BRPI0413008B1

BRPI0413008B1 - Preparation of lactobacillos having a specimen of lactobacillus casei ferm bp-10059 (ferm p-19443) and preventive or therapeutic agent against human, animal and plant infections having a specimen of lactobacillus casei ferm bp-10059 (ferm p-19443)

Info

Publication number: BRPI0413008B1
Application number: BRPI0413008-1A
Authority: BR
Inventors: Hata Tadayo; Toshimori Hitoshi; Maruoka Toshiyuki
Original assignee: Bhph Company Limited
Priority date: 2003-07-30
Filing date: 2004-07-27
Publication date: 2017-06-20
Also published as: WO2005012503A1; CN1842588B; EP1661982A4; JPWO2005012503A1; KR100763257B1; ZA200600866B; HK1095605A1; MXPA06001167A; UA88271C2; BRPI0413008B8; RU2340669C2; IN2006MU00214A; HRP20090583T1; JP4661593B2; ES2332411T3; EP1661982A1; RU2006106279A; CA2534013C; BRPI0413008A; US7863033B2

Abstract

"espécie de lactobacillus casei, preparação de lactobacilos ativando um corpo vivo tendo uma espécie de lactobacillus casei, e agente preventivo ou terapêutico contra infecções em humanos, animais e plantas tendo uma espécie de lactobacillus casei". foram despendidos esforços para desenvolver um lactobacilo, que seria utilizável como um probiótico, e para desenvolver um lactobacilo que iria colonizar e proliferar em lesões de infecção, eliminando as bactérias causais. este problema foi resolvido por desenvolvimento de uma espécie de lactobacillus casei tendo as seguintes propriedades chave: (1) a espécie pode ser cultivada na presença de qualquer um de um a quatro aminoácidos como uma fonte de nitrogênio necessária para crescimento. (2) quando um meio de cultura promotor do crescimento é inoculado com a espécie e escherichia coli na mesma contagem e submetido a cultivo misto anaeróbico a 37<198>c, a contagem final de lactobacilos é de 50% ou mais da contagem de coliformes. (3) quando do cultivo em um meio de cultura apropriado, o valor de ph final é 4,0 ou abaixo, e a maior acidez é 1,5% ou mais. (4) a espécie é resistente a sais de bile a 5%. (5) a espécie produz um antibiótico.

Description

"PREPARAÇÃO DE LACTOBACILOS TENDO UMA ESPÉCIE DE LACTOBACILLUS CASEI FERM BP-10059 (FERM P-19443) E AGENTE PREVENTIVO OU TERAPÊUTICO CONTRA INFECÇÕES EM HUMANOS, ANIMAIS E PLANTAS TENDO UMA ESPÉCIE DE LACTOBACILLUS CASEI FERM BP-10059 (FERM P-19443)" CAMPO TÉCNICO A presente invenção refere-se a uma espécie de Lactobadiíus Casei tendo excelentes propriedades não fornecidas por bactérias convencionalmente conhecidas, a uma preparação de lactobacilos ativando corpo vivo tendo esta bactéria como um componente principal, a qual é extremamente utilizável para restaurar, manter e promover a saúde e para melhorar o crescimento e a qualidade de plantas e animais, e a uma preparação de lactobacilos que é altamente eficaz para prevenir e tratar infecções de animais e plantas.

ARTE ANTECEDENTE

Uma infecção ocorre quando as bactérias invadem e se multiplicam dentro de um corpo vivo e o corpo demonstra sintomas de doença e, uma vez que as bactérias começam a se multiplicar no corpo, o corpo reage de vários modos, e aparecem vários sintomas, como vermelhidão e intumescimento. O uso de drogas como antibióticos é apropriado neste ponto, e ajuda a cura da infecção. No entanto, quando é muito tarde para usar antibióticos, ou quando seu uso é inapropriado, ou quando o uso é interrompido no curso da terapia, ou quando droga suficiente não pode alcançar a infecção, a redução ou a remoção do patógeno é evitada e o tratamento não alcança, por fim, sucesso em muitos casos. Além disso, problemas foram recentemente observados afetando tanto as bactérias como seus hospedeiros, complicando as circunstâncias de modo que as infecções duram mais ou são mais severas e difíceis de tratar. A primeira vitória para humanos na guerra contra doença infecciosa ocorreu na metade do Século Vinte com o advento de antibióticos, começando com penicilina. Diferente das drogas anteriores, esta droga foi lançada como uma “bala mágica” devido a seus efeitos dramáticos: pareceu que a infecção tinha sido conquistada, e que o termo “doença infecciosa” logo se tomaria obsoleto. No entanto, as bactérias não são facilmente conquistadas, e o uso excessivo de antibióticos levou ao aparecimento e à difusão de bactérias resistentes a drogas. Tendo sobrevivido e se reagrupado, as bactérias estão novamente atacando. As bactérias que adquiriram resistência tem obtido sucesso na transmissão de sua resistência através dos limites de espécies pela conjugação de fragmentos de DNA especiais (genes de resistência) chamados plasmídeos R. Como resultado, a medicina parece verdadeiramente na eminência de uma denota devido à prevalência e difusão de Staphylococcus aureus resistente a metícilina (MRSA), uma causa principal de infecções com base em hospitais, e outras bactérias resistentes a múltiplas drogas, incluindo Enterococcus (VRE), Pseudomonas aeruginosa, Mycobacterium tuberculosis, Shigella flexneri resistentes a vancomicina, e semelhantes.

Por exemplo, 80% dos adultos sofrem, como se afirma, de doença periodontal, em que os tecidos circundantes que sustentam os dentes incluindo as gengivas, cimento, ligamentos periodontais, osso alveolar e outros, se tomam inflamados e são gradualmente destruídos. Isto é causado por bactérias que preferivelmente colonizam e formam placas no tecido periodontal, particularmente ranhuras na parte cervical nos limites entre os dentes e as gengivas. As gengivas se tomam localmente inflamadas devido a toxinas e enzimas produzidas por estas bactérias, resultando em gengivite, e à medida que a doença progride, se formam bolsas nas gengivas onde a placa se acumula, resultando em periodontite. A medida que os sintomas progridem, as bolsas se aprofundam e se ampliam, a inflamação se espalha e destrói gradualmente as raízes dos dentes, que mais cedo ou tarde irão cair. Especificamente, nos estágios iniciais da doença periodontal, as gengivas da parte cervical em que a placa se fixou se tomam vermelhadas e intumescidas, perdendo sua elasticidade e sagrando durante a escovação. Se isto for ignorado, a placa gradualmente cresce e forma cálculos, se espalhando e abrindo a área cervical de modo a formar bolsas periodontais. O cálculo forma uma barreira que evita a escovação da placa subjacente, de modo que as bactérias ganham força e suas toxinas levam as bolsas a crescer cada vez mais, e a inflamação se espalha das gengivas para o ligamento periodontal e osso alveolar, causando sangramento e pus com halitose enquanto, ao mesmo tempo, a infecção se espalha aos dentes circundantes, um por um. Se a inflamação das bolsas se tomar crônica, o osso alveolar que suportas as raízes dos dentes começa a dissolver da superfície, acompanhado por edemas das gengivas, os dentes ficam instáveis e soltos porque não estão mais sustentados de modo apropriado, e ocorre uma forte halitose junto com dor quando o paciente morde coisas duras. A medida que a doença progride, a maior parte do osso alveolar é perdida, as raízes dos dentes são expostas, os dentes se tomam soltos, de modo que o paciente não pode mais comer alimentos duros e, finalmente, os dentes caem um por um. Consequentemente, especialistas reconhecem a doença periodontal como um modelo clássico de doença infecciosa crônica que ainda é difícil de curar.

Outro problema se refere às próprias drogas: as drogas são estranhas ao corpo e produzem efeitos colaterais em um grau maior ou menor, e especialistas apontam que quanto mais eficaz a droga, maiores os efeitos laterais. Geralmente, afirma-se que os efeitos das drogas são reduzidos à metade enquanto os efeitos laterais são duplicados nos idosos - um fato que não pode ser ignorado considerando-se o envelhecimento da sociedade. As demandas cada vez mais fortes para segurança e proteção da sociedade como um todo também não podem ser ignoradas. As mortes acidentais devido a efeitos laterais continuam a ocorrer. Os antibióticos não são uma exceção, de fato produzem uma toxicidade para o sangue mais forte do que outras drogas incluindo a reação alérgica chamada “choque de penicilina” assim como leucopenia, anemia e outros, e a perda resultante de resistência imune foi reconhecida em instituições públicas. Porque os antibióticos são tão utilizáveis, no entanto, este fato não tem sido tão problemático exceto em casos reais de doença severa ou morte.

Os antibióticos tem outro efeito lateral que não é imediatamente óbvio: eles atacam a flora intestinal, que é às vezes chamada de um órgão vital, provocando substituição microbiana. Isto é, a função imune é ainda deprimida pelo efeito sinergístico da toxicidade do sangue combinada com uma diminuição nas bactérias intestinais benéficas que são altamente sensíveis a antibióticos, promovendo infecções crônicas e levando a novas doenças virais e outras infecções. De fato, as bactérias que causam infecções crônicas, como doença periodontal, sinusite, hemorróidas e outras são, com freqüência, resistentes a antibióticos, e efeitos laterais se acumulam enquanto a droga se toma ineficaz. Mesmo sem resistência, quanto mais se usa um antibiótico, maior o risco de mutação em cepas resistentes. No nível individual, a exposição contínua a toxinas de bactérias patogênicas pode ser fatal quando combinada com função imune diminuída enquanto, em um nível societário, as bactérias resistentes cruzaram os limites nacionais de modo a causar um prejuízo não antevisto em todo o mundo.

Considerando os Estados Unidos e a Europa, a idéia de manter corpos que não se tomam doentes em vez de tratar os mesmos quando se tomam doentes (medicina preventiva) tem sido manifestada há uma década, e meios eficazes alcançá-la, quando aceita devido à sua segurança, são os “probióticos”, que conferem a ajuda de bactérias benéficas. A pesquisa sobre Lactobacillus foi iniciada na França por Pasteur, o pai da moderna microbiologia, levando à teoria de “aumento da duração da vida” do Russo Metchinikoff e muitas aplicações clínicas subseqüentes, mas ainda não foi colocada em um uso prático verdadeiro. Isto é porque os resultados de estudos epidemiológicos não foram equiparados aos resultados da pesquisa experimental. Recentemente, no entanto, avanços em bacteriologia intestinal demonstraram que Lactobacillus tem os seguintes papéis importantes. (1) Normalização da função imune: normaliza e melhora a função imune, que é indispensável para manter a vida útil na prateleira (2) Limpeza intestinal: equilibra a flora intestinal, suprime a proliferação de bactérias prejudiciais, e suprime a fermentação anormal e produção de bactérias nocivas nos intestinos (3) Limpeza do sangue: limpa o sangue como uma extensão da função de limpeza intestinal (4) Promoção da utilização de alimentos: promove a síntese de vitaminas e aminoácidos, auxilia na absorção de nutrientes através das paredes intestinais (5) Prevenção de infecções por bactérias nocivas: evita a proliferação e infecção no intestino mesmo se bactérias nocivas invadirem do exterior (6) Normalização celular: promove a normalização de funções celulares.

No Japão, também, à medida que a sociedade envelhece e o controle dos custos com a saúde se toma uma preocupação nacional, a importância de prevenção de doenças está sendo reconhecida e a sociedade como um todo está se tomando mais preocupada com a saúde. Como resultado, o número de produtos contendo Lactobacillus como um ingrediente está aumentando uniformemente, e cada vez mais estão desenvolvendo os assim chamados produtos de “iogurte funcional”. No entanto, a verdade é que se estes produtos forem consumidos de modo intermitente, os resultados, como os acima mencionados em (1) a (6) e outros efeitos definitivos sobre doenças, serão pequenos e longe de fazerem efeito, e uma eficácia real contra infecção seria uma esperança sem proveito.

Sob esta circunstância, os inventores propuseram que um bacilo de ácido láctico tendo propriedades singulares, que foi isolado e selecionado pelos inventores em maio de 2000, fosse usado contra infecções com o objetivo de resolver os efeitos de doença ocasionados pelos antibióticos convencionais, como bactérias resistentes a drogas, alergias a drogas, efeitos laterais e problemas afetando a flora bacteriana comum, e apresentaram um pedido de patente para “New Lactic Acid Bacterium Effective on Infectious Disease and Lactobacillus Preparation Comprising Lactic Acid Bacterium as Main Ingredient”. (Pedido de patente japonesa acessível ao público no. 2001-333766).

Este pedido refere-se a um bactéria de ácido láctico que é uma espécie de Lactobacillus casei que não somente atua para inibir o crescimento de bactérias patogênicas mas também produz “novas substâncias bioativas” que tem a propriedade de enfraquecer a toxicidade de bactérias patogênicas, e a uma preparação de Lactobacillus para infecções agudas e crônicas que tem esta bactéria como um componente principal. Em detalhes, dentre os Lactobacillus casei coletados da natureza, os requerentes selecionaram somente as cepas produzindo um antibiótico de espectro amplo e, então, realizaram triagens buscando mutações hemolíticas e S-R, com confirmação através de testes com animais, para determinar se ou não este antibiótico enfraquecia a toxicidade de bactérias patogênicas e, por fim, três cepas de Lactobacillus casei, que atendem aos critérios vigentes, FERM BP-6771, FERM BP-6772, e FERM BP-6773, foram aplicadas às infecções. Estas também ocasionaram resistência a antibióticos amplamente usados, de modo que podem ser usadas em combinação com estes antibióticos. Em casos de infecções agudas, como colite aguda, cistite aguda, bronquite aguda e outros, efeitos de tratamento mais rápido foram obtidos através do uso destes Lactobacilli em conjunto com a administração de antibióticos do que foram obtidos com os antibióticos convencionais sozinhos, incluindo (i) reduzida dosagem do antibiótico, (ii) melhora mais rápida dos sintomas e recuperação mais rápida com menores efeitos laterais, e (iii) menor distúrbio para a flora intestinal, e os efeitos de doença da droga foram reduzidos. No entanto, os efeitos levam tempo para aparecer e uma cura completa só foi obtida no caso de infecções crônicas como gengivite, sinusite, bronquite e hemorróidas.

Como discutido acima, o objetivo é cultivar Lactobacillus casei capaz de colonizar e multiplicar nas lesões de uma infecção crônica que resiste ao tratamento, e prover uma ação de limpeza forte enquanto eliminando as bactérias causais.

DESCRIÇÃO DA INVENÇÃO

Como um resultado de uma pesquisa exaustiva visando resolver os aspectos acima mencionados, os inventores obtiveram sucesso em alcançar este objetivo usando as indicações obtidas através da análise do sistema de limpeza vaginal, que mantém um meio limpo mesmo enquanto sendo constantemente exposto à contaminação bacteriana.

Isto é, esta é uma espécie de Lactobacillus casei tendo as propriedades descritas em (1), (2), (3), (4) e (5) abaixo, que é preferivelmente a espécie Lactobacillus casei FERM BP-10059 (FERM P-19443): (1) a espécie pode ser cultivada na presença de qualquer um de um a quatro aminoácidos como uma fonte de nitrogênio necessária para o crescimento; (2) quando o meio de cultura promotor do crescimento é inoculado com a espécie e Escherichia coli na mesma contagem e submetido a cultura mista anaeróbica a 37°C, a contagem final de lactobacilos é de 50% ou mais da contagem de coliformes; (3) quando do cultivo em um meio de cultura apropriado, o valor de pH final é 4,0 ou abaixo, e a maior acidez é 1,5% ou mais; (4) a espécie é resistente a sais da bile a 5%; (5) a espécie produz um antibiótico.

Segundo, a presente invenção é uma espécie de Lactobacillus casei tendo, pelo menos, uma das seguintes propriedades além das propriedades acima, e esta espécie de Lactobacillus casei é FERM BP-1O059 (FERMP-19443); (a) tem resistência a antibióticos amplamente usados; (b) tem atividade amilolítica; (c) promover o crescimento de clorela; (d) cresce em temperaturas na faixa de 5 °C a 45 °C; (e) cresce em valores de pH na faixa de pH 4,0 a pH 10,0; (í) também pode crescer sob qualquer pressão de oxigênio.

Terceiro, a presente invenção é uma preparação de lactobacilos ativando corpo vivo tendo a espécie de Lactobacillus casei descrita acima como um ingrediente ativo primário, em que a espécie de Lactobacillus casei é FERM BP-10059 (FERMP-19443).

Quarto, a presente invenção é um agente preventivo ou terapêutico para a infecção de corpo vivo tendo a espécie de Lactobacillus casei descrita acima como um ingrediente primário principal, que preferivelmente contém um antibiótico, e que é preferivelmente aplicado a uma área afetada no tratamento de doença periodontal após a área afetada estar já desinfectada com um desinfectante bactericida, em que referido desinfectante bactericida preferivelmente contém 500 a 1.500 ppm de íons férricos, 500 a 2000 ppm de ácido L-ascórbico e 200 a 2.000 ppm de um ou pelo menos dois dentre ácido sórbico, ácido benzóico, e éster de ácido paraoxibenzóico com componentes principais, e referida espécie de Lactobacillus casei é preferivelmente FERM BP-10059 (FERM P-19443).

Atualmente, a sociedade, como um todo, valoriza a segurança e proteção acima de tudo e, na saúde e na medicina, o conceito de “probióticos” se encontra em um estágio central no Ocidente particularmente. “Probióticos” se referem ao uso de bactérias e outros microorganismos que são organismos simbióticos que vivem nos intestinos e são benéficos para o corpo, e aos métodos de agressivamente evitar e tratar doenças usando estas bactérias, especialmente o uso interno de lactobacilos incluindo Lactobacillus bifidus e outros.

Os inventores, neste caso, rapidamente fizerem uso deste fato para desenvolver a preparação de lactobacilos da presente invenção, que consistem de uma espécie de Lactobacillus casei que recebeu propriedades singulares. Na vantagem principal dos probióticos, esta preparação não somente tem efeitos muito nítidos na restauração, manutenção e promoção da saúde, mas também obteve sucesso para prover efeitos terapêuticos não obtidos com produtos convencionais do mesmo tipo com relação aos casos crônicos de infecção que são difíceis de tratar mesmo pela medicina moderna. Além disso, porque o lactobacilo da presente invenção é resistente a antibióticos, o tratamento mais rápido pode ser obtido em combinação com antibióticos. Neste caso, a dosagem mínima de antibiótico é suficiente, e os vários efeitos de doença intrínsecos das drogas, como efeitos laterais e difusão de bactérias resistentes a drogas podem ser reduzidos. Além disso, no contexto de aumentos nas doenças degenerativas de uma sociedade em envelhecimento e aumentos nas infecções crônicas devido ao envelhecimento, junto com um aumento inevitável dos custos médicos, o papel da preparação de lactobacilo da presente invenção como um meio para resolver estes problemas será cada vez mais importante no futuro.

Antes do advento de antibióticos, muito poucos esforços foram despendidos no mundo para tratar doença periodontal. Também se pensava que as bactérias dentro das lesões da doença periodontal eram a causa de doença cardíaca e outras doenças fatais e, devido a este perigo percebido, os dentes com cavidades estragadas ou doença periodontal eram arrancados sem hesitação. Devido a esta teoria, a odontologia de antigamente não considerava um tratamento para a doença mas apenas a extração do dente e o procedimento do uso de dentaduras para substituir os dentes extraídos. Esta situação começou a melhorar com o advento de antibióticos e, na pesquisa iniciada nos anos 80 do Século Dezenove, começaram a ser melhor entendidos os patógenos de doença periodontal que permitiam o progresso da doença. Isto levou a uma terapia fundamental para remover a placa e o cálculo, com o resultado que a inflamação diminuía, as bolsas periodontais se tomavam menos profundas, os dentes bambos eram alinhados e não soltavam e, quando não se alcançava sucesso, era realizada uma cimrgia nas gengivas. Deste modo, estratégias terapêuticas foram desenvolvidas de modo a conservar os dentes. Por outro lado, a intratabilidade da doença periodontal foi re-avaliada quando se verificou que as bactérias escondidas dentro das gengivas formavam estruturas e barreiras coletivas especiais, reduzindo, assim, os efeitos farmacêuticos de drogas anti-bacterianas e bactericidas, e que os hábitos de vida do paciente, condições sistêmicas e fatores genéticos também estavam envolvidos na ocorrência e progresso da doença. Distante, talvez, de um sentido futilitarista, ocorreu um progresso pequeno na última década sobre o estudo básico e o tratamento de doença periodontal.

Com o advento de uma sociedade longeva, especialistas têm descrito gradualmente uma associação íntima entre os dentes e a saúde física, percebendo que os dentes servem não somente a uma função de mastigar, mas também são o centro da própria vida, e a sociedade tem percebido que, para tratar demência, câncer, derrame, doença cardíaca, e outros, é importante tratar os dentes a fim de acentuar as forças de cicatrização natural do corpo e melhorar as funções sistêmicas. Isto é, foi notado que os dentes são órgãos insubstituíveis, e que por meio dos dentes é possível melhorar as funções físicas e psicológicas, evitar o envelhecimento e melhorar a felicidade humana. A perda de dentes e cavidades e o implante de dentes artificiais imperfeitos para substituir os mesmos pode levar a reações de estresse contínuo e cumulativo no corpo vivo. Com o foco atual nos efeitos laterais e problemas das drogas, o desenvolvimento dos agente preventivo seguro e agente terapêutico da presente invenção, que colocam uma pequena carga física, psicológica ou financeira para tanto os médicos como para os pacientes, sustenta uma grande promessa de revolucionar o tratamento da doença periodontal, que é com freqüência ridicularizado como um “tratamento de limpeza”, e aproveita a oportunidade de oferecer boas novas para a raça humana como é desejado para uma sociedade onde é natural conservar os próprios dentes.

Em vez de desinfectantes e antibióticos, que tem sido amplamente usados no processo de tratamento, a preparação de lactobacilos da presente invenção, que apresentam propriedades singulares e alta afinidade para as membranas da mucosa, em combinação com um desinfectante bactericida (USP 6296881B1) desenvolvido pelos inventores, que é suave para as membranas da mucosa, mas tem efeitos severos sobre as bactérias patogênicas, é um agente conservante e agente terapêutico para a doença periodontal, capaz de efetuar uma cura quase completa em casos de doença periodontal desde os estágios prematuros até os estágios tardios, sem levar em conta as capacidade técnicas do dentista desde que se tenha a presença de um dente alveolar para sustentar os dentes. Além disso, o agente terapêutico para a doença periodontal da presente invenção pode ser administrado além dos tratamentos convencionais para a doença periodontal.

Além disso, o crescimento de animais pode ser promovido pela administração da preparação de lactobacilos da presente invenção durante a criação de suínos, galinhas, peixe cavala, insetos e outros animais, contribuindo para uma qualidade melhora e prevenção da doença, e demonstra fortes efeitos terapêuticos contra várias doenças incluindo infecção por Saproglenia e doença de úlcera em peixe-dourado.

Além disso, o crescimento pode ser promovido e uma melhor qualidade obtida por aplicação de preparação de lactobacilos da presente invenção a plantas incluindo morangos, espinafre e outras verduras e ervas. Além de evitar a ocorrência de doença, também é eficaz no tratamento de doenças de plantas como míldio pulverulento e míldio penugento em pepinos. O surgimento da preparação de lactobacilos da presente invenção emite um alento de novidade ao conceito estabelecido convencional do tratamento de infecções com antibióticos ou produtos químicos agrícolas, e está fadado a contribuir em muito com o reconhecimento, no futuro, e o desenvolvimento de “probióticos”.

Os lactobacilos estão amplamente presentes na natureza, desde os intestinos, cavidade oral, e outros partes do corpo vivo até folhas de árvores, gramas, culturas, frutas, solo e esgoto, e são encontrados abundantemente em todos os locais de atividade viva. Como um resultado, eles tem sido usados como uma questão de costume no processamento e conservação de alimentos desde os tempos antigos quando as pessoas não sabiam de sua existência, enquanto atualmente o papel dos lactobacilos é apreciado de uma perspectiva científica e eles alcançaram atenção como probióticos.

Os inventores ainda ultrapassaram uma etapa nova de modo a desenvolver um lactobacilo tendo uma afinidade elevada para o corpo vivo e excelentes capacidades de limpeza que não se encontravam ainda disponíveis. Os requerentes demonstraram que esta bactéria não é apenas eficaz para evitar e tratar doenças, mas também contribui em muito para melhorar o crescimento e a qualidade de animais e plantas. Assim, sua aplicabilidade industrial se estende, como se pensa, não somente à indústria primária, mas também à indústria da saúde como um todo no sentido geral e à indústria de cosméticos como uma extensão da indústria da saúde, e pode ser usado e aplicado amplamente na indústria alimentícia ou geralmente em todos os ambientes requeridos para a vida humana.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS A figura 1 mostra a regeneração de pele de camundongo após seu destacamento.

Figura 2 mostra a proliferação da cepa de célula V-l de rim de macaco.

Figura 3 mostra a proliferação de cepa P815 de células mastocitomas de camundongo.

Figura 4 mostra a proliferação de linfócitos CEA de camundongo.

Figura 5 mostra a proliferação de clorela.

MELHOR MODO PARA REALIZAR A INVENÇÃO A espécie de Lactobacillus casei da presente invenção pode estar na forma de corpos celulares obtidos por cultura, um líquido de cultura ou um filtrado de cultura descontaminado, enquanto a preparação contendo o novo Lactobacillus casei pode ser uma preparação contendo apenas o Lactobaciüus casei da presente invenção ou uma preparação contendo o Lactobacillus casei da presente invenção junto com um antibiótico. A espécie de Lactobacillus casei da presente invenção foi desenvolvida com referência à existência de lactobacilos normalmente presentes na vagina. Isto é, bacilo de Doederlein, que está normalmente presente na vagina, rompe os glicogênios exsudando da parede vaginal, produzindo ácido láctico que mantém a acidez e evita a proliferação de bactérias putrefativas que invadem do exterior, e assim desempenha um papel vital na manutenção da limpeza. Esta bactéria é muito similar a Lactobacillus acidophilus, e, como se sabe, quando seu crescimento é suprimido por antibióticos ou semelhantes, fungos e outras bactérias se proliferam, podendo causar várias inflamações. Isto é, um sistema de prevenção de infecção é construído no suporte principal, do qual é um lactobacilo que pode se estabelecer e proliferar com uma quantidade pequena de nutrição na vagina. Este sistema de limpeza parece ser um básico e comum considerando que as hemorróidas intratáveis se limpam naturalmente se a flora intestinal começar a se constituir principalmente de bactérias benéficas.

Com base nestas descobertas, os inventores aperfeiçoaram a presente invenção ao coletaram tão numerosos auxiliares digestivos de lactobacilos e produtos de lactobacilos comerciais quanto possível, e estudaram as cepas presentes nos mesmos, quando, então, descobriram que somente as cepas bacterianas atendendo a determinadas condições tinham 100% de sua manifestação original ou capacidades laterais e poderíam fundamentalmente ativar os corpos vivos de animais e plantas, com efeitos econômicos sobre seu crescimento e qualidade, assim como aumentar o sistema imune (capacidade de cicatrização natural) contra doenças enquanto, ao mesmo tempo, excluindo fortemente as bactérias causais em casos de infecção.

Dentre as condições a serem atendidas por Lactobacillus casei da presente invenção, a primeira condição essencial é que (1) o nutriente tem uma demanda bem menor do que a de Lactobacillus casei convencional conhecido. Isto é, isto significa que a espécie pode ser cultivada na presença de qualquer um dentre um, dois, três ou quatro aminoácidos como uma fonte de nitrogênio nutriente. (2) A proliferação é rápida no meio de crescimento. Isto significa que quando um meio de cultura promotor do crescimento é inoculado com a espécie e Escherichia coli na mesma quantidade e submetido a uma cultura mista anaeróbica a 37°C, a contagem final de lactobacilos é 50% ou mais da contagem de coliformes. (3) A capacidade de produção de ácido láctico é elevada. Isto significa que quando do cultivo em um meio de cultura apropriado, o valor de pH final é de 4,0 ou abaixo, e a maior acidez é de 1,5% ou mais. (4) A espécie tem uma elevada resistência aos ácidos da bile. Isto significa que a espécie é resistente a sais da bile a 5%. (5) A espécie produz um antibiótico e pode inibir a proliferação de outras bactérias.

Mais preferivelmente, a espécie (a) tem resistência a antibióticos amplamente usados, (b) tem capacidade amilolítica, (c) promove o crescimento de clorela, (d) tem uma ampla faixa de temperaturas de crescimento (cresce em temperaturas na faixa de 5 °C a 45 °C); (e) tem uma ampla faixa de valores de pH de crescimento (cresce a valores de pH na faixa de pH 4,0 a pH 10,0), e (f) tem uma ampla faixa de pressão de oxigênio em que pode crescer (isto é, pode crescer sob qualquer pressão de oxigênio).

Assim, os inventores aclimataram a espécie de Lactobacillus casei, FERM BP-6971, FERM BP 6972, e FERM BP-6973 (abaixo, “espécie original de Lactobacillus casei"), para a qual um pedido de patente já foi submetido, e após muitos esforços dedicados a conferir as propriedades acima mencionadas, alcançaram sucesso na produção de uma cepa bacteriana atendendo às condições da presente invenção de FERM BP-6971 pelo processo descrito abaixo.

Para ter um efeito sobre um corpo vivo, uma bactéria deve se adaptar a seu meio ambiente, prevalecer em competição de crescimento com bactérias patogênicas e se reproduzir de modo adequado. Uma condição necessária para isto é a produção de um antibiótico que suprime o crescimento de outras bactérias, e assim tem o potencial básico ou em outras palavras a potência proliferativa das bactérias deve ser forte. Em geral, os lactobacilos tem elevadas demandas de nutriente, e por exemplo o meio MRS amplamente usado para o crescimento bacteriano é composto de 10 g de extrato de came, 5 g de extrato de levedura, 10 g de peptona, 0,2 g de MgS04 • 7H20, 0,5 g de MnS04 · 5H20, 5 g de acetato de sódio, 2 g de citrato de diamônio, 2 g de KH2P04, e 20 g de glucose por litro. O Lactobacillus casei da presente invenção não é uma exceção, mas como ele é um Lactobacillus casei isolado da natureza, suas demandas de nutrientes originais são moderadas, e ele pode proliferar com concentrações apropriadas de aminoácidos, vitaminas, açúcares utilizáveis e sais inorgânicos, como por exemplo um meio consistindo de meio S-W mais 1 g de ácidos casamino, e 0,1 g de vitaminas. O próprio meio S- contém 1 g de KH2P04, 0,7 g de MgS04 · 7H20,1 g de NaCl, 4 g de (NH4)2HP04, 0,03 g de FeS04 · 7H20 e 5 g de glucose por litro. O meio de placa foi preparado com esta composição, e a espécie original de Lactobacillus casei dispersa em solução de cloreto de sódio esterilizada foi aplicada à mesma e cultivada anaerobicamente durante 48 a 72 h a 37°C. A maior das colônias resultantes foi selecionada, coletada, e cultivada novamente pelos mesmos procedimentos como acima, e a operação de seleção e coleta das colônias à medida que cresciam foi repetida para obter a cepa com o crescimento e proliferação mais rápidos nesta composição de meio. A seguir, uma cepa com bom crescimento foi selecionada por repetição da mesma operação com 1/2 de concentração de nutriente no meio, após o que as colônias que cresceram no meio com a concentração de nutrientes gradualmente reduzidas a 1/4, 1/8 e 1/16 foram identificadas a fim de obter uma cepa com a capacidade de crescer e proliferar rapidamente em meios de nutrição extremamente baixa.

Lactobacillus casei convencional, conhecido, incluindo a espécie original de Lactobacillus casei, requer uma variedade de aminoácidos como fontes de nitrogênio para crescimento, mas a espécie de Lactobacillus casei da presente invenção pode crescer com qualquer um aminoácido ou com 2,3 ou 4 aminoácidos como uma fonte de nitrogênio. Exemplos incluem os sais inorgânicos mais açúcar mais vitaminas mais cloridrato de L(+) lisina mais ácido L-glutâmico. Quando cultivada junto com Escherichia coli, uma bactéria que, como Lactobacillus casei, é uma bactéria familiar que cresce em qualquer lugar na natureza e que é conhecida como uma espécie indicadora de contaminação ambiental, a espécie de Lactobacillus casei da presente invenção não era inferior a Escherichia coli em termos de extensão e velocidade de crescimento nos estágios iniciais e de meio, e esta contagem final de lactobacilos foi 50% ou mais da contagem de coliformes. Quando esta relação de bactérias era de 30% ou menos, uma cepa bacteriana pode ter um efeito pequeno sobre um ser vivo apesar de apresentar grandes capacidades. A seguir, outra propriedade importante necessária a prevalecer na competição por crescimento com outras bactérias é a capacidade de suprimir o crescimento de outras bactérias em um meio de pH reduzido. Isto significa uma cepa bacteriana com uma forte capacidade de produção de ácido láctico. Particularmente, o ácido láctico produzido no sistema digestivo protege o corpo da invasão e proliferação de várias bactérias patogênicas de fora, e secundariamente encoraja a peristalsia nos intestinos, promovendo a excreção de produtos de refugo dos intestinos e suprimindo a produção de produtos de putrefação. Foi demonstrado experimentalmente que um pH final de 4,0 ou menos e uma acidez máxima de 1,5% ou mais é uma condição importante para aumentar as funções de lactobacilos. No entanto, no caso de Lactobacillus casei mais conhecidos, o pH final não alcança 4,2 ou menos e a acidade maior é menor que 1,5%. Um exemplo de um método de criação para melhorar a produtividade de ácido láctico é cultivar as bactérias anaerobicamente durante 48 a 72 h a 37°C em um meio opaco consistindo de 3 g de CaC03 adicionado ao meio descrito acima que contém 10 g de extrato de came, 5 g de extrato de levedura, 10 g de peptona, 0,2 g de MgSCh · 7H2O, 0,5 g de MnSÜ4 · 5H20, 5 g de acetato de sódio, 2 g de citrato de diamônio, 2 g de KH2PO4 e 20 g de glucose por litro, ligando as colônias, e selecionando repetidas vezes as com os anéis transparentes mais amplos em tomo das mesmas. Isto utiliza 0 fato de que quando ácido láctico é produzido, 0 carbonato de cálcio opaco se liga ao ácido láctico e muda para lactato de cálcio. O trato digestivo é conectado ao exterior via um tubo único, e uma razão porque as bactérias vivendo no meio hostil do mundo externo não se estabelecem e se proliferam no meio suave, rico em nutrientes, dos intestinos tem muito a ver com a presença dos ácidos da bile secretados pela vesícula. Consequentemente, a maior parte dos meios de isolamento e seleção para as bactérias intestinais tem ácidos de bile adicionados à composição a fim de suprimir 0 crescimento de outras bactérias. De acordo com as descobertas dos inventores, quando a concentração dos ácidos de bile como deoxicolato de sódio alcança 0,1%, as bactérias intestinais continuam a crescer mas a maior parte das bactérias que não vivem nos intestinos não crescem. A espécie original de Lactobacillus casei foi capaz de crescer em uma concentração de ácido de bile de 0,2%, mas a conclusão foi alcançada parcialmente pelas seguintes razões de que a atividade no corpo requereu crescimento a uma concentração de ácido de bile de 0,5%. Consequentemente, uma cepa bacteriana foi criada pelo método comum para resistência a sais de bile. Isto é, os requerentes começaram por adição de ácidos de bile a 0,2% a meio de elevado teor de nutrientes, como o meio de seleção de ácido láctico LBS e meio de proliferação MRS, e aumentaram a concentração de ácido de bile em estágios a 0,5% à medida que as bactérias cresceram. Uma vez obtida uma cepa resistente, ela foi mostrada como mantendo sua resistência apesar do tipo de meio, e também foi mostrada, pela primeira vez, nestas experiências que a resistência de ácido de bile está correlacionada com a afinidade de membrana da mucosa. Isto é, à medida que a resistência de ácido de bile aumenta ou, em outras palavras, à medida que a afinidade para ácidos de bile aumenta, as bactérias se tomam cada vez mais capazes de colonizar membranas de mucosa fora dos intestinos, como a cavidade oral, membrana da mucosa nasal, vagina e outros. A capacidade de produzir antibióticos que impedem a sobrevivência de outras bactérias é também importante. Lactobacillus casei original produz um antibiótico de amplo espectro que não somente impede o crescimento de outras bactérias mas também foi relatado como enfraquece a toxicidade de bactérias patogênicas, e Lactobacillus casei da presente invenção retém esta capacidade. Além disso, Lactobacillus casei da presente invenção precisa ser resistente a antibióticos amplamente usados, mas o Lactobacillus casei original é resistente a antibióticos, e o Lactobacillus casei da presente invenção retém esta capacidade. A capacidade de usar amidos abundantemente presentes em todo o mundo natural como fontes de energia é desejável para a colonização, sobrevivência e proliferação em corpos vivos. No entanto, a maior parte de Lactobacillus casei não são amilolíticos, ou somente fracamente. A espécie original de Lactobacillus casei não é uma exceção e não apresenta a capacidade amilolítica, mas através do processo de aclimatização, foi possível conferir uma elevada capacidade amilolítica sem afetar a capacidade de romper glucose e lactose, resultado em Lactobacillus casei da presente invenção. Um exemplo de um método de criação para melhorar a capacidade amilolítica consiste em adicionar 4,5 g de glucose e 0,5 g de amido (amido 10% de açúcares) a um meio nutriente médio a baixo com um pH de 7,4, consistindo de 1 g de extrato de carne, 1 g de extrato de levedura, 3 g de peptona, 1 g de NaCl, 0,5 g de K2HPO4, 0,5 g de MgS04 · 7H2O, 0,05 g de MnS04 · 5H20,1 g de acetato de sódio, 0,5 g de citrato de diamônio, e 12 ml de 0,2% de BTB por litro, e então cultivar anaerobicamente durante 48 h a 37°C. O sub-cultivo é então repetido no meio da mesma composição, e se mesmo uma pequena amilólise for confirmada, a porcentagem de amido é então elevada a 20%. Deste modo, a porcentagem de amido dos açúcares é elevada a 100% como é rapidamente adquirido do mesmo modo como para glucose. Em qualquer meio, 0 pH diminui à medida que os açúcares são rompidos para produzir ácidos, e a cor do meio muda de azul para amarelo. E importante manter a sub-cultura até a profundidade de amarelo do meio com amido adicionado ser igual como com 100% de glucose. Felizmente, a maior parte das bactérias que causam infecções crônicas são incapazes de obter energia de ruptura de açúcar, assim dando à espécie de Lactobacillus casei esta capacidade particularmente eficaz como uma medida contra infecções.

