ES2332411T3 - Nuevo lactobacillus, preparacion de lactobacillus que activa un organismo vivo y agente preventivo o terapeutico contra la infeccion de un organismo vivo. - Google Patents

Abstract

Especie de Lactobacