活化。在一較佳的實施態樣中，MRS液態培養的溫度為30至55℃，更佳為32至45℃。在一較佳的實施態樣中，MRS液態培養的時間為16至24小時，更佳為20小時。在一較佳的實施態樣中，於通氣量為0至1 vvm氮氣或二氧化碳、速率250至1000 rpm的條件下液態培養。在一較佳的實施態樣中，液態培養的酸鹼值為pH5.0至7.0，更佳為pH5.5至6.5。
關於發酵培養，將MRS液態培養基中的菌體接種於含有1L液態培養液的錐型瓶中。待液態培養基中的菌體生長完成後，將該菌體連同液態培養基接種於發酵槽中，以進行液態放大來獲得含菌液。在一較佳的實施態樣中，發酵槽培養的溫度為30至55℃，更佳為32至45℃。在一較佳的實施態樣中，發酵槽培養的時間為16至20小時，更佳為17至19小時。
關於濃縮液製備，待菌株發酵培養完成後，以速率1000至15000rpm進行離心，將菌泥移除後獲得發酵上清液。接著將發酵上清液透過減壓濃縮以製得濃縮液。
本揭露包含乳酸菌菌體及其活性物質的組合物，進一步包含添加劑。在一較佳的實施態樣中，該添加劑可為賦型劑、防腐劑、稀釋劑、填充劑、吸收促進劑、或其組合。該賦型劑可選自檸檬酸鈉、碳酸鈣、磷酸鈣、蔗糖或其組合。該防腐劑可延長醫藥組合物的儲藏期限，例如苯甲醇、對羥基苯甲酸（parabens）。稀釋劑可選自水、乙醇、丙二醇、甘油或其組合。填充劑可選自乳糖、牛乳糖、高分子量舉乙二醇或其組合。吸收促進劑可選自二甲基亞碸（DMSO）、月桂氮卓酮、丙二醇、甘油、聚乙二醇或其組合。除上述所列舉的添加劑以外，在不影響組合物的醫藥效果前提下，可依需求選用適合的其他添加劑。
本揭露的組合物根據該組合物的型態，在預定的時間點以適當的途徑施予受試者適合劑量的組合物。在一較佳實施態樣中，施予途徑包含直接塗抹、噴灑至待施用位置。在一較佳實施態樣中，預定時間點包含每餐、每天、每週。在一較佳實施態樣中，受試者為人類或動物。
本文中所述「有效量」係指一使用量，其足以使前述改善植體周圍炎的效果產生。
在一較佳實施態樣中，組合物中的有效量為每天1至3次塗抹於患部，較佳地為3次，施用量為0.1至0.5 ml/cm
2，較佳地為0.3 ml/cm
2。
以下係透過具體實施例來說明本案之改善植體周圍炎的組合物。
實施例一：菌種來源
本揭露的實施例中用以製備試驗物質所使用的菌種，購自食品工業發展研究所生物資源保存與研究中心。該等菌種的名稱、寄存編號如下表1。但本揭露所述的菌種不限於由此管道取得，所屬技術領域中具有通常知識者亦可由其他微生物菌株保存單位取得該等乳酸菌的菌種。
表1：菌種
| 編號 | 名稱 | 寄存編號 | 寄存日期 |
| 1 | 乾酪乳桿菌GKC1 ( Lactobacillus casei) | BCRC 910825 | 2018/02/12 |
| 2 | 植物乳桿菌GKD7 ( Lactobacillus plantarum) | BCRC 910877 | 2019/03/06 |
實施例二：菌種培養
依據本案實施例，菌種係以下述方式培養：（a）取表一之乳酸菌接種於固態培養基以進行固態培養以形成菌落；（b）將步驟（a）培養的菌落（colony）接種於液體培養基進行液態培養以得含菌體之液態培養基；（c）將步驟（b）含菌體之液態培養基接種於發酵槽進行液態放大以得菌液。
具體而言，在步驟（a）中，將乾酪乳桿菌GKC1與植物乳桿菌GKD7分別接種於固態培養基上活化菌種，其中，該固態培養基為MRS 瓊脂，以培養溫度37度培養1.5天。在步驟（b）中，待生成菌落（colony）後，挑起單一菌落（single colony）接入液態培養基進行液態培養。液態培養培養溫度為37 ℃，通氣量為10 vvm氮氣或二氧化碳、速率30 rpm，酸鹼值pH5.5至6.5，在時間為20小時左右時活菌數可達到最高點。其中，液態培養基為MRS液態培養基。在步驟（c）中，液態培養完成後將MRS液態培養基中的菌體接種於含有1L液態培養液的錐型瓶中進行發酵培養，發酵槽溫度維持在32至45℃之間，培養時間為17至19小時。發酵培養基的配方如下表2所示。
表2
| 成分 | 比例（重量百分比） |
| 糖類 | 1~10% |
| 酵母萃出物 | 0.1~5% |
| 蛋白腖 | 0.1~5% |
| 微量元素 | 0.01~2% |
| 半胱胺酸 | 0.01~0.1% |
| Tween-80 | 0.05~1% |
實施例三：試驗樣品製備
將實施例二的乳酸菌發酵後的菌液以速率1000至15000rpm進行離心。將菌泥移除後獲得發酵上清液，後續進行減壓濃縮得到濃縮液，即為本案所請之乳酸菌之活性物質的其中一態樣。
實施例四：試驗動物