Clorela é uma planta de célula única com uma forte vitalidade que tem continuado a fotossintetizar e produzir gerações através divisão celular repetida durante mais de um bilhão de anos neste planeta, e parece ser 0 ancestral de várias plantas vivas. Isto é, pode-se afirmar que clorela é a forma original e fonte de vida na terra. Se um lactobacilo promove 0 crescimento e proliferação de clorela, isto significa que as substâncias produzidas por este lactobacilo ativam e tendo um efeito restaurador sobre as células vivas, assim obviamente devem ser também eficazes para corpos vivos que são acumulações de células. Sabe-se, há décadas, que os produtos metabólicos de clorela promovem a proliferação de lactobacilos, mas não foi até agora relatado que, inversamente, os produtos metabólicos de lactobacilos estimulam a proliferação de clorela. Consequentemente, como um exemplo do método de criação para aumentar a capacidade de promover o crescimento de clorela, um meio com um pH de 6,8 consistindo de 5 g de peptona, 2 g de extrato de carne, 5 g de glucose, 5 g de extrato de levedura, 2 g de KNO3,. 2 g de K2HP04,0,1 g de MgS04 · 7H20,0,1 g de CaCl2 · 2H20,0,1 g de NaCl, 0,01 g de MnS04 · 5H20, 0,05 g ZnS04 · 5H20, 3 g CaC03 e 15 g de agar por litro, foi esterilizado sob pressão elevada durante 15 min a 120 °C e resfriados a cerca de 50 °C após esterilização, uma quantidade apropriada de clorela de cultura pura foi adicionada e misturada de modo uniforme, e a mistura despejada em discos de petri. Após 48 a 72 h de pré-cultura em um incubador iluminado a 28 °C, a espécie original de Lactobacülus casei dispersa em solução salina esterilizada foi aplicada ao meio e sub-cultivada aerobicamente e anaerobicamente (alguns % C02) a 28 °C a 32 °C com luz. Isto foi observado cada 24 h para determinar se a clorela em tomo das colônias em proliferação de Lactobacülus casei estava proliferando mais densamente do que em outras áreas. As colônias demonstrando mesmo a mais leve desta tendência foram coletadas repetidas vezes para preparar a espécie de Lactobacülus casei da presente invenção que promove 0 crescimento de clorela.

Uma ampla faixa de pressões de oxigênio possíveis, temperaturas e valores de pH para crescimento é também uma condição desejável para adaptar e competir com sucesso em ambientes hostis, e isto pode ser obtido por um método de aclimatização comum com a seleção de um meio apropriado.

As diferenças dentre Lactobacillus casei convencional, conhecido, a espécie original de Lactobacillus casei, e a espécie de Lactobacillus casei da presente invenção são mostradas na tabela 1. Como mostrado na tabela 1, porque a espécie de Lactobacillus casei da presente invenção que foi tríada por seleção e aclimatização tem propriedades singulares não presentes em Lactobacillus casei conhecido ou na espécie original de Lactobacillus casei, quando usados em um corpo vivo, a espécie de Lactobacillus casei da presente invenção pode não somente prover efeitos dramáticos não obtidos dos vários produtos de ácido láctico se acotovelando uns nos outros nas prateleiras de alimentos e prateleiras de alimentos para o cuidado da saúde, mas podem atuar brilhantemente para restaurar, manter e aumentar a saúde e para produzir efeitos econômicos como a melhora da qualidade e outros quando usado em plantas e animais, e pode ser bem eficaz contra infecções. A preparação de lactobacilos da presente invenção pode assim ser chamada uma preparação de lactobacilos ativando corpos vivos ou um agente preventivo ou terapêutico contra a infecção em animais e plantas.

[Tabela 1] Comparação de propriedades de diferentes espécies de Lactobacillus casei A placa que é a causa da doença periodontal é, como se diz, um acúmulo de cerca de 400 tipos de bactérias, das quais as mais patogênicas para doença periodontal foram demonstradas como Poryphyromonas gingivalis, Prevotella intermedia e Actinobacillus actinomycetemcomitans, com Walinella recta, Bacteroides forsythus, Eikenella corrodens, Fusobacteria, Treponema e outras estando envolvidas como acessórios. A especificidade da doença periodontal é o maior fator que a toma difícil de curar. Porque os dentes estão diretamente conectados com o interior do corpo, quando uma reação inflamatória é severa, o corpo não tenta parar a doença periodontal mas, ao contrário, forma ranhuras profundas nos limites entre os dentes e a gengivas, destruindo o tecido sustentando os dentes e sacrificando os dentes para proteger o corpo, como um lagarto que vive com seu rabo cortado. Em outras palavras, não é um inimigo externo que destrói o tecido sustentando os dentes, mas a própria inflamação, que é um meio de proteger o corpo do inimigo externo. As raízes dos dentes que foram contaminadas e penetradas por toxinas bacterianas e enzimas não são reconhecidas como próprias pelo corpo, que atua para excluir as mesmas como fatores causadores junto com o tecido circundante. Isto é, uma reação de cura realmente exacerba a doença periodontal. Consequentemente, uma vez que todos os dentes afetados com doença periodontal caem, a doença termina completamente.

Outros fatores incluem (1) o fato de que a cavidade oral é um meio apropriado para o crescimento e proliferação de bactérias, e é difícil manter limpa, e as bactérias com uma forte patogenicidade periodontal particularmente aderem fortemente aos dentes e gengivas ao produzirem glucanos pegajosos, fructanos e outros polissacarídeos insolúveis, substâncias que também servem como uma barreira para proteger os patógenos periodontais, (2) o fato de que porque as toxinas e enzimas que elas produzem penetram de modo imperceptível no tecido periodontal, a doença progride com alguns sintomas subjetivos, e o aparecimentos dos sintomas não é uniforme mas envolve vários fatores incluindo sujeira em tomo dos dentes, inflamação, retração da gengiva, envelhecimento e outros, enquanto uma vez que as bolsas da gengiva se formaram, elas geralmente não fecham o que, em combinação com (1) acima, leva a uma repetida re-ocorrência, (3) o fato de que poucos dentistas prescrevem terapia usando drogas apropriadas em cooperação com especialistas em bacteriologia, (4) o fato de que tanto os doutores como os pacientes assumem que, no pior caso, os dentes podem ser extraídos, e (5) o fato de que a doença periodontal não é um problema local para uma doença sistêmica com freqüência envolvendo, por exemplo, diabete e outros distúrbios endócrinos, distúrbios genéticos, estresse, osteoporose, distúrbios circulatórios, e outros, e não pode ser completamente curada simplesmente por terapia sintomática. A doença periodontal envolve muitos fatores prejudiciais, e é considerada incurável salvo se o tratamento for iniciado nos estágios iniciais.

Atualmente, a forma primária de terapia inicial é o tratamento como remoção das incrustações e da raiz para remover a placa e o cálculo, que são um local próprio para o desenvolvimento da doença periodontal. O cálculo supragengival aderindo às superfícies dos dentes acima da linha da gengiva é relativamente fácil de remover, mas o cálculo subgengival aderindo às superfícies (raízes) dos dentes abaixo da linha da gengiva é denso e duro, de cor verde enegrecido e fortemente adesivo, e as bactérias e suas toxinas não podem ser facilmente removidas apenas por escovação. Assim, métodos foram recentemente adotados para destruir a mesma de modo eficaz com ultrassom ou lasers ou dissolução com produtos químicos especiais. Após isto, um desinfectante ou antibiótico é injetado e fixado na bolsa periodontal até a inflamação ceder. No entanto, quando o sítio de inflamação é profundo e a terapia acima mencionado não produz resultados favoráveis, o sítio de inflamação ou dano é removido por cirurgia. Subsequentemente, as gengivas são costuradas ou reconstruídas com material artificial. As técnicas mais recentes incluem cirurgia de acordo com métodos GTR (regeneração de tecido guiado) e aplicação de um tipo de proteína chamado Emdogain como um adjuvante a cirurgia para recriar um meio similar ao processo de regeneração dos dentes e encorajar a regeneração do tecido periodontal, mas estes não são eficazes contra todos os casos avançados de doença periodontal, e sua aplicação é limitada. Em qualquer caso, atualmente, um tratamento básico para doença periodontal é visado para controlar inflamação das gengivas, parando o progresso da doença periodontal, regenerando o tecido periodontal perdido, melhorando a aparência externa e mantendo o tecido recentemente obtido, mas como mostrado acima, a doença periodontal também envolve fatores de risco sistêmico, e infelizmente atualmente não se dispõe de terapia que seja eficaz o suficiente para ser a favorita, e muitos dentistas estão contentes se apenas puderem manter uma situação sem piorar. O desinfectante bactericida discutido na presente invenção (abaixo, “este desinfectante bactericida”) é um desinfectante bactericida contendo 500 ppm a 1.500 ppm de íons férricos, 500 ppm a 2.000 ppm de ácido L-ascórbico e 200 ppm a 2.000 ppm de um ou dois dentre ácido sórbico, ácido benzóico e éster de ácido paraoxibenzóico, como componentes principais. Já foi concedida uma patente US (USP6296881B1), e seus componentes são reconhecidos no Japão como aditivos alimentícios. Atualmente, os desinfectantes amplamente usados por instituições médicas incluem álcoois, fenóis, compostos de halogênio, sais de amônio quaternário, compostos de biguanida, aldeídos e outros, mas nenhum atende a todas as condições de excelente ação bactericida, segurança e baixa toxicidade, excelente capacidade de manutenção e custo baixo. Por exemplo, o composto biguanida tendo o nome comercial “Hibitane” é um excelente desinfectante cuja toxicidade baixa e alta eficácia o tomaram o melhor no mundo todo durante décadas, mas tem pouco efeito sobre fungos e nenhum efeito sobre bacilos tuberculares e esporos. Algumas bactérias comuns também desenvolveram resistência, e são uma causa de infecções hospitalares. Por outro lado, “este desinfectante bactericida” que foi desenvolvido para preencher as lacunas do tratamento convencional, mata a maior parte de bactérias e fungos em somente 10 segundos, e é capaz de destruir ainda esporos em 1 a 120 minutos. Apesar de suas excelentes propriedades bactericidas, no entanto, sua toxicidade é menor do que a de muitos outros desinfectantes existentes, como mostrado abaixo. (1) Efeitos sobre a pele: não apareceram anormalidades da aplicação nas patas traseiras (almofadas hipotênares) de camundongos duas vezes por dia durante 6 meses. (2) Efeitos de administração oral: lml/ camundongo foi administrado mas não foi notada toxicidade. Esta dose corresponde a 1,8 L para um humano. O LD50 estimado é 10 ml/ camundongo, que corresponde a 18 L para um humano. (3) Efeitos de administração intraperitoneal: O LD5o é cerca de 1 ml/ camundongo (4) Efeitos de células cultivadas (animal): Uma diluição de 103X da concentração para uso não inibe a proliferação celular. Isto é cerca de 1/10 a toxicidade de Hibitane. (5) Efeitos em humanos: a) Desinfecção de mãos e dedos: não foram observadas anormalidades mesmo após 7 anos de uso diário, além de uma leve vermelhidão da pele. b) Gargarejo: não foram observadas anormalidades das membranas da mucosa após 7 anos de gargarejo a cada manhã e noite, e não apareceram efeitos laterais ou toxicidade. Além disso, não ocorreram cavidades durante este período e não foi necessário consultar um dentista.

Os seguintes são os resultados de vários testes “deste desinfectante bactericida” em conexão com doença periodontal. “Este desinfectante bactericida” foi preparado por preparação de uma solução aquosa de 3.000 ppm de cloreto férrico hexaidratado (FeCfi · 6H20) como Fe3+, uma solução aquosa de ácido L-ascórbico com uma concentração de 3.000 ppm e uma solução aquosa de sorbato de potássio com uma concentração de 1.500 ppm e misturação de quantidades iguais destas soluções aquosas. (Exemplo de teste 1) Uma suspensão (1 x 109 células /ml solução salina) da bactéria de teste foi preparada, e 2 % em peso deste “desinfectante bactericida” foram gotejados neste líquido de células. As células foram coletadas com o tempo com um laço de platina, semeadas em meio de crescimento bacteriano e cultivadas em um meio ótimo, e os efeitos bactericidas foram observadas de acordo com a presença ou ausência de proliferação bacteriana. O desinfectante bactericida usado no teste foi fixado na concentração comumente usada. Os resultados após 10 a 60 segundos de contato e os resultados após 1 a 120 minutos de contato são mostrados na tabela 2. Como é evidente da tabela 2, “este desinfectante bactericida” matou quase todas as espécies bacterianas em suas formas ativas em cerca de 10 segundos. Os patógenos periodontais fortes P. gingivalis, P. intermedia e A. actinomycetemconitans não foram uma exceção. No entanto, levou de 1 a 120 minutos para matar os esporos de bactérias esporulantes dependendo do estágio de formação. De acordo com a estatística, o tempo que levou para lavar as mãos e gargarejar por trabalhadores médicos e outros é de 10 a 15 segundos, e neste contexto “este desinfectante bactericida” é altamente eficaz. Quando o mesmo teste foi realizado usando o composto biguanida Hibitane, 3% de solução de peróxido de hidrogênio, e Acrinol, que são desinfectantes amplamente usados em hospitais e consultórios de dentistas, 30 a 60 segundos foram requeridos, e como acima mencionado, Hibitane foi ineficaz contra Mycobacterium e esporos, enquanto a solução a 3% peróxido de hidrogênio foi também ineficaz contra esporos e levou 1 minuto ou mais para matar Mycobacterium. Os resultados para acrinol foram similares aos para a solução a 3% peróxido de hidrogênio.

[Tabela 2] Efeitos bactericidas de desinfectante bactericida [Exemplo de teste 2] Geralmente, sabe-se que os efeitos de desinfectantes são reduzidos por contaminação com material orgânico, particularmente proteínas, assim os efeitos bactericidas na presença de material orgânico foram investigados. Primeiro, leite desnatado e extrato de leveduras foram, cada, adicionados a “este desinfectante bactericida” em quantidades de 1 ppm, 50 ppm e 100 ppm, enquanto ao mesmo tempo 2 % em peso de uma solução salina fisiológica 1 x 109 células /ml de MRSA de E. coli 0-157 como a bactéria de teste foi gotejada sobre estas soluções aquosas. O tempo de contato entre a bactéria de teste e “este desinfectante bactericida” foi de 10 s a 5 min, e amostras de 10 μΐ do líquido de bactéria de teste misto foram coletadas com tempo, semeadas em meio apropriado e cultivadas a 37°C para avaliar os efeitos bactericidas de acordo com a presença ou ausência de crescimento bacteriano. Os resultados são mostrados na tabela 3. A presença de material orgânico não teve efeito quando a concentração de material orgânico foi de 1 ppm, mas quando a concentração de material orgânico foi de 50 ppm ou mais, ele teve um leve efeito. O mesmo teste foi também realizado com espécies bacterianas diferentes das duas mencionadas acima, com resultados similares. O mesmo teste foi também realizado usando desinfectantes comumente usado em consultórios de dentistas, mas em concentrações acima de 50 ppm as bactérias não morrem após 1 minuto de contato com Hibitane, e sobreviveram 5 min de contato em alguns casos dependendo do tipo e quantidade de material orgânico. Os resultados obtidos com a solução a 3% peróxido de hidrogênio e acrinol foram similares aos para Hibitane.

[Tabela 3] Efeitos bactericidas na presença de material orgânico [Exemplo de teste 3] Os requerentes investigaram se, no processo de putrefação após a preparação de alimentos, a pulverização “deste desinfectante bactericida” sobre os alimentos iria parar o progresso de putrefação, e qual seria o grau deste efeito bactericida. Normalmente os desinfectantes não são aplicados aos alimentos após a preparação, mas com ffeqüência aparas de alimentos fazem um caminho nas bolsas periodontais, provendo uma fonte de nutrição para bactérias, e porque os ingredientes “neste desinfectante bactericida” são compostos que são reconhecidos como aditivos alimentícios, é importante avaliar estes efeitos. “Arroz cozido”, “tofu”, “espinafre com sésamo” e “carne frita e vegetais” imediatamente após a preparação foram triturados como as amostras, homogeneizados e deixados a 28 °C. Após 5 h, parte de cada amostra foi tomada para contagem de bactérias vivas, enquanto o resto de cada amostra foi pulverizado completamente com o desinfectante. As células vivas foram contadas 1 h, 2 h e 24 h após a pulverização. Água apenas foi pulverizada como controle. Após cada uma das amostras ter sido deixada durante 24 h, parte foi tomada para contagem de células vivas enquanto o restante de cada amostra foi pulverizado completamente com cada desinfectante. Quando as amostras foram deixadas durante 5 h, as células vivas foram contatas 1 h, 2 h e 24 h após a pulverização. Água apenas foi pulverizada como um controle. As células vivas foram contadas pelo processo de placa despejada usando 5 g de cada amostra, que foram tomadas e diluídas por métodos comuns. O grau de putrefação naturalmente difere de acordo com o método de preparação, material alimentício e meio. No caso destas amostras, a contagem de células vivas no arroz cozido foi de 2 x 10 células / g de amostra imediatamente após a preparação, 1 x 103 células/g de amostra após 5 h, 5 x 105 células/g de amostra após 24 h, e 7 x 106 células/g de amostra após 48 h. No caso do tofu, a contagem de células viva inicial foi 2 x 104 células/g de amostra, mas isto se elevou a 8 x 105 células/g de amostra após 5 h, 9 x 107 células/g de amostra após 24 h e 1 x 109 células/g de amostra após 48 h, com um nível maior de putrefação. No caso de espinafre com sésamo, a contagem foi 2 x 103 células/g de amostra imediatamente após a preparação, se elevando a 5 x 104 células/g de amostra após 5 h, 3 x 107 células/g de amostra após 24 h e 2 x 108 células/g de amostra após 48 h. No caso de carne frita e vegetais, a contagem foi 5 x 10 células/g de amostra imediatamente após a preparação , elevando a 2 x 10 células/g de amostra após 5 h, 2 x 10 células/g de amostra após 24 h, neste ponto se tem um leve cheiro de putrefação, e 3 x 109 células/g de amostra após 48 h, neste ponto a putrefação tinha progredido a um nível maior.

Os resultados são mostrados na tabela 4. Cinco horas após a preparação, quando as bactérias não proliferavam muito, a pulverização de desinfectante imediatamente reduziu as contagens de células a 1/100 a 1/200, com algumas diferenças dependendo do tipo de alimento preparado. Após 1 h, isto caiu a 1/1000 a 1/5000 da contagem original, e após 2 h as células tinham morrido, com contagens de 10 células /g de amostra ou menos. As bactérias sobreviventes não proliferam mesmo após 24 h. Em carne e outros alimentos ricos em proteína, 7 x 102 células/g de amostra (cerca de 1%) sobreviveram 2 h após a pulverização do desinfectante. 24 h após a preparação, as contagens de células foram da ordem de 107 a 108, mas isto caiu a 1/1000 a 1/10.000 imediatamente após a pulverização de desinfectante, a 1/10.000 a 1/500.000 após 1 h e a 1/300.000 a 1/2.000.000 após 2 h. A contagem de células neste ponto foi cerca de 102 células/g de amostra. Após 24 h, a contagem de células foi levemente maior do que após 2 h, mas isto reflete, como se pensa, não uma proliferação muito grande de bactérias sobreviventes, como as bactérias precipitando do ar. Consequentemente, bactericida foi geralmente obtido apesar de uma erradicação completa não ser obtida. Isto é, se tem um efeito bactericida e um efeito de supressão no crescimento de bactérias de putrefação de alimentos. O mesmo teste foi realizado usando desinfectantes amplamente usados em consultórios de dentistas além “deste desinfectante bactericida”, como os resultados mostrados na tabela 4. Quando Hibitane foi pulverizado, a taxa de diminuição em contagens de células imediatamente após a pulverização foi menor do que obtidas com “este desinfectante bactericida” , apesar da tendência ser igual. No entanto, este efeito enfraqueceu com tempo e as bactérias começaram a proliferar novamente. Isto é, apesar do crescimento de bactérias de putrefação de alimentos ser suprimido em uma certa extensão, não se tem um efeito bactericida verdadeiro. Além disso, a maior parte das bactérias sobreviveu imediatamente após a pulverização de uma solução de peróxido de hidrogênio a 3%, e após 24 h o alimento estava no ponto de putrefação.

[Tabela 4] Aumentos e diminuições induzidos por desinfectantes em contagens de células em alimentos preparados Os dados para “este desinfectante bactericida” nos exemplos de teste 1 a 3 sugerem o potencial para um forte efeito bactericida contra patógenos periodontais escondidos nas bolsas periodontais. Em contraste, os desinfectantes amplamente usados em odontologia são um pouco eficazes quando os patógenos periodontais não tem uma barreira, mas quando a placa ou cálculo se forma, e quando se tem uma fonte nutricional, como material orgânico ou resíduo de alimento, seus efeitos são bem menores.

Com base nos resultados de teste acima, os requerentes testaram a eficácia de cada desinfectante bactericida usando, como material de teste, placa, que é considerada como a causa na raiz de doença periodontal.

[Exemplo de teste 4] A placa aderindo ao cálculo supragengival foi coletada, seções cortadas a uma espessura de 200 pm e placa em pó triturada em um tamanho de grão de 10 pm foram embebidos em 1 ml “deste desinfectante bactericida” , e os números de células vivas contidas na mesma foram medidos com tempo por métodos comuns. Os resultados são mostrados na tabela 5. A contagem de células vivas de 4 x 109 células contidas em 20 mg de seções de placas foi reduzida em 3/4 após 1 min de imersão, caindo a 1/5.000 da contagem de células original após 5 min, e após 10 min todas as bactérias tinham morrido. Todas as bactérias na placa em pó foram eliminadas em 3 min. Isto é, foi mostrado que “este desinfectante bactericida” rompe através da barreira, penetrando no interior da placa e tendo um efeito bactericida sobre as bactérias ai. No caso de Hibitane (gel de Hibitane), solução de peróxido de hidrogênio a 3% e acrinol, que são amplamente usados no campo dental, as bactérias na superfície de placa foram principalmente eliminadas em 3 min, mas as bactérias dentro da placa duraram mesmo 60 min de imersão, com metade das células sobrevivendo. Isto significa que elas não podem danificar defmitivamente a placa, que é uma agregação de bactérias. Quando o mesmo teste foi realizado usando placa aderindo ao cálculo subgengival (denso e duro), todas as bactérias foram eliminadas em cerca de 15 min no caso de placa conformada em chapa e em 3 min no caso do pó. Em contraste, quando Hibitane e outros foram usados, as bactérias dentro da placa duraram 60 min de imersão e continuaram a sobreviver como descrito acima.

[Tabela 5] Mudanças induzidas por tratamento com desinfectante bactericida em contagens de células vivas em placa A seguir, considerando casos em que outro material orgânico adere a ou contamina a placa aderindo ao cálculo, os requerentes misturaram 20 mg de placa com 20 mg de extrato de levedura e realizaram um teste pelos métodos acima. Os resultados são mostrados na tabela 6. Se tem um pequeno efeito do material orgânico, com a contagem de células caindo a cerca de 1/2000 da contagem original após 5 min de imersão e todas as bactérias eliminadas após 10 min de imersão no caso de uma placa em forma de chapa. No caso de placa em pó, todas as bactérias foram eliminadas após 3 min de imersão. Em contraste, com desinfectantes comumente usado, a desinfecção da superfície da placa levou 10 min devido à presença de material orgânico, e a maior parte das bactérias internas sobreviveu. Isto é, é mostrado que a não ser que a placa seja completamente eliminada no tratamento, apesar de uma melhora temporária ser notada, problema ocorrerá de novo repetidas vezes.

[Tabela 6] Mudanças induzidas por tratamento com desinfectante bactericida em contagens de células vivas em placa e material orgânico Como é evidente de vários resultados de testes dados nos exemplos de teste 1 a 4 acima, “este desinfectante bactericida” inflige um dano severo sobre as bactérias sobrevivendo na forma ativa em vários meios. Os patógenos de doença periodontal vivendo em bolsas periodontais e se escondendo em placas difíceis de remover não são uma exceção, e foi mostrado que a injeção “deste desinfectante bactericida” nestes casos destrói as bactérias em segundos a cerca de 10 min, com algumas diferenças dependendo do estágio de crescimento e tipo de placa. Além disso, deve ser mencionado que em testes com animais e experiências com humanos, como descrito acima, “este desinfectante bactericida” foi mostrado como tendo um efeito danificador muito pequeno em células e tecido, e promove a regeneração de tecido.

[Exemplo de teste 5] Cerca de 1 cm2 de pele de camundongo foi destacado e vários desinfectantes bactericidas em concentrações comuns foram aplicados às feridas usando algodão absorvente em cada manhã e noite. Agua foi aplicada como um controle. Os resultados são mostrados na tabela 7. No caso do camundongo de controle, levou 5 dias para uma pele fina ser regenerada sobre a ferida, 12 dias para a pele ter de volta sua espessura original, e 35 dias para o pêlo nascer de novo, enquanto a aplicação “deste desinfectante bactericida” levou 4 dias para a ferida fechar, 10 dias para a pele ter de novo sua espessura original e somente 30 dias para o pêlo nascer de novo. Estes resultados estão de acordo com os obtidos com tintura de iodo, significando que tanto “este desinfectante bactericida” como a tintura de iodo promovem a regeneração de tecido. Em contraste, com aplicação de gel Hibitane, solução de peróxido de hidrogênio a 3% e acrinol, que são amplamente usados em odontologia, levou 5 dias para uma pele fina se formar, 12 a 15 dias para a pele ter de novo sua espessura original e 40 dias para o pêlo nascer de novo. Isto é, estes desinfectantes atuam como venenos que suprimem a regeneração do tecido.

[Tabela 7] Recuperação induzida por desinfectante bactericida de feridas da pele [Exemplo de teste 6) Quando diluições deste “desinfectante bactericida” foram adicionadas ao meio, como mostrado na tabela 8, eles estimularam o crescimento do bacilo de ácido láctico usado na presente invenção. Sabe-se bem que o crescimento de lactobacilos é promovido por adição de ácido acético, mas é surpreendente que um desinfectante bactericida com ação bactericida deva ter um efeito promotor do crescimento mesmo em diluição. No entanto, como mostrado na tabela 9, os patógenos de doença periodontal e outras bactérias patogênicas não são afetados deste modo. Isto significa que se “este desinfectante bactericida” for primeiro injetado em uma bolsa periodontal que é, então, lavada com água e cheia com a espécie de Lactobacillus casei novo (a seguir, “lactobacilo novo”) da presente invenção, que tem capacidades singulares como descrito abaixo, o crescimento de “lactobacilo novo” será estimulado, melhorando os efeitos terapêuticos contra doença periodontal. Em contraste, quando desinfectantes amplamente usados foram adicionados ao meio em diferentes concentrações, o crescimento bacteriano foi às vezes suprimido mas nunca estimulado. Além disso, o componente principal Fe3+ deste “desinfectante bactericida” é adsorvido pelas superfícies dos dentes e serve como uma barreira para os proteger contra re-adesão por patógenos periodontais. Devido a ter um efeito astringente, além disso, a secreção de fluido na ranhura periodontal que provê uma fonte de nutrientes para os patógenos periodontais, é temporariamente reduzida, assim suprimindo o crescimento e a proliferação por corte de parte do suprimento de nutrientes para os patógenos periodontais escondidos dentro das ranhuras. [Tabela 8] Efeito deste desinfectante bactericida no crescimento de bacilos de ácido láctico - Crescimento suprimido ± Crescimento nem suprimido nem promovido + Crescimento promovido [Tabela 9] Efeito deste desinfectante bactericida no crescimento de bactérias patogênicas - Crescimento suprimido + crescimento nem suprimido nem promovido + crescimento promovido Exemplos A presente invenção é explicada em detalhes abaixo com base em exemplos, mas a essência da presente invenção não é limitada aos mesmos. Os processos de fabricação podem ser mudados, e quaisquer números de células podem, como evidente, ser obtidos por uso de um extensor ou excipiente conhecido. A preparação pode ser formulada em qualquer modo junto com excipientes apropriados, como um pó, grânulos, cápsulas ou outros, por exemplo. (Exemplo de fabricação 1) O Lactobacittus casei (FERM BP-10059, FERM P-19443) da presente invenção foi semeado em 10 L de meio de pH 7,2 contendo 10 g de peptona, 5 g de extrato de came, 5 g de extrato de levedura, 10 g de lactose, 2 g de K2HPO4, 0,1 g de MgS04 · 7H20, 1 g de NaCl, 2 g de citrato de diamônio, 5 g de acetato de sódio, 3 g de CaC03, 0,3 g de MnS04 · 5H20, 0,03 g de FeS04 · 7H20 e 1 g de L-cisteína por litro, e cultivados anaerobicamente durante 72 h a 37°C. Após completar a cultura, 0 líquido de cultura foi filtrado em papel para remover 0 CaC03, e 3 L de filtrado foram refrigerados enquanto 0 líquido restante foi centrifugado para obter um sobrenadante e uma massa bacteriana de 8,4 g. Esta foi então lavada em 420 ml de solução salina fisiológica, e centrifugada duas vezes. A massa bacteriana purificada resultante foi colocada em uma solução consistindo de 70 g de leite desnatado, 20 g de amido solúvel, 0,5 g de glutamato de sódio e 1000 ml de água purificada, agitada, e liofilizada a vácuo por meio comum para obter 101 g de preparação bacteriana. Quando medida, a contagem de células desta preparação bacteriana foi 2,5 x 1010 células/g. A preparação resultante consistia de 101 g de células bacterianas liofilizadas (incluindo conservante), 3000 ml de líquido de cultura e 6700 ml de filtrado de cultura (líquido desinfectado). (Exemplo de fabricação 2) O Lactobacillus casei (FERM BP-10059, FERM P-19443) da presente invenção foi semeado em 10 L de meio de pH 6,8 contendo 3 g de ácidos casamino, 2 g de extrato de levedura, 50 ml de suco de tomate, 2 g de glucose, 1 g de NaCl, 1 g de KH2P04,0,7 g de MgS04 · 7H20,1 g de CaCl · 2H20,0,5 ml de Tween 80 e 0,5 g de amido solúvel por litro, e cultivados em uma cultura anaeróbica facultativa durante 96 h a 30 °C. Após completar a cultura, 3 L de líquido de cultura foram refrigerados enquanto os 7 L restantes foram centrifugados para obter um sobrenadante e uma massa bacteriana de 5,6 g. Este foi então lavado em 280 ml de solução salina fisiológica, e centrifugado novamente. 2,6 g de massa bacteriana purificada resultante foram misturados bem com 10,4 g de amido de batata, e refrigerados. Os restantes 3 g de massa bacteriana purificada foram colocados em uma solução consistindo de 15 g de leite desnatado, 15 g de amido solúvel, 5 g de trehalose, 0,2 g de cisteína, e 500 ml de água purificada, agitados, e secados por congelamento a vácuo por meio comum para obter 39 g de preparação bacteriana. Quando medida, a contagem de células desta preparação bacteriana foi 2 x 1010 células/g. A preparação resultante consistia de 39 g de células bacterianas secadas por congelamento (incluindo conservante), 13 g de células bacterianas úmidas ((incluindo conservante), 3000 ml de líquido de cultura e 6700 ml de filtrado de cultura (líquido desinfectado). (Exemplo de fabricação 3) O Lactobacillus casei (FERM BP- 10059, FERM P-19443) da presente invenção foi semeado em 5 L de meio contendo 100 g de leite desnatado e 1 g de trehalose por litro que tinha sido ajustado a pH 6,8, e cultivado em uma cultura anaeróbica facultativa durante 72 h a 37°C. A seguir, 75 g de trehalose foram adicionados a este líquido de cultura (iogurte), que foi bem agitado e secado por congelamento a vácuo por métodos comuns para obter 590 g de preparação bacteriana. Quando contadas, as contagens de células desta preparação bacteriana foi 5 x 109 células/g. A preparação bacteriana resultante continha células bacterianas e produtos de fermentação de leite desnatado. (Exemplo de fabricação 4) Para preparar a preparação de lactobacilos novos (FERM BP-10059, FERM P-19443) da presente invenção, o lactobacilo novo resistente a antibiótico (FERM BP-10059, FERM P-19443) da presente invenção foi semeado em 10 L de meio de pH 7,2 contendo 5 g de peptona, 2 g de extrato de carne, 2 g de extrato de levedura, 1 g de CGF, 5 g de amido, 1 g de lactose, 2 g de citrato de diamônio, 3 g de acetato de sódio, 0,2 g de MgSC>4 · 7H20, 0,03 g de FeS04 · 7H20, e 1 g de L-cisteína por litro e cultivado anaerobicamente durante 3 dias a 37°C. Após completar a cultura, o liquido de cultura foi filtrado em papel para remover o CaCCb e então centrifugado, e 7,8 g de células bacterianas resultantes foram dispersas em 370 ml de solução salina fisiológica e centrifugados novamente duas vezes. A massa bacteriana purificada resultante foi dispersa em 450 ml de solução de amido a 5% previamente esterilizada, e liofilizada a vácuo por métodos comuns para obter 30 g de preparação de lactobacilo novo. O teor de células vivas desta preparação bacteriana foi 1 x 1011 células/g. (Exemplo de fabricação 5) Os corpos de células purificadas fabricados pelo exemplo de fabricação 4 foram misturados com 15,7 ml de azeite de oliva para fabricar uma preparação de óleo. O teor de células vivas desta preparação bacteriana foi de 2 x 10u células/g. 10 g desta preparação de óleo foram misturados em 10 g de ungüento hidrofílico para fabricar um creme de lactobacilos. A seguir, 400 mg de amoxilina (AMPC), 100 mg de eritromicina (EM), 100 mg de fradiomicina (FRM), e 100 mg de cefaclor (CCL) como antibióticos foram misturados com o creme de lactobacilos para fabricar um creme de lactobacilos contendo antibiótico. (Exemplo 1) A velocidade e porcentagem de mutações S-R em E. coli 0-157 devido aos efeitos de antibióticos enfraquecendo toxina produzidos por Lactobacillus casei quando E. coli 0-157 e Lactobacillus casei estavam, ambos, presentes, foram investigadas por meio de uma cultura mista de E. coli 0-157 e a espécie de Lactobacillus casei original (FERM BP-6971) e uma cultura mista de E. coli 0-157 e a espécie de Lactobacillus casei da presente invenção (FERM BP-10059, FERM P-19443). O meio foi composto de 5 g de extrato de carne, 1 g de extrato de levedura, 5 g de peptona, 2 g de NaCl, 1 g de CaC03 e 2 g de glucose ou amido por litro, com o pH ajustado a 7,2. A cultura era anaeróbica a 37°C, com sub-culturas a cada 72 h que foram diluídas e aplicadas cada vez a um meio de placa. As colônias resultantes foram observadas, e os números de tipos S (original) e tipos R (enfraquecido com toxina) foram contados e as porcentagens comparadas. Os resultados são mostrados na tabela 10 e tabela 11. Como mostrado na tabela 10, quando glucose foi usada como as contagens de células de açúcar flutuaram muito com sub-cultivo quando E. coli 0-157 foi subcultivado junto com o Lactobacillus casei original (FERM BP-6971). Em cerca da quinta sub-cultura, o tipo R apareceu (30%) e a porcentagem de tipo R aumento à medida que a sub-cultura continuou, de modo que todas as bactérias eram de tipo R pela 18® sub-cultura. O tipo S não reapareceu com subseqüente sub-cultura. Em contraste, quando E. coli foi sub-cultivado junto com a espécie de Lactobacillus casei da presente invenção (FERM BP-10059, FERM P-19443), o tipo R apareceu pela terceira sub-cultura a uma taxa de 5%, alcançando 50% pela 5âsub-cultura, e pela 12-sub-cultura, todo E. coli 0-157 era de tipo R. Isto é, E. coli 0-157 foi afetado mais pela espécie de Lactobacillus casei da presente invenção do que pela espécie de Lactobacillus casei original. Isto é atribuído à diferença na potência de proliferação entre as duas espécies de Lactobacillus casei.