試驗動物由國家動物中心 (BioLASCO Taiwan Co., Ltd., Taiwan) 訂購20隻之雄性C57BL/6小鼠，並飼養於中山醫學大學動物中心。將動物飼養於不銹鋼鼠籠，而動物房溫度控制在22±2℃，濕度控制在60-80%，光照與黑暗各十二小時 (07:00-19:00為光照期；19:00-07:00為黑暗期)。本實驗操作經由中山醫學大學實驗動物照護及使用委員會核准通過。試驗期間，小鼠自由攝食飼料和蒸餾水。
實施例五：植體周圍炎抑制試驗
試驗動物餵予正常成鼠飼料和飲用蒸餾水適應環境1週後，將其隨機分為四組，取實施例四製得的試驗樣品以塗抹方式於牙周炎處，其分組如下：
1. 健康組 (control group, Ctrl) (n = 5/group)
2. 結紮組 (ligation group, Lig) (n = 5/group)
在小鼠左上頷第二磨牙周圍進行線結紮進而誘發植體周圍炎。小鼠以腹腔注射的方式給予Hydrocholine (1mL/0.1kg) 麻醉後，在上頷骨從犬齒到第二臼齒間用牙齦溝內切法利用絲線將結紮線放置在小鼠左上頷第二磨牙周圍，並將線結放置在頰側近心面。
3.低劑量組 (Low) (n = 5/group)
線結紮12天後，每天塗抹0.5克試驗樣品1次於線結紮處(約0.5ml，結紮處面積約1cm
2)，試驗樣品持續處理14天後，收集其結紮線誘發牙周病部位之牙齦溝液，進行ELISA實驗檢測IL-1β、TNF-α、IL-6分泌量。利用二氧化碳犧牲後，取下其結紮線誘發牙周病部位之牙齦組織，使用均質機萃取mRNA，利用反轉錄酶套組萃取DNA，選取適當的引子混合SYBR green螢光劑，測定CT值，分析IL-1β、TNF-α、IL-6基因表現量。
4.高劑量組 (High) (n = 5/group)
線結紮12天後，每天塗抹試驗樣品3次於線結紮處，每次塗0.5克試驗樣品，試驗樣品持續處理14天後，同上述3.處理方式，進行後續的實驗。
資料處理與統計分析
實驗數據使用SPSS電腦統計軟體進行分析。實驗數據取自三次獨立試驗，以平均值加減標準偏差 (Mean ± SD)表示。檢驗實驗組與對照組之平均值是否有差異，使用配對t分析 (Paired t-test)，p ＜ 0.05為具有顯著性差異，以*表示，若 p ＜ 0.01，以**表示。
GKC1對促炎性細胞因子含量與mRNA表現量的影響
圖1為GKC1對線結紮組(Lig組)促炎性細胞因子含量與mRNA表現量之影響。如圖1所示，相較於健康組(Ctrl組)，結紮組牙齦溝液會誘發IL-1β、TNF-α、IL-6的分泌，給予低和高劑量GKC1都能顯著降低IL-1β、TNF-α、IL-6的分泌，高劑量組別的作用效果(p ＜ 0.01)比低劑量組別佳 (p ＜ 0.05)。在結紮組的牙齦組織中，IL-1β、TNF-α、IL-6的mRNA表現量比健康組來得高，但在塗抹低和高劑量GKC1於線結紮處後，IL-1β、TNF-α、IL-6的mRNA表現量都顯著下降(p ＜ 0.05)。顯示GKC1可以減緩植體周圍炎造成的發炎現象。
GKD7對促炎性細胞因子含量與mRNA表現量的影響
圖2為GKD7對線結紮組促炎性細胞因子含量與mRNA表現量之影響。如圖2所示，相較於健康組，結紮組牙齦溝液會誘發IL-1β、TNF-α、IL-6的分泌，給予低和高劑量GKD7都能顯著降低IL-1β、TNF-α、IL-6的分泌 (p ＜ 0.01)。在結紮組的牙齦組織中，IL-1β、TNF-α、IL-6的mRNA表現量比健康組來得高，但在塗抹高劑量GKD7於線結紮處後，IL-1β、TNF-α、IL-6的mRNA表現量顯著下降(p ＜ 0.05)。顯示GKD7可以減緩植體周圍炎造成的發炎現象。
實施例六:組合物的製備
本揭露之乳酸菌的菌體或其活性物質若以液體劑型應用於塗抹於患部的用途，則以下組合物1之態樣作為例示性實例。
組合物1：取實施例三之乳酸菌的菌體或其活性物質的濃縮液或凍乾粉末(20 wt%)，與作為作為潤滑劑的硬脂酸鎂(8wt%)、作為防腐劑的二氧化矽(7wt%)充分混合，並溶於純水(65 wt%)中，存放於4℃備用。前述wt%係指各成分佔組合物總重之比例。
不過，雖然實施例三之乳酸菌的菌體或其活性物質的濃縮液以塗抹於患部的方式施用，但實際應用上亦可採用口服等其他方式，例如以下組合物2。
組合物2：取實施例三之乳酸菌的菌體或其活性物質的濃縮液或凍乾粉末(20 wt%)，與作為防腐劑之苯甲醇(8 wt%)、作為稀釋劑之甘油(7 wt%)、作為稀釋劑之蔗糖(10 wt%)充分混合，並溶於純水(55 wt%)中，存放於4℃備用。前述wt%係指各成分佔組合物總重之比例。
該組合物於醫藥領域中可開發為不同商品。在一較佳實施態樣中，該組合物為一藥品、飼料、飲料、營養補充品、乳製品、食品或保健食品。