[Tabela 10] Resultados de cultura mista de E. coli 0-157 com a espécie Lactobacillus casei original e a espécie Lactobacillus casei da presente invenção com glucose como açúcar Como mostrado na tabela 11, quando amido foi usado como o açúcar, a potência proliferativa de E. coli 0-157 declinou, mas a proliferação de espécie de Lactobacillus casei original declinou ainda mais, e a contagem de células final foi menor que 5 x 108 células. Devido à esta redução na eficácia, o E. coli 0-157 mudou mais lentamente do que o tipo R, com uma porcentagem de 10% na 1~geração e 50% na 20 -geração. A porcentagem de tipo R nunca excedeu 70% com sub-cultura contínua. No entanto, a potência proliferativa de espécie de Lactobacillus casei da presente invenção não foi diferente do que com glucose, e neste caso, a potência proliferativa de E. coli 0-157 declinou com cada sub-cultura, com a porcentagem de tipo R alcançando 15% na 3â geração e 100% na 7â geração.

[Tabela 11] Resultados de cultura mista de E. coli 0-157 com a espécie de Lactobacillus casei original e a espécie de Lactobacillus casei da presente invenção com amido como açúcar Além de E. coli 0-157, testes similares foram realizados usando Salmonella enteritidis e Shigella flexneri, mas no caso de E. coli 0-157, a mutação no tipo R foi mais rápida com a espécie de Lactobacillus casei da presente invenção do que com a espécie de Lactobacillus casei original, como mostrado na tabela 12. Quando uma cepa do patógeno que tinha mudado para o tipo R foi administrada oralmente e intraperitonealmente em camundongos na dosagem letal para o tipo S, a taxa de fatalidade foi 0 e os pêlos e comportamento não foram diferentes dos camundongos não tratados, confirmando que a patogenicidade tinha sido principalmente eliminada.

[Tabela 12] Taxas de aparecimento de patógenos de tipo R em cultura mista (Exemplo 2) Um teste já foi feito em que a ingestão diária de 2 g de células bacterianas liofilizadas (5 x 108 células/g) fabricadas no exemplo de fabricação 1 e consistindo de Lactobacillus casei original causou um aumento em lactobacilos e bifidobactérias, que são conhecidos como componentes benéficos da flora intestinal e, inversamente, uma diminuição em Clostridium e Veillonella, que são conhecidos como bactérias nocivas. Neste exemplo, os resultados da ingestão de espécie de Lactobacillus casei da presente invenção por 10 indivíduos saudáveis foram medidos e comparados com tempo durante 3 meses. Os resultados são mostrados na tabela 13. Quando o Lactobacillus casei original (FERM BP- 6971) foi ingerido, bifidobactérias aumentaram em cerca de 90% em 3 meses e Lactobacillus casei aumentou 150%, enquanto Clostridium diminuiu 50% e Veillonella diminuiu 25%. No entanto, quando Lactobacillus casei da presente invenção (FERM BP-10059, FERM P-19443) foi ingerido, bifidobactéria aumentou 133% em 3 meses e Lactobacillus casei aumentou 300%, enquanto Clostridium diminuiu 96% e Veillonella diminuiu 98,4%. Isto é, os efeitos sobre bactérias benéficas e nocivas que completam a flora intestinal são bem maiores com o Lactobacillus casei da presente invenção. A capacidade de reduzir bactérias nocivas é particularmente surpreendente.

[Tabela 13] Mudanças na flora intestinal em indivíduos saudáveis (Exemplo 3) A seguir, 2 g de células bacterianas liofilizadas fabricadas no exemplo de fabricação 1 de Lactobacillus casei acima mencionado foram administrados a 10 inválidos, e as bactérias medidas e comparadas com tempo durante 3 meses. Os resultados são mostrados na tabela 14. Como mostrado nas tabelas 13 e 14, antes da administração, o indivíduo saudável tinha cerca de 2 vezes o número de bactérias benéficas em sua flora intestinal como os inválidos, e somente cerca de 1/3 os números de bactérias nocivas. Isto mostra que o estado da flora intestinal reflete o estado corrente de saúde. Em resposta a um estudo, todos os indivíduos saudáveis que tinham participado no teste se sentiram como estando mais saudáveis, enquanto os inválidos registraram uma maior confiança em sua saúde. As respostas específicas incluíram relatórios que (1) a fadiga diminuiu, (2) a cor melhorou, (3) as anormalidades nas fezes foram depuradas, (4) a pele recuperou firmeza e beleza, (5) obesidade melhorou, (6) a pressão sanguínea elevada retomou ao normal e (7) atopia foi consideravelmente melhorada, e a proporção destas respostas foi bem maior dentre os que ingeriram o Lactobacillus casei da presente invenção. (Exemplo 4) Três locais de plantio de largura 600 mm x diâmetro 200 mm x altura 150 mm foram preparados, e cada cheio com solo de campo normal misturado com 100 g de adubo composto maduro e 12 g de fertilizante químico (Nippon Godo Fertilizer Co. Green Map, N: 8%, P : 5%, K: 5%), e espalhados com 10 g de cal de magnésio (NAC Co., melhorador de solo consistindo de 5 a 7% de óxido de magnésio misturado com cal extinta). A seguir, os sulcos foram feitos em uma profundidade de 5 a 8 mm, e plantados manualmente com semente de rabanete. A germinação ocorreu no quinto dia, e no dia seguinte, 2 g de massa bacteriana centrifugada consistindo de Lactobacillus casei original (FERM BP- 6971) que tinha sido cultivado em um meio descrito no exemplo de fabricação 2 foram adicionados a 200 ml, bem agitados e aplicados ao grupo de controle. No intervalo, 2 g de massa bacteriana centrifugada consistindo de Lactobacillus casei da presente invenção (FERM BP-10059, FERM P-19443) que tinha sido cultivada no meio descrito no exemplo de fabricação 2 foram adicionados a 200 ml de água, agitados bem e aplicados ao grupo de teste. Água apenas foi aplicada ao grupo não tratado. Por cerca do 102 dia após a emergência das folhas, estas foram separadas em intervalos de cerca de 5 cm, deixando 30 plantas de rabanete em cada local de plantio. As suspensões das massas celulares centrifugadas respectivas foram aplicadas ao grupo de controle e grupo de teste juntos com 150 ml de uma diluição de 500 vezes de fertilizador, enquanto somente 150 ml de uma diluição de 500 vezes de fertilizador foram aplicados ao grupo não tratado. Os rabanetes foram então aguados como necessário para evitar que os mesmos sequem e coletados no 282 dia. Os resultados são mostrados na tabela 15. Os rabanetes coletados do grupo de teste que foi tratado com o Lactobacillus casei da presente invenção eram superiores não somente aos rabanetes não tratados mas também às plantas no grupo de controle que foram tratadas com o Lactobacillus casei original em termos de todas as medidas de qualidade incluindo peso, brilho, cheiro, carne, gosto e viço.

[Tabela 15] Resultados de crescimento de rabanete (Exemplo 5) Um teste de crescimento foi realizado com os grupos de teste como no exemplo 4 por cultivo hidropônico de sementes de brotos de rabanete branco. A esponja foi espalhada no fundo de uma caixa de polietileno de 100 de largura x 100 de diâmetro x 180 mm de altura, embebida com água, e propagados no todo com as sementes de broto de rabanete branco. Com a temperatura fixada a 22 °C, estes foram cobertos com um pano preto durante 5 dias para bloquear a luz, após o que o pano foi removido e eles foram cultivados em luz natural. Para o grupo de controle, 1 g de células bacterianas liofilizadas de espécie de Lactobacillus casei original (FERM BP-6971) foi adicionado a 100 ml de água, bem agitados, e aplicados por névoa no 32 e 52 dias. Para o grupo de teste, 1 g de células bacterianas liofilizadas de Lactobacillus casei da presente invenção (FERM BP-10059, FERM P-19443) fabricado no exemplo de fabricação 1 foram adicionados a 100 ml de água, bem agitados e aplicados por névoa no 32e 52 dias. Somente água foi aplicada ao grupo não tratado. Como mostrado pelos resultados de crescimento na tabela 16, a aplicação de Lactobacillus casei da presente invenção resultou em melhores brotos de rabanete branco do que no grupo não tratado ou grupo de controle.

[Tabela 16] Resultados de crescimento para brotos de rabanete branco Como é evidente dos exemplos 1 a 5, a espécie de Lactobacillus casei da presente invenção, que tinha adquirido várias propriedades através de aclimatização enquanto retendo as propriedades da espécie de Lactobacillus casei original, foi confirmada para melhorar a vitalidade em uma extensão incalculável no corpo vivo, e é fundamentalmente uma cepa diferente da espécie de Lactobacillus casei original. (Exemplo 6) Com relação à toxicidade de P. gingivalis e P. intermedia, foi mostrado que a qualidade e a quantidade das toxinas produzidas pode ser estimada dos resultados de testes com animais por observação da cor e cheiro de colônias escuras cultivadas em placas de sangue e a resistência da adesividade sobre a placa, enquanto no caso de A. actinomycetemcomitans, a qualidade e quantidade de toxinas produzidas pode ser estimada da observação de adesividade e resistência hemolítica. Os requerentes, assim, cultivaram os patógenos periodontais principais acima mencionados juntos com o “lactobacilo novo” para investigar quais tendências e reações devem ser demonstradas pelos patógenos periodontais. Usando o caldo GAM modificado por Nissui como o meio, as bactérias foram cultivadas anaerobicamente a 37°C com sub-culturas a cada 72 horas, quanto então a cultura foi diluída e aplicada por métodos comuns ao meio de placa de sangue, e as contagens de células e condições das colônias resultantes foram observadas com o tempo. Os resultados são mostrados nas tabelas 17, 18 e 19. Como é evidente da tabela 17, a contagem de células de P. gingivalis caiu gradualmente com cada sub-cultura, desaparecendo pela 25â sub-cultura. Durante este tempo, a toxicidade gradualmente enfraqueceu começando com a 5a sub-cultura, e enquanto alguma toxicidade leve ainda estava presente pela 15a sub-cultura, pela 20a tinha desaparecido virtualmente. Foi confirmado que os camundongos infectados periodontalmente com esta bactéria não desenvolvem periodontite. Como é evidente da tabela 8, a contagem de células de P. intermedia declinou gradualmente com a sub-cultura, e as bactérias tinham desaparecido pela 15a sub-cultura. A patogenicidade também declinou como um resultado, desaparecendo pela 12a sub-cultura. Como se nota na tabela 19, a contagem de células de A. actinomycetemcomitans declinou com cada sub-cultura, mas não tão rapidamente como com P. gingivalis e P. intermedia. Passado um certo ponto, no entanto, A. actinomycetemcomitans declinou rapidamente, desaparecendo pela 18a sub-cultura. Em testes com camundongos, a patogenicidade tinha completamente desaparecido pela 12a cultura. Os testes de co-cultura similares foram realizados usando outras bactérias implicadas em doença periodontal, como F. nucleatum, B. forsythus, L. buccalis, E. corrodens, e também STreptococcus, que são comuns na cavidade oral, mas todos estes foram superados pela potência proliferativa e substâncias bioativas de lactobacilos da presente invenção , e contagens celulares e toxicidade são mostrados como declinando com cada sub-cultura. (Exemplo 7) Quando “lactobacilos novos” (FERM BP-10059, FERM P-19443) são cultivados em riscas anaerobicamente durante 72 h a 37°C no centro de uma placa com um diâmetro de 90 mm, e vários patógenos periodontais cultivados em riscas em sua borda, o desenvolvimento de patógenos periodontais é parado próximo das áreas ocupadas pelo FERM BP-10059 (FERM P-19443) pelo efeito de substâncias bioativas como antibióticos produzidos por FERM BP-10059 (FERM P-19443). Os requerentes assim observaram como a faixa de crescimento deve mudar quando patógenos periodontais cultivados na borda, onde o desenvolvimento foi parado, foram tomados repetidas vezes e cultivados em riscas sobre placas de crescimento de FERM BP-10059 (FERM P-19443). Neste exemplo, o FERM BP-10059 (FERM P-19443) não foi misturado com os patógenos periodontais como no exemplo 5. O meio GAM modificado foi usado sobre as placas. Os resultados são mostrados na tabela 20. A faixa de parada devido a FERM BP-10059 (FERM P-19443) foi igual após várias sub-culturas como na cultura inicial mas, além de um certo ponto, a faixa de parada cresceu rapidamente e pelas 13a e 15a sub-culturas, os patógenos foram eliminados do disco de Petri. A toxicidade gradualmente declinou ao mesmo tempo e finalmente desapareceu.

[Tabela 20] Efeitos de lactobacilos novos (FERM BP-10059) em bactérias causando doença periodontal 43> Esffegaço cultivado mas não cresceu Em um teste de sensibilidade usando antibióticos existentes, a faixa de parada gradualmente encolheu em todos os casos com cada passagem, e resistência foi fmalmente obtida. Isto é, as cepas resistentes a antibióticos apareceram, e as toxinas bacterianas foram ou inalteradas ou com freqüência cresceram mais fortes. O aparecimento e difusão de MRSA, VRE, e M. tuberculosis, Ps. Aeruginosa e outros resistentes a múltiplas drogas são bem conhecidos como sendo um sério problema mundial. Os exemplos 6 e 7 acima são uma prova de que os patógenos periodontais não desenvolvem resistência devido aos fortes efeitos de FERM BP-10059 (FERM P-19443) seja que eles o contatem diretamente ou não, mas ao contrário sua capacidade de crescer e proliferar é suprimida com tempo e toxicidade é completamente eliminada. (Exemplo 8) Para medir a adesividade de “lactobacilo novo” FERM BP-10059, FERM P-19443) em bolsas periodontais, uma solução de células (2 x IO10 /ml) colocadas em suspensão em solução salina fisiológica foi injetada em bolsas de profundidade equivalente, solução salina fisiológica estéril foi injetada nas bolsas no próximo dia, e após 5 min, a solução salina injetada foi aspirada para fora das bolsas e o crescimento e declínio de FERM BP-10059 (FERM P-19443) foi observado a cada dia durante uma semana. Uma mucilagem de L. acidophilus, que coloniza membranas mucosas, foi preparada como um controle, e este e B. natto altamente adesivo foram injetados separadamente no mesmo número e o progresso observado. Os resultados são mostrados na tabela 21. Quando 2 x IO10 ml de FERM BP- 10059 (FERM P-19443) foram injetados, a maior parte (90% a 95%) foram lavados, mas as bactérias restantes persistiram durante cerca de uma semana, e a taxa de colonização foi maior quanto mais profunda a bolsa. Isto significa que FERM BP-10059 (FERM P-19443) é capaz de crescer usando o fluido da ranhura periodontal como sua fonte de nutriente principal, e pode ser mais ativo em doença periodontal mais avançada. Em contraste, não foi visto L. acidophilus do 4o dia e não foi visto B. naíto do 3°' dia. Isto é, estas bactérias não podem se estabelecer e proliferar em bolsas periodontais. (Exemplo 9) 0 crescimento e declínio no número de células foram observados quando o “lactobacilo novo” FERM BP-10059, FERM P-19443) foi injetado em bolsas periodontais em dias sucessivos e quando foi injetado dia sim dia não. Como mostrado na tabela 22, quando as bactérias foram injetadas cada dia, as contagens de células nas bolsas subiu gradualmente, com colonização e proliferação sendo melhores quando mais profunda a bolsa, enquanto quando foi injetada dia sim dia não, a colonização e proliferação das bactérias foi um pouco mais lenta do que a injeção diária, mas os números de células subiram gradualmente no todo. Isto sugere que se tem suficiente para injetar as bactérias em dias alternados. 0 “lactobacilo novo” (FERM BP-10059, FERM P-19443) não é somente eficaz contra todos os tipos de infecções agudas e crônicas, mas é também eficaz na melhora das condições crônicas sistêmicas como diabete que são fatores associados com doença periodontal. Isto é, a administração do lactobacilo novo da presente invenção aumenta a força de cicatrização natural do corpo, que se traduz em vitalidade. A vitalidade é a capacidade do corpo de promover o crescimento e regenerar tecido. (Exemplo 10) 45 peixes-dourados (Wakin) com um comprimento médio de 4,2 cm demonstrando os sintomas iniciais de doença Saproglenia foram divididos em três grupos, um grupo não tratado, um grupo de controle e um grupo de teste, e observados durante 2 meses em um total de 9 tanques de água com as temperaturas da água para cada grupo fixadas em 15 °C, 20 °C e 25 °C. Os cinco peixes-dourados foram criados em 5 litros de água em cada tanque. 1 g de células bacterianas liofilizadas (5 x 106 células /ml de água do tanque) da espécie de Lactobacillus casei original (FERM BP-6971) foi administrado ao grupo de controle. 1 g de células bacterianas liofilizadas (5 x 106 células/ml de água do tanque) da espécie de Lactobacillus casei da presente invenção (FERM BP-10059, FERM P-19443) fabricadas no exemplo de fabricação 1, foi administrado a cada grupo de teste. Os peixes-dourados no grupo não tratado foram criados sem qualquer tratamento. Os resultados são mostrados na tabela 23. Como mostrado na tabela 23, no grupo não tratado, todos os peixes dourados morreram em menos que um mês, sem levar em conta a temperatura da água, com o tempo de sobrevivência médio de 18 dias. No grupo de controle recebendo a espécie de Lactobacillus casei original, todos os peixes-dourados morreram em menos que um mês no tanque a 25 °C, com um tempo de sobrevivência médio de 23 dias, mas nos tanques a 15 °C e 25 °C, Saproglenia cresceram mais lentamente e os peixes-dourados sobreviveram mais tempo, com 2 mortes apos um mês e outros 2 morrendo após 2 meses a 15 °C, para uma taxa de mortalidade de 80%. A 20 °C, 2 morreram após um mês e todos após 2 meses, para uma taxa de mortalidade de 100%. Em contraste, usando a espécie de Lactobacillus casei da presente invenção, 1 peixe-dourado morreu no dia 45 da criação no tanque a 20 °C, enquanto no tanque a 25 °C, 1 peixe-dourado morreu no dia 25 e 1 peixe-dourado morreu no dia 50, mas os outros peixes-dourados estavam bem saudáveis e a Saproglenia aderindo a suas superfícies do corpo declinaram até ficarem quase imperceptíveis. A taxa de crescimento foi igual como a do peixe-dourado saudável. Isto indica que a espécie de Lactobacillus casei da presente invenção, que foi aclimatada em baixas temperaturas, é eficaz mesmo em uma temperatura baixa de 15 °C.

[Tabela 23] Resultados experimentais contra doença Saproglenia em peixes- dourados (Exemplo 11) Uma experiência de alimentação foi realizada em tanques fixados nas mesmas condições que no exemplo 10 usando grupos de 5 peixes-dourados (Wakin) sofrendo de doença de úlcera, em que Aeromonas invadem através de uma ferida e dissolve a carne circundante, levando os órgãos internos a ficarem expostos em casos severos. Os sintomas de doença de úlcera do peixe-dourado estão na faixa de suave a moderados, e os peixes-dourados foram criados durante 2 meses com os sintomas equilibrados dentre os tanques. Os resultados são mostrados na tabela 24. Como na tabela 24, os sintomas do peixe-dourado no grupo não tratado progrediram sem levar em cònta a temperatura da água, e em 2 meses, os órgãos ficaram expostos e todos os peixes morreram. No grupo de controle recebendo a espécie de Lactobacillus casei original (FERM BP-6971), os peixes com sintomas suaves mantiveram seu estado na temperatura de água menor, mas quando a temperatura da água foi elevada, os sintomas progrediram lentamente e por fim 60% a 80% dos peixes morreram em 2 meses. Em contraste, no grupo de teste recebendo a espécie de Lactobacillus casei da presente invenção (FERM BP-10059, FERM P-19443), os peixes com sintomas suaves foram principalmente curados em levar em conta a temperatura da água. Mesmo no caso de sintomas moderados as feridas gradualmente cicatrizaram, e nenhum peixe morreu mesmo após 2 meses.

[Tabela 24] Resultados experimentais para doença de úlcera peixe-dourado (Exemplo 12) Cerca de 1 cm2 de pele de camundongo foi destacado, após o que água foi aplicada duas vezes na manhã e à noite ao grupo não tratado, enquanto células centrifugadas de cepa ATCC 393 padrão de L. casei e o “lactobacilo novo” (FERM BP-10059, FERM P-19443) foram aplicadas aos grupos de tratamento bacteriano, e o progresso foi observado. Como mostrado na figura 1, quando FERM BP-10059 (FERM P-19443J) foi aplicado, levou somente 3 dias para uma película fina cobrir toda a superfície da ferida, 8 dias para a pele se recuperar completamente, e 22 dias para o pêlo crescer completamente. Em contraste, isto levou 4 dias, 10 dias e 28 dias usando ATCC 393 e 5 dias, 12 dias e 35 dias usando água. Este teste também mostra os efeitos restauradores de tecido notáveis do “lactobacilo novo” (FERM BP-10059, FERM P-19443). (Exemplo 13) Para investigar o aumento de células com células de animais e células de plantas, a cepa ATCC 393 padrão de L. casei e o “lactobacilo novo” (FERM BP-10059, FERM P-19443) foram semeados em meio de pH 7,2 contendo 3 g de peptona, 2 g de triptona, 3 g de extrato de carne, 1 g de CGF, 1 g de extrato de levedura, 3 g de amido, 1 g de trehalose, 1,5 g de KH2PO4,0,7 g de MgS04 · 7H20,1 g de NaCl, 1 g de citrato de diamônio, 1 g de (NFLrh HP04,2 g de acetato de sódio, 2 g de CaC03, 0,2 g de MnS04 · xH20, 0,03 g de FeS04 · 7H20, 0,01 g de ZnS04,0,2 g de L-cisteína, e 1 g de taurina por litro, e cultivados anaerobicamente durante 72 h a 37°C, células de rim de macaco (V-l), células mastocitomas P815 de camundongo, e linfócitos CEA de camundongos foram misturados 2 x 105 células /ml com líquido de cultura consistindo de meio GIT de Japan Pharmaceutical Co. para cultura animal ao qual 5% sobrenadante centrifugado de culturas de lactobacilos foram adicionados ou não adicionados, e células vivas foram contadas após 48 h. Os resultados são mostrados nas figuras 2, 3 e 4. Como mostrado nas figuras, quando filtrado de cultura de lactobacilos a 5% foi adicionado a seu líquido de cultura de células, as células animais se tomam mais prolíficas, com um aumento de 10 a 15% usando a cepa ATCC 393 padrão e um aumento de 40 a 50% usando FERM BP-10059 (FERM P-19443). Isto indica que substâncias produzidas pelos lactobacilos (substâncias bio-ativas) estimulam e promovem a proliferação (divisão celular) e o aumento na proliferação de linfócitos sugere uma contribuição para o reforço do sistema imune. Além disso, como mostrado na figura 5, em um teste similar usando células de planta clorela, a taxa de proliferação foi também aumentada apesar de não tanto como com as células animais.

Os patógenos periodontais tem um variedade de fatores patogênicos que infligem um dado direto ou indireto no tecido periodontal, incluindo fatores relacionados com adesão, proteinases e toxinas, substância que atua como toxinas, produtos metabólicos e outros. Os exemplos específicos incluem endotoxinas (LPSI), colagenases, enzimas semelhantes a tripsina, enzimas supressoras de fibroblatos, e outras enzimas destrutivas, leucocitotoxinas, estreptolisina, sulfeto de hidrogênio, ácidos graxos e outras toxinas de células assim como adesão física por meio de cílias longas para o epitélio mucosal, glóbulos vermelhos do sangue e outras bactérias. A endotoxinas particularmente tem numerosos efeitos incluem a ativação de osteoclastos (promovendo a absorção de osso alveolar), danificando os fibroblastos e promovendo reações imunopatológicas (dano da circulação do tecido periodontal). O “lactobacilo novo” (FERM BP-10059, FERM P-19443) não somente bloqueia a proliferação de patógenos periodontais e atua para enfraquecer sua patogenicidade, mas também converte e destoxifica algumas das toxinas produzidas por patógenos periodontais. (Exemplo 14) As células de patógenos periodontais foram cultivadas durante 120 h anaerobicamente a 37°C em caldo GAM modificado, coletadas por centrifugação, flutuadas em solução salina fisiológica e levadas três vezes por centrifugação. Elas foram então flutuadas uniformemente em cinco vezes a quantidade de água e resfriadas a 0 °C, e a mesma quantidade de solução aquosa resfriada com gelo de 0,5 N ácido tricloroacético foi adicionado e deixados durante 3 h a 0 °C. O resíduo de corpo de células foi então removido por centrifugação, 2 equivalentes de volume de etanol resfriado foram adicionados ao sobrenadante, e o precipitado foi centrifugado. O precipitado foi lavado com uma quantidade pequena de etanol e então com éter, resultando em uma endotoxina na forma de um pó branco. Um disco foi impregnado com 5 mg desta endotoxina e secado para preparar um disco de sensibilidade. A seguir, a cepa ATCC 393 padrão L. casei e o “lactobacilo novo” (FERM BP-10059, FERM P-19443) foram aplicados ao meio de placa BCP contendo 2,5 g de extrato de levedura, 5 g de peptona, 1 g de glucose, 0,1 g L-cisteína, 1 g de Polysorbate 80 e 0,06 g de BCP por litro, o disco de sensibilidade preparado acima foi colocado no centro do meio, e as bactérias foram cultivadas anaerobicamente durante 48 h a 37°C. Como resultado, o crescimento de ATCC393 foi bloqueado 12 mm da borda do disco, enquanto FERM BP-10059 (FERM P-19443) cresceram prolificamente na borda do disco. Isto indica que FERM BP-10059 (FERM P-19443) estavam incorporando estas endotoxinas em suas células como fatores de crescimento como vitaminas. Além disso, o “lactobacilo novo” (FERM BP-10059, FERM P-19443) tinha a capacidade de deprimir agressivamente compostos de enxofre odoríferos como ácidos graxos e sulfeto de hidrogênio, e sua proliferação é estimulada pela adição destas substâncias. (Exemplo 15) Três grupos de 15 pacientes sofrendo respectivamente de colite aguda, cistite aguda e conjuntivite, doenças causadas por bactérias similares e tendo sintomas similares, foram, cada, subdivididos em 3 sub-grupos de 5 pacientes cada. Em cada grupo, o sub-grapo A foi tratado durante 5 dias com 1000 mg/dia de antibióticos apenas, o sub-grupo B foi tratado durante 5 dias com 500 mg/dia de antibióticos e durante 10 dias com 2 g/ dia (5 x 1010 células /dia) de células liofilizadas da espécie de Lactobacillus casei resistente a antibióticos da presente invenção (FERM BP-10059, FERM P-19443) fabricados pelos métodos do exemplo de fabricação 1, e o sub-grupo C foi primeiro tratado com 1000 mg/dia de antibióticos sozinho, e uma vez os sintomas agudos tendo diminuído, o antibiótico foi parado (normalmente durante 2 a 3 dias) e o grupo foi então tratado como o sub-grupo B durante 7 dias com 2 g/dia de células bacterianas liofilizadas. Os efeitos do tratamento médio para cada grupo durante 10 dias são mostrados na tabela 25. Como é evidente da tabela 25, o uso de preparação de lactobacilos da presente invenção em conjunto com administração de antibióticos convencional para o tratamento de infecção aguda ou administração da preparação de lactobacilos da presente invenção após administração de antibióticos oferece grandes vantagens, especialmente à luz dos problemas de resistência de drogas encontrado com terapia convencional usando somente antibióticos, incluindo (a) deixar a dose de antibiótico ser reduzida pela metade, (b) deixar a carga sobre os pacientes ser muito reduzida ao encurtar o tempo requerido para reduzir, melhorar e eliminar os sintomas sem virtualmente efeitos laterais, e (c) evitar tais problemas como distúrbios na flora intestinal e substituição microbiana. Para infecções agudas, os resultados são similares (com algumas diferenças em patógenos e sintomas) para os resultados terapêuticos obtidos com a espécie de Lactobacillus casei original em exemplo comparativo 1 abaixo.

[Tabela 25] Efeitos terapêuticos da espécie de Lactobacillus casei da presente invenção contra infecção aguda 1) ++ queda drástica em números globais de bactérias intestinais, ruptura temporária mas significante em equilíbrio competitivo dentre as bactérias formando a flora intestinal + queda considerável na flora intestinal, alguma ruptura temporária em equilíbrio competitivo dentre as bactérias formando a flora intestinal + algumas mudanças mas nenhum grande efeito - sem mudanças particulares (Exemplo comparativo 1) Gomo no exemplo 15, três grupos de 15 pacientes sofrendo respectivamente de colite aguda, cistite aguda e conjuntivite, doenças causadas por bactérias similares e tendo sintomas similares, foram, cada, subdivididos em 3 sub-grupos de 5 pacientes cada. Em cada grupo, o subgrupo A foi tratado durante 5 dias com 1000 mg/dia de antibióticos apenas, o sub-grupo B foi tratado durante 5 dias com 500 mg/dia de antibióticos e durante 10 dias com 2 g/ dia (5 x 1010 células /dia) de células liofilizadas de FERM BP 6972, uma das espécie de Lactobacillus casei originais resistentes a antibióticos, que foi fabricada pelos métodos do exemplo de fabricação 1, e o sub-grupo C foi primeiro tratado com 1000 mg/dia de antibióticos sozinho, e uma vez os sintomas agudos tendo diminuído, o antibiótico foi parado (normalmente durante 2 a 3 dias) e o grupo foi então tratado como o subgrupo B durante 7 dias com 2 g/dia de células bacterianas liofilizadas. Os efeitos do tratamento médio para cada grupo durante 10 dias são mostrados na tabela 26. Este exemplo comparativo corresponde ao exemplo de teste (tabela 6) do pedido de patente JP acessível ao público 2001-333766.