該組合物可根據受施予者之需要，而採用不同形態。在一較佳實施態樣中，該組合物的形態為粉劑、錠劑、造粒、栓劑、微膠囊、安瓶（ampoule/ampule）、液劑噴劑或塞劑。
本發明的組合物可使用於動物或是人類。在不影響乳酸菌之活性物質發揮效果的前提下，包含乳酸菌之活性物質的組合物可製為任何藥物型態，並根據藥物型態以適用的途徑施予該動物或人類。
綜上所述，藉由包含乳酸菌的菌體或其活性物質的組合物，可以透過直接施用組合物而使植體周圍的炎症得到抑制，得到改善植體周圍炎的效果。
雖然本發明已用實施例揭露如上，然其並非用以限制本發明。本領域之具備通常知識者，於參酌以上教示後，當能對上述實施例的內容進行適當修改，而仍然能達到本案所主張之功效。因此，本發明的保護範圍應以其後所附之申請專利範圍為準。
無
圖1係依據本發明實施例繪示GKC1對線結紮組促炎性細胞因子含量與mRNA表現量之影響。
圖2係依據本發明實施例繪示GKD7對線結紮組促炎性細胞因子含量與mRNA表現量之影響。
乾酪乳桿菌(Lactobacillus casei) GKC1，寄存編號BCRC 910825。
植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum) GKD7，寄存編號BCRC910877。
Claims (9)
- 一種改善植體周圍炎之組合物，其包含一乳酸菌(Lactobacillus)菌體或其活性物質；其中該乳酸菌係包含乾酪乳桿菌(Lactobacillus casei)GKC1或植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum)GKD7，其中GKC1於2018年2月12日以寄存編號BCRC 910825寄存於財團法人食品工業發展研究所之生物資源研究中心、GKD7於2019年3月6日以寄存編號BCRC910877寄存於財團法人食品工業發展研究所之生物資源研究中心；其中該乳酸菌(Lactobacillus)的活性物質係以下列方法製備：(a)取該乳酸菌接種於固態培養基以進行固態培養以形成菌落；(b)將步驟(a)培養的菌落(colony)接種於液體培養基進行液態培養以得含菌體之液態培養基；(c)將步驟(b)含菌體之液態培養基接種於發酵槽進行液態放大以得菌液。
- 如請求項1中任一項所述之組合物，其形態為粉劑、錠劑、造粒、栓劑、微膠囊、安瓶(ampoule/ampule)、液劑噴劑、塞劑或膏狀劑。
- 如請求項1中任一項所述之組合物，其中該組合物為一藥品、飼料、飲料、營養補充品、乳製品、食品或保健食品。
- 一種用於製備改善植體周圍炎之醫藥組合物的用途，其中該醫藥組合物包含一乳酸菌(Lactobacillus)菌體或其活性物質；其中該乳酸菌為乾酪乳桿菌(Lactobacillus casei)GKC1或植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum)GKD7，其中GKC1以寄存編號BCRC 910825、 GKD7以寄存編號BCRC910877寄存於財團法人食品工業發展研究所之生物資源研究中心。
- 如請求項4所述之用途，其中該醫藥組合物係施用於植體周圍。
- 如請求項4所述之用途，其中該醫藥組合物係降低促炎性細胞因子分泌。
- 如請求項6所述之用途，其中該促炎性細胞因子係包含IL-1β、TNF-α或IL-6。
- 如請求項4所述之用途，其中該醫藥組合物係降低IL-1β、TNF-α、IL-6的mRNA表現量。
- 如請求項4所述之用途，其中該醫藥組合物的施用量為0.1至0.5ml/cm2。
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
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| TWI842366B true TWI842366B (zh) | 2024-05-11 |
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|---|---|---|---|---|
| TWI754929B (zh) | 2020-05-06 | 2022-02-11 | 葡萄王生技股份有限公司 | 乳酸菌用於提升對腸病毒７１型之抵抗力之用途 |
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|---|---|---|---|---|
| TWI754929B (zh) | 2020-05-06 | 2022-02-11 | 葡萄王生技股份有限公司 | 乳酸菌用於提升對腸病毒７１型之抵抗力之用途 |
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