Existem muitas teorias com relação ao mecanismo de ocorrência de doença periodontal, mas o consenso é que ela ocorre como uma condição inflamatória crônica causada por um acúmulo de placa. A placa é uma agregação de muitos tipos de bactérias que produzem toxinas que causam inflamação das gengivas, e se isto progredir, as bolsas periodontais entre os dentes e as gengivas são empurradas, ocorre halitose, e o tecido de sustentação dos dentes incluindo o ligamento periodontal e osso alveolar é destruído. 80% dos adultos sofrem em algum grau de doença periodontal, que pode se espalhar aos dentes vizinhos e resultar em perda de dentes se deixada não tratada, e é reconhecida como um modelo típico de uma doença que ainda é difícil de curar. Os patógenos principais incluem Poryphyromonas gingivalis, Actinobacillus actinomycetemcomitans, Provoutel intermédia, Prevotella intermedia e outros, que não produzem toxinas como bactérias de envenenamento de alimentos, de modo que a doença progride com alguns sintomas subjetivos e em muitos casos é muito tarde para o tratamento uma vez diagnosticado. Além disso, a cavidade oral está sendo constantemente contaminada por bactérias e provê um meio apropriado para sua proliferação, de modo que o problema continua a recorrer, e infelizmente existem poucos dentistas em que confiar para tratar a doença periodontal. Os sintomas que ocorrem quando as lesões se desenvolvem de modo profundo nas gengivas e pus continua a escorrer são similares aos de hemorróidas, sugerindo algum tipo de associação profunda na ocorrência de infecções intratáveis na entrada e na saída do trato digestivo. A prevenção e tratamento de doença periodontal basicamente consiste do seguinte. (1) Tanto quanto possível de placa e cálculo (resíduo de placa) é removido por escovação, ou mais recentemente é destruído e removido de modo eficaz com ultrassom e lasers ou dissolvidos com produtos químicos especiais (remoção do leito bacteriano). (2) Um desinfectante, antibiótico ou preparação de enzima anti-inflamatória é administrado por injeção na bolsa periodontal até a área inflamada melhorar, em um esforço para suprimir a inflamação. (3) No entanto, quando o sítio de inflamação é profundo e os tratamentos (1) e (2) acima não produzem resultados favoráveis sozinhos, o sítio de inflamação ou dano é removido por cirurgia. (4) subsequentemente, as gengivas são costuradas ou reconstruídas com material artificial. As tentativas recentes foram feitas para encorajar a regeneração do tecido periodontal por injeção de drogas tendo proteínas formadoras de esmalte como seus componentes principais. (5) Quando todos os tratamentos são ineficazes, os dentes são extraídos e reconstruídos. Isto é, o objetivo é controlar a inflamação das gengivas,, parar o progresso da doença periodontal, regenerar o tecido periodontal perdido, melhorar a aparência externa e manter tecido recentemente ganho novamente. (Exemplo 16) 20 pacientes com doença periodontal foram divididos em grupos A (A a D) com cinco pessoas em cada grupo, e uma vez tanta placa e tártaro como possível foram removidos de todos os pacientes por remoção das incrustações e tratamento da raiz, as bolsas periodontais foram cheias com ou um ungüento antibiótico ou com células bacterianas liofilizadas da presente invenção feitas em um gel com uma quantidade pequena de água. No grupo A, um antibiótico foi usado sozinho ou junto com uma preparação de enzima anti-inflamatória, como necessário. No grupo B, uma preparação consistindo de uma mistura de quantidades iguais de células bacterianas liofilizadas resistentes a antibióticos fabricadas no exemplo de fabricação 1 e a preparação bacteriana resistente a antibióticos fabricada no exemplo de fabricação 3 foi administrada junto com um antibiótico. No grupo C, um antibiótico ou preparação de enzima anti-inflamatória foi administrada inicialmente, seguido pela preparação bacteriana acima mencionada. No grupo D, não foi usado antibiótico desde o começo, e somente a preparação bacteriana foi administrada. Para fins de tratamento, as bactérias causadoras principais foram isoladas e testadas para sensibilidade à droga, e o antibiótico apropriado foi selecionado em cada caso com base nos resultados. Os resultados são mostrados nas tabelas 27 e 28. Como se nota das tabelas 27 e 28, a administração de preparação de lactobacilos da presente invenção, sozinha ou junto com um antibiótico, resultou na eliminação do agente bacteriano causador em menos que metade de um mês, mesmo em casos de doença periodontal para os quais antibióticos ou enzimas anti-inflamatórias sozinhas eram esperados como tendo um efeito muito pequeno, e com 1 a 2 meses de administração contínua, os efeitos foram obtidos que nunca poderíam ter sido obtidos com terapia convencional, incluindo a eliminação de uma respiração ruim e melhoras na condição da gengiva, o interior das bolsas periodontais e dentes soltos, apesar de com diferenças individuais. Assim, os efeitos terapêuticos da cepa de Lactobacillus casei original, como descrito no exemplo comparativo 2 abaixo, foram ainda melhorados, e efeitos dramáticos sobre a espessura e firmeza do tecido da gengiva das bolsas periodontais são notáveis. (Exemplo comparativo 2) 8 pacientes com doença periodontal foram divididos em 4 grupos A a D, 2 pacientes por grupo, e grupo A recebeu antibióticos apenas ou junto com uma preparação de enzima anti-inflamatória dependendo dos sintomas. No grupo B, uma preparação consistindo de uma mistura de quantidades iguais de células bacterianas liofilizadas de espécie de Lactobacíllus casei original, fabricada pelos métodos do exemplo de fabricação 1 e uma preparação bacteriana fabricada pelos métodos do exemplo de fabricação 3 (ambos resistentes a antibióticos) foi administrada junto com um antibiótico. No grupo C, um antibiótico ou preparação de enzima anti-inflamatória foi administrado inicialmente, seguido por preparação bacteriana acima mencionada. No grupo D, não foi usado antibiótico desde o começo, e somente a preparação bacteriana foi administrada. Este exemplo comparativo corresponde ao exemplo de teste 2 usando pacientes periodontais (pacientes sofrendo de abscesso alveolar e gengivite) no pedido de patente JP acessível ao público No. 2001-333766, e os resultados são dados na tabela 29 (correspondendo a parte de tabelas 7 a 10 no pedido de patente JP acessível ao público No. 2001-333766). (Exemplo 17) Um teste de tratamento foi realizado para as infecções crônicas, sinusite crônica, bronquite crônica e escaras. O grupo A recebeu antibiótico apenas ou junto com uma preparação de enzima anti-inflamatória dependendo dos sintomas. Nos casos de sinusite crônica, os seios foram geralmente lavados com uma solução aquosa de uma preparação de antibiótico em suspensão, enquanto no caso de escaras, uma preparação de antibiótico foi aplicada à área afetada após limpeza. Os resultados do tratamento são mostrados na tabela 30. No grupo B, uma preparação consistindo de uma mistura de quantidades iguais das células bacterianas liofilizadas (FERM BP-10059, FERM P-19443) fabricadas no exemplo de fabricação 1 e a preparação de lactobacilos (FERM BP-10059, FERM P-19443), fabricada no exemplo de fabricação 3, foi administrada junto com um antibiótico. Em casos de sinusite crônica, o método básico de administração da preparação de lactobacilos foi por lavagem nasal usando uma suspensão de 2 g de células bacterianas liofilizadas em 1 litro de água quente. Nos casos de escaras, as células liofilizadas foram passadas ou espalhadas sobre as escaras. Os resultados do tratamento são mostrados na tabela 31. No grupo C, um antibiótico foi administrado inicialmente, sozinho ou junto com uma preparação de enzima anti-inflamatória, seguido pela preparação de lactobacilos acima mencionada. Os resultados do tratamento são mostrados na tabela 32. No grupo D, não foi usado antibiótico desde o começo, e somente a preparação de lactobacilos foi administrada. Os resultados do tratamento são mostrados na tabela 33. Para fins de tratamento, as bactérias principais causando as infecções crônicas foram isoladas e testadas para sensibilidade a droga, e o antibiótico apropriado foi selecionado em cada caso com base nos resultados. Como se nota das tabelas 30 a 33, efeitos terapêuticos fortes foram obtidos usando a preparação de lactobacilos da presente invenção para infecções crônicas que são difíceis de curar com antibióticos. O uso combinado de um antibiótico com a preparação de lactobacilos da presente invenção, que tem uma resistência a antibiótico, foi particularmente eficaz. Os resultados foram ainda melhores do que os obtidos com a espécie de Lactobacillus casei original, como descrito abaixo. ((Exemplo comparativo 3) 8 pacientes com sinusite crônica e 8 pacientes com bronquite crônica foram, cada, divididos em 4 grupos A a D, duas pessoas por grupo, e o grupo A recebeu um antibiótico apenas ou junto com uma preparação de enzima anti-inflamatória dependendo dos sintomas. No Grupo B, uma preparação consistindo de uma mistura de quantidades iguais de células bacterianas liofilizadas da espécie de Lactobacillus casei original fabricada pelos métodos do exemplo de fabricação 1 e uma preparação de lactobacilos fabricada pelos métodos do exemplo de fabricação 3 foi administrada junto com um antibiótico. No grupo C, um antibiótico foi administrado inicialmente ou sozinho ou junto com uma preparação de enzima anti-inflamatória, seguido pela preparação de lactobacilos acima mencionada. No grupo D, não foi usado antibiótico desde o começo, e somente a preparação de lactobacilos foi administrada. Este exemplo comparativo corresponde ao exemplo de teste 2 para sinusite crônica e bronquite crônica no pedido de patente JP acessível ao público No. 2001-333766, e os resultados são dados nas tabelas 34 e 35 (correspondente a parte das tabelas 7 a 10 no pedido de patente JP acessível ao público No. 2001-333766). (Exemplo 18) 20 g de preparação de células bacterianas liofilizadas (FERM BP -6971), fabricadas pelos métodos do exemplo de fabricação 2, misturadas com 100 g de lactose, foram administrados 2 g por dia a pacientes sofrendo de condições crônicas que não eram infecções, incluindo constipação, diarréia, diabete, um distúrbio não infeccioso, síndrome de fadiga crônica, dermatite atópica, pressão sanguínea baixa, neurose e pressão sanguínea elevada. A dose administrada de bactérias foi de 2 g/dia a 1 x IO10 células/g. Em um teste de tratamento da preparação de lactobacilos da presente invenção (FERM BP-10059, FERM P-19443), a preparação foi administrada durante 2 meses a 10 pacientes, cada sofrendo dos mesmos ou de sintomas similares, e a melhora média é mostrada na Tabela 36. Cerca 15% dos pacientes não demonstraram melhora em sintomas mesmo após receber a preparação de lactobacilos da presente invenção, mas em nenhum caso os sintomas pioraram. A eficácia foi também demonstrada em vários graus para muitas condições crônicas além das mostradas na tabela 36, incluindo arteriosclerose, gota, obesidade e hepatite crônica. Como é evidente da tabela 36, se os efeitos da preparação de lactobacilos forem obtidas 100% sem interferência, a força de cicatrização natural do corpo é melhorada, e a vitalidade é restaurada. Por exemplo, se os intestinos forem limpos por administração interna, o sangue é naturalmente limpo de modo que hormônios, enzimas, anticorpos, substâncias imunes e outras substâncias essenciais são transportadas livremente em todo o corpo, tomando o metabolismo mais regular, melhorando as funções sistêmicas e permitindo uma vida sem transtornos devido a doença. Na verdade, a tese de “prolongamento da vida” de Metchinikoff foi finalmente realizada após um século.

Como mostrado no exemplo 16, bons eleitos são obtidos através de uma administração apropriada deste lactobacilo no tratamento de doença periodontal, mas infelizmente esta não pode ser chamada uma cura dependendo do progresso da doença periodontal. Consequentemente, os inventores mostraram, como um resultado de pesquisa exaustiva, que os efeitos podem ser melhorados através da aplicação dos aspectos do desinfectante bactericida como um pré-tratamento, com os resultados explicados abaixo. (Exemplo 19) As áreas afetadas de 5 pacientes sofrendo de doença periodontal superficial foram lavadas com “este desinfectante bactericida” e então tratadas por injeção da “preparação de lactobacilo novo” fabricada no exemplo de fabricação 4 na área afetada. Os resultados são mostrados na tabela 37. (Exemplo 20) Cinco pacientes sofrendo de doença periodontal superficial foram tratados primeiro por desinfecção das áreas afetadas com “o desinfectante bactericida” e então injetando uma “preparação de lactobacilos novos contendo antibióticos”, fabricada de acordo com o exemplo de fabricação 5 nas áreas afetadas. Os resultados são mostrados na tabela 38. (Exemplo comparativo 4) Como uma comparação, 5 pacientes, cada sofrendo de doença periodontal foram tratados com “este desinfectante bactericida” com a “preparação de lactobacilos novos” fabricada no exemplo de fabricação 4, com a “preparação de lactobacilos novos contendo antibióticos” fabricada no exemplo de fabricação 5 e com terapia convencional. Os resultados são mostrados na tabela 39.

[Tabela 39] Resultados do tratamento para doença periodontal superficial usando terapia convencional Quando a doença periodontal era superficial, a cor da gengiva, intumescimento e elasticidade foram recuperadas em 2 a 3 semanas com terapia convencional e as bolsas cresceram de modo mais superficial, mas nunca fecharam. Em contraste, quando a desinfecção com “este desinfectante bactericida” foi combinada com a “preparação de lactobacilos novos” da presente invenção, a melhora foi rápida desde o começo do tratamento, o intumescimento diminuiu rapidamente, a cor da gengiva e elasticidade foram recuperadas em grande parte em cerca de 2 semanas e as bolsas gradualmente cresceram superficialmente, fechando em cerca de um mês para uma cura completa. (Exemplo 21) Cinco pacientes sofrendo de doença periodontal intermediária foram tratados por primeiro desinfecção das áreas afetadas com “este desinfectante bactericida” e então injetando a “preparação de lactobacilos novos” fabricada no exemplo de fabricação 4. Os resultados são mostrados na tabela 40. (Exemplo 22) Cinco pacientes sofrendo de doença periodontal intermediária foram tratados primeiro por desinfecção das áreas afetadas com “este desinfectante bactericida”, e então injetando a “preparação de lactobacilos novos contendo antibióticos” fabricada no exemplo de fabricação 5. Os resultados são mostrados na tabela 41.

[Tabela 41] Resultados do tratamento de doença periodontal intermediária por uma combinação de desinfecção com "este desinfectante bactericida" e a "preparação de lactobacilo novo" da presente invenção ("preparação de lactobacilo novo contendo antibióticos" usados como preparação de lactobacilos) _________________________________________________________ (Exemplo comparativo 5) Em uma comparação, 5 pacientes com, cada, doença periodontal intermediária foram tratados com “este desinfectante bactericida”, a “preparação de lactobacilos novos” fabricada no exemplo de fabricação 4, a “preparação de lactobacilos novos contendo antibióticos” fabricada no exemplo de fabricação 5 e terapia convencional. Resultados são mostrados na tabela 42.

[Tabela 42] Resultados do tratamento para doença periodontal intermediária usando terapia convencional Quando a doenya pcnuuuuuu cia intermediária, o intumescimento diminui mas a cor e a elasticidade ainda eram insatisfatórias com terapia convenciona, e apesar das bolsas crescerem um pouco mais superficiais e mais estreitas, a mudança não foi grande. Em contraste, quando a desinfecção com “este desinfectante bactericida” foi combinada com a “preparação de lactobacilos novos” da presente invenção, apesar do progresso para uma cura ser mais lento do que no caso de doença periodontal superficial, se nova uma melhora definitiva e uma cura quase completa em 2 a 3 meses. (Exemplo 23) Cinco pacientes sofrendo de doença periodontal profunda foram tratados por primeiro desinfecção das áreas afetadas como “este desinfectante bactericida” e então injetando a “preparação de lactobacilos novos” fabricada no exemplo de fabricação 4. Os resultados são mostrados na tabela 43.

[Tabela 43] Resultados do tratamento de doença periodontal profunda por uma combinação de desinfecção com "este desinfectante bactericida" e a "preparação de lactobacilo novo" da presente invenção ("preparação de lactobacilo novo" usada como a preparação de lactobacilos) (Exemplo 24) Cinco pacientes sofrendo de doença periodontal profunda foram tratados por primeiro desinfecção das áreas afetadas como “este desinfectante bactericida” e então injetando a “preparação de lactobacilos novos contendo antibióticos” fabricada no exemplo de fabricação 5. Os resultados são mostrados na tabela 44.

[Tabela 44] Resultados do tratamento de doença periodontal profunda por uma combinação de desinfecção com "este desinfectante bactericida" e a "preparação de lactobacilo novo" da presente invenção ("preparação de lactobacilo novo contendo antibióticos" usadas como preparação de lactobacilos) (Exemplo comparativo 6) Como uma comparação, 5 pacientes cada com doença periodontal profunda foram tratados com “este desinfectante bactericida”, a “preparação de lactobacilos novos” fabricada no exemplo de fabricação 4, a “preparação de lactobacilos novos contendo antibióticos” fabricada no exemplo de fabricação 5 e terapia convencional. Os resultados são mostrados na tabela 45.

[Tabela 45] Resultados do tratamento para doença periodontal profunda usando terapia convencional Quando a inflamação era profunda, o intumescimento, cor, elasticidade, e outros sintomas da gengiva foram recuperados levemente com terapia convencional, mas as bolsas permaneceram virtualmente inalterada, e o status quo foi raramente mantido. Em contraste, quando a desinfecção com “este desinfectante bactericida” foi combinada com a “preparação de lactobacilos novos” da presente invenção, as gengivas começaram a melhorar após cerca de 2 semanas de terapia com diferenças individuais, e a saúde foi principalmente restaurada em cerca de 2 meses. As bolsas encolheram lentamente mas uniformemente, a alguns mm em cerca de 3 meses. Alguns pacientes permaneceram na mesma condição, enquanto em outros casos as bolsas eventualmente fecharam para uma cura completa. (Exemplo 25) Cinco pacientes sofrendo de doença periodontal em estágio final foram tratados por primeiro desinfecção das áreas afetadas com “este desinfectante bactericida” e então injetando a "preparação de lactobacilos novos” fabricada no exemplo de fabricação 4. Os resultados são mostrados na tabela 46.

[Tabela 46] Resultados do tratamento de doença periodontal em estágio final por uma combinação de desinfecção com "este desinfectante bactericida" e a "preparação de lactobacilo novo" da presente invenção ("preparação de lactobacilo novo" usada como preparação de lactobacilos) (Exemplo 26) Cinco pacientes sofrendo de doença periodontal em estágio final foram tratados por primeiro desinfecção das áreas afetadas com “este desinfectante bactericida” e então injetando a "preparação de lactobacilos novos contendo antibióticos” fabricada no exemplo de fabricação 5. Os resultados são mostrados na tabela 47.

[Tabela 47] Resultados do tratamento de doença periodontal em estágio final por uma combinação de desinfecção com "este desinfectante bactericida" e a "preparação de lactobacilo novo" da presente invenção ("preparação de lactobacilo novo contendo antibióticos" usada como preparação de lactobacilos) (Exemplo Comparativo 7) Cinco pacientes sofrendo de doença periodontal em estágio final foram tratados com uma regeneração de tecidos guiada usando Emdogain, que tem atraído interesse como uma terapia existente surpreendente. Os resultados são mostrados na tabela 48.

[Tabela 48] Resultados do tratamento para doença periodontal em estágio final usando regeneração de tecido guiada Quando a doença periodontal se encontra em estágio final, parece ser muito tarde para uma terapia convencional e, finalmente, os dentes precisam ser extraídos. Apesar dos dentes poderem ser suportados cirurgicamente sem serem extraídos, a doença então sofre uma re-ocorrência, e em muitos casos a extração é apenas retardada. Em contraste, com uma combinação deste “desinfectante bactericida” e a “preparação de lactobacilos novos” da presente invenção, foi possível eliminar os patógenos e remover os fatores causadores, produzindo um efeito sinergístico que levou a regeneração do tecido, de modo que em 70 a 80% dos casos, a extração foi desnecessária e os dentes foram salvos mesmo se uma cura completa não foi obtida. (Exemplo 27) Leitões Landrace de 2 meses de idade com um peso médio de 18 kg foram divididos em 3 grupos de 10 leitões machos e 10 fêmeas por grupo, e criados em gaiolas para suínos sem janelas, individuais, ventiladas por ventiladores. A alimentação foi uma ração padrão para suínos (Nosan Corporation), fornecida com ração sempre disponível no reservatório de ração, e água foi suprida automaticamente através de um recipiente. O grupo de controle recebeu ração preparada com Lactobacillus casei original (FERM BP- 6971) enquanto grupo de teste recebeu ração preparada com Lactobacillus casei da presente invenção fabricado no exemplo de fabricação 3 (FERM BP-10059, FERM P-19443), 1 x 106 células úmidas/ g de ração em cada caso, e não foram dados lactobacilos ao grupo não tratado. Após serem criados durante 1 mês sob estas condições de criação, como mostrado na tabela 49, os leitões no grupo de teste recebendo Lactobacillus casei da presente invenção, tinham um pêlo melhor do que os no grupo não tratado, e eram uma média de 4,8 kg mais pesadas, indicando um efeito promotor do crescimento óbvio. Não se notaram sinais de diarréia ou outros sintomas comuns em leitões, e eles não mostraram sinais de doença após o teste. Também se notou um menor odor fecal. Bons resultados também foram obtidos no grupo de controle, que foi tratado com a espécie de Lactobacillus casei original, mas em uma menor extensão que no grupo de teste. Em um teste de textura de carne por um especialista, a qualidade no grupo de teste foi avaliada como extremamente boa, com uma grande quantidade de carne vermelha e uma textura elástica.

[Tabela 49] Resultados da experiência de alimentação de leitões (Exemplo 28) 30 pintinhos de um dia machos e 30 fêmeas (peso médio 43 g) de uma variedade de frango especializada (Arbor Acre) foram pré-criados durante 3 dias e divididos em três grupos com números iguais de machos e fêmeas em cada grupo, e foi confirmado como não se tendo variação no peso do corpo com um peso médio de 50 g em cada grupo. Estes foram alimentados com uma ração padrão inicial para a engorda de frangos (Kyodo Shiryo, Golden G), durante 4 semanas. A criação foi em engradados até 4 semanas de idade (temperatura isolada 35 °C + 2 °C). O grupo de controle recebeu células liofilizadas da espécie de Lactobacillus casei original (FERM BP-6971) e o grupo de teste recebeu células liofilizadas da espécie de Lactobacillus casei da presente invenção fabricadas no exemplo de fabricação 3 (FERM BP-10059, FERM P-19443) misturadas com ração padrão a 2 x 107 células/g de ração em cada caso. O grupo não tratado não recebeu lactobacilos. Água foi suprida livremente através de um distribuidor, enquanto a ração foi suprida continuamente com ração sempre disponível no recipiente de ração. Os resultados são mostrados na tabela 30, e se mostra claramente que um resultado de criação durante 4 semanas, o grupo de controle demonstrou cerca de 15% e o grupo de teste cerca de 27% de ganho de peso maior do que o grupo não tratado. Não ocorreu doença no grupo de teste durante o período de criação, sem sintomas de diarréia e uma redução no odor fecal. Esta é outra evidência de que os efeitos de uma preparação de lactobacilos usando a espécie de Lactobacillus casei da presente invenção são bem melhores do que os de uma preparação de lactobacilos usando a espécie de Lactobacillus casei original.

[Tabela 50] Resultados de experiência de alimentação de frangos (Exemplo 29) Usando 4 cercados para peixes de tamanho de malha de rede pequena abrigando 100 cavalas juvenis com um peso médio de 65 g, três cercados de peixes foram designados a grupos de teste e 1 ao grupo não tratado. Os peixes receberam pelotas úmidas consistindo de uma mistura 1:1 de sardinhas cortadas e uma ração de fórmula comercial para olho-de-boi (Nisshin Feed, “Itomate”). No grupo de teste 1, a ração foi misturada a 1 x 109 células/g de ração com a espécie de Lactobacillus casei da presente invenção (FERM BP-10059, FERM P-19443) fabricada no exemplo de fabricação 2, e dada imediatamente. No grupo de teste 2, 0,02 ml/g de uma solução de cultura da mesma espécie de Lactobacillus casei (FERM BP-10059, FERM P-19443) da presente invenção fabricada no exemplo de fabricação 2 foi adicionado à ração. No grupo de teste 3,0,02 ml/g de filtrado de cultura da mesma espécie de Lactobacillus casei (FERM BP-10059, FERM P-19443) da presente invenção fabricada no exemplo de fabricação 2 foi adicionado à ração. A temperatura da água durante o período de teste foi de 20 °C a 22 °C. Os resultados são mostrados na tabela 51. Como se nota da tabela 51, a cavala nos grupos de teste cresceu melhor do que as no grupo não tratado, com uma menor mortalidade durante o período de teste. Dentre os grupos de teste, os resultados foram melhores para o grupo de teste 2, que recebeu uma solução de cultura da espécie de Lactobacillus casei da presente invenção.

[Tabela 51] Resultados de experiência de alimentação de cavala usando preparação de lactobacilos da presente invenção (Exemplo Comparativo 8) O mesmo teste que no exemplo 29 foi realizado usando a espécie de Lactobacillus casei original (FERM BP_6971) com os resultados mostrados na tabela 52. Como mostrado na tabela 52, os resultados não foram tão bons como os obtidos com a espécie de Lactobacillus casei da presente invenção.

[Tabela 52] Resultados de experiência de alimentação de cavala usando preparação de lactobacilos de espécie de Lactobacillus casei original (Exemplo 30) Uma experiência de alimentação foi realizada usando minhocas vermelhas, que são importantes como alimentação de pássaros e iscas para pescar. Quatro caixas de madeira de largura de 600 mm x 400 mm de diâmetro x 150 mm de altura foram preparadas e cheias a 80% com uma mistura de 1 kg de mofo de folhas misturadas com 0,5 kg de fermento de pão, após o que 100 minhocas juvenis com um comprimento médio de 10 mm e um peso médio de 40 mg foram colocadas em cada caixa. Estas foram criadas em uma sala em temperatura ambiente de 25 °C, com 10 lux de iluminação durante o dia e sem luz à noite. O grupo de teste 1 foi pulverizado com 0,01 g de corpos celulares úmidos de espécie de Lactobacillus casei da presente invenção (FERM BP-10059, FERM P-19443) fabricada no exemplo de fabricação 2, grupo de teste 2 foi pulverizado com 200 ml de uma solução de cultura de espécie de Lactobacillus casei da presente invenção (FERM BP-10059, FERM P-19443) fabricada em exemplo de fabricação 2 diluída 10 X com água, e grupo de teste 3 foi pulverizado com 200 ml de filtrado de cultura da espécie de Lactobacillus casei da presente invenção (FERM BP-10059, FERM P-19443) fabricado no exemplo de fabricação 2. Esta operação foi realizada uma vez a cada 10 dias, e o grupo não tratado foi pulverizado com água. Cada caixa de criação foi pulverizada com uma quantidade apropriada de água dia sim dia não de modo que o solo não ficasse seco. As minhocas receberam leveduras em pó e clorela como alimentação uma vez por semana, 1 g cada no começo da criação aumentando 20% a cada semana. Os resultados de criação após 3 meses são mostrados na tabela 53. Como mostrado na tabela 53, o rendimento foi melhor nos grupos de teste 1 e 2 do que no grupo não tratado, e pesos de corpo foram cerca de 20% maiores. Os resultados para grupo de teste 3 são intermediários.

[Tabela 53] Resultados de experiência de alimentação de minhoca vermelha Quando as experiências de alimentação também foram realizadas com besouros juvenis, bichos de seda e outros, assim como as minhocas vermelhas, os nos grupos de teste cresceram mais rápido e maiores. Além disso, os casulos e adultos também eram maiores. Bons resultados também foram obtidos quando os testes acima mencionados foram realizados usando a espécie de Lactobacillus casei original, mas as taxas de crescimento e rendimentos foram 5 a 10% menores do que com a espécie de Lactobacillus casei da presente invenção. (Exemplo 31) Pepinos foram usados para testar a prevenção e tratamento de míldio pulverulento e míldio penugento, que são problemas comuns no cultivo em estufa. Em doença de míldio pulverulento, o fimgo invade a superfície das folhas e talos, primeiro formando pontos brancos, mas à medida que os sintomas progridem, as superfícies das folhas parecem como salpicadas com um pó branco, gradualmente ficando cinza. O crescimento das folhas para, e no caso de pepinos somente pepinos pequenos, duros e finos são colhidos. Em doença de míldio penugento, pontos semelhantes a mofo branco acinzentado primeiro aparecem no lado de baixo das folhas, gradualmente formando marcas irregulares, sujas, que continuam a se espalhar sobre as superfícies das folhas. As folhas fmalmente se tomam amarelo-marrom e glutinosas e podres de modo que não se pode esperar uma colheita.

Uma seção de uma estufa para pepinos foi completamente dividida, e 1 g de células liofilizadas da espécie de Lactobacíllus casei da presente invenção (FERM BP-10059, FERM P-19443) fabricada no exemplo de fabricação 1 misturada com 1 litro de água (2 x 107 células /ml) foi pulverizado completamente sobre as folhas e os talos antes da florescência. Uma semana depois, os esporos de míldio pulverulento (Sphaeratheca fiiliginea) e míldio penugento (Pseudoperonospora cubensis ) foram aplicados em quantidades suficientes para provocar as doenças, mas em vez de ficarem doentes, as plantas floresceram e os pepinos resultante estavam simplesmente melhores do que o normal. As plantas de pepino às quais os esporos foram aplicados sem aplicação anterior do lactobacilos da presente invenção todas desenvolveram as doenças. Algumas plantas de pepino (10 a 20% no total) pulverizadas com os corpos de células liofilizadas obtidas da espécie de Lactobacíllus casei original (FERM-BP-6971) desenvolveram a doença e, neste caso, os pepinos não puderam ser coletados.

Quando as plantas de pepino infectadas como acima mencionado foram completamente pulverizadas no estágio anterior de infecção com uma solução (1 x 108 células/ml) de 5 g de células liofilizadas da espécie de Lactobacillus casei da presente invenção (FERM BP-10059, FERM P-19443) fabricada no exemplo de fabricação 1 colocadas em suspensão em 1 litro de água, e então pulverizadas com a mesma quantidade novamente uma semana depois, as lesões desapareceram gradualmente, e a florescência foi normal, e pepinos finos foram obtidos. Quando a espécie de Lactobacillus casei original (FERM BP-6971) foi aplicada do mesmo modo, cerca de 50% das plantas melhoraram, mas nas outras 50% as doenças progrediram e os pepinos não puderam ser colhidos.

Experiências similares foram realizadas usando culturas diferentes de pepinos incluindo batatas, pimentões, abóboras e outros, e em todos os casos a aplicação de células liofilizadas da espécie de Lactobacillus casei da presente invenção foi mostrada como sendo eficaz. Por exemplo, bons resultados foram obtidos quando a aplicação de produtos químicos agrícolas como 3% de tiofanato-metila (Nippon Soda, Topsin-M) e quinoxalina (Yashima Chemical Morestan) foi reduzida a 1/2 a 1/3, e uma quantidade apropriada de preparação de lactobacilos da presente invenção foi então aplicada. (Exemplo 32) Quatro locais de plantio de largura 600 mm x diâmetro 400 mm x altura 150 mm foram preparados, 20 g de fertilizante químico (NAC Co. # 38, N : 8%, P: 5%, K: 5%) e 5 g de fosfato de magnésio fundido foram misturados com a menor camada de solo em cada, e o solo consistindo de 10 g de cal de magnésio (NAC Co., melhorador de solo consistindo de 5 a 7% de óxido de magnésio misturado com cal extinta) adicionados a 10 L de uma mistura de solo de campo normal com 30% de mofo de folhas foram depositados no topo de uma profundidade de cerca de 80%. Em meados de agosto, 6 mudinhas de morango Aliso foram plantadas em cada local, e começando duas semanas até meados de dezembro, todas as plantas de morango no local do grupo de teste 1 receberam fertilizante líquido a cada semana e ao mesmo tempo foram pulverizadas completamente com células liofilizadas da espécie de Lactobacillus casei da presente invenção fabricada no exemplo de fabricação 1 (FERM BP-10059, FERM P-19443) colocada em suspensão 1 x 10 células/ml em água. Uma diluição de água de 200 x de líquido de cultura de espécie de Lactobacillus casei da presente invenção fabricada no exemplo de fabricação 1 (FERM BP-10059, FERM P-19443) foi aplicada ao grupo de teste 2. Uma diluição de água de 200 x de filtrado de cultura de espécie de Lactobacillus casei da presente invenção fabricada no exemplo de fabricação 1 (FERM BP-10059, FERM P-19443) foi aplicada ao grupo de teste 3. Água apenas foi aplicada ao local não tratado. Em março do ano seguinte, uma vez que os brotos tinham se desenvolvido, o fertilizante líquido e a preparação de lactobacilos acima mencionada foram aplicados durante uma semana. Morangos vermelhos, maduros, foram gradualmente colhidos em 1 a 2 meses após a florescência. Os resultados são mostrados na tabela 54. Como mostrado na tabela 54, os morangos nos grupos de teste 1 e 2, que receberam a preparação de lactobacilos da presente invenção, não somente cresceram mais rapidamente, mas 200 g de morangos foram coletados por planta. Além disso, verificou-se que todos eram de primeira qualidade em termos de cheiro, cor, gosto e tamanho. Em contraste, menos morangos foram colhidos no grupo não tratado, e eles eram de qualidade média, inferior aos morangos de alta qualidade nos grupos de teste.

[Tabela 54] Resultados de teste do cultivo de morango (Exemplo 33) Oito locais de plantio de 600 mm de largura x 400 mm de diâmetro e 150 mm de altura foram preparados, solo de campo normal foi misturado com 30% de mofo de folhas, e para os antóceros, 8 g de cal de magnésio (NAC Co., melhorador de solo consistindo de 5 a 7% de óxido de magnésio misturado com sal extinta) foram adicionados a 10 litros do mesmo, e 1 semana depois a camada inferior de solo em 3 locais de plantio foi fertilizada com 20 g de fertilizante químico (NAC Co. # 38, N: 8%, P: 5%, K: 5%). Para o espinafre, 20 g de cal de magnésio foram misturados bem com 20 g de fertilizante químico (NAC Co. # 38, N: 8%, P: 5%, K: 5%) e adicionado a três locais. As sementes foram então plantadas no final de setembro nos locais respectivos. Quando os antóceros e espinafre brotaram, eles foram afinados de modo que as folhas não se sobrepunham, e uma vez que as folhas principais começaram a se desenvolver, eles foram fertilizados uma vez por semana com fertilizante líquido e aguados de modo que o solo não ficou seco. Quando o fertilizante liquido foi aplicado, as plantas no grupo 1 foram pulverizadas no todo ao mesmo tempo com células liofilizadas de espécie de Lactobacillus casei da presente invenção (FERM BP-10059, FERM P-19443) fabricada no exemplo de fabricação 2, colocadas em suspensão 1x10 células /ml em água. As plantas no grupo de teste 2 foram pulverizadas do mesmo modo com uma diluição de 300x de um líquido de cultura da espécie de Lactobacillus casei da presente invenção (FERM BP-10059, FERM P-19443) fabricada no exemplo de fabricação 2. As plantas no grupo de teste 3 foram pulverizadas com diluição 300x de filtrado de cultura da espécie de Lactobacillus casei da presente invenção (FERM BP-10059, FERM P-19443) fabricada no exemplo de fabricação 2. Água sozinha foi pulverizada no grupo não tratado. Os resultados para antóceros são mostrados na tabela 55. Como mostrado na tabela 55, as plantas nos grupos de teste 1 e 2 que foram tratadas com a espécie de Lactobacillus casei da presente invenção cresceram rapidamente, com folhas largas, espessas e macias, e com um odor muito melhor do que os antóceros comerciais cultivados hidroponicamente. Os antóceros de qualidade intermediária foram colhidos do grupo de teste 3.

[Tabela55] Resultados do teste de crescimento de antóceros Os resultados para espinafre são mostrados na tabela 56. Como mostrado na tabela 56, nos grupos de tese as raízes eram mais vermelhas e mais firmes do que no grupo não tratado, e folhas de verde profundo, de alta qualidade, foram produzidas que eram grandes, espessas e brilhantes, emitindo um perfume singular. Algumas das plantas no grupo não tratado desenvolveram doença de pontos de folha (em que pontos de tom marrom aparecem nas folhas, mofo marrom escurecido se desenvolve sobre os pontos e as plantas murcham), mas isto não ocorre nos grupos de tratamento. Testes comparativos também foram realizados usando legumes como repolho, salsa e aipo, frutas como uvas e laranjas, Basidiomycetes como cogumelos, plantas ornamentais como pothos e flores como cravos, e em todos os casos uma cultura de maior qualidade foi colhida mais rapidamente do que no grupo não tratado, com uma ocorrência muito pequena de doença.

[Tabela 56] Resultados do teste de crescimento do espinafre (Exemplo 34) Mudas de hortelã-pimenta (com 6 folhas) foram adquiridas, solo de campo foi misturado com 50% de mofo de folhas, grupos de teste 1,2 e 3 e um grupo não tratado foi estabelecido como nos exemplos 15 e 16 acima, e a preparação de lactobacilos da presente invenção (FERM BP-10059, FERM P-19443) foi pulverizada uma vez por semana. As plantas foram fertilizadas separadamente uma vez por mês. Como resultado, a hortelã-pimenta nos grupos de teste 1,2 e 3 tinha folhas mais densas do que no grupo não tratado, com um cheiro forte, caracteristicamente doce. Os testes também foram realizados usando outras ervas incluindo camomila, salva, lavanda e erva-cidreira, mas os cheiros característicos das ervas pareceram mais fortes como no caso da hortelã-pimenta. Os testes acima mencionados com vegetais e ervas também foram realizados usando a espécie de Lactobacillus casei original (FERM BP-6971), que foi usada no pedido de patente JP acessível ao público No. 2001-333766, mas apesar dos resultados serem bons, na avaliação geral de rendimento, qualidade, cheiro, ocorrência de doenças e semelhantes, eles não se equiparam com os resultados obtidos da aplicação da espécie de Lactobaciiius casei da presente invenção (FERM BP-10059, FERM P-19443).

Sumário da Declaração da Viabilidade de Depósito do Mícrorganismo A espécie de Lactobaciiius casei FERM BP-10059 (FERM P-19443} foi depositada com International Patent Organism Depositary National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (Tsukuba Central 6, 1-1, Migashi 1-chome Tsukuba-shí, Ibaraki-ken 305-8566 Japan) em 22 de julho, 2003, sob a regra do tratado de Budapeste.

REIVINDICAÇÕES

Claims

1. Preparação de lactobacilos caracterizada pelo fato de consistir em uma espécie de Lactobacillus casei FERM BP-10059 (FERM P-19443) como um agente ativo primário e um antibiótico como segundo componente,

2, Agente preventivo ou terapêutico contra infecções em humanos, animais e plantas caracterizado por consistir em uma espécie de Lactobaciífus casei FERM BP-10059 (FERM P-19443) como um agente ativo primário e um antibiótico como segundo componente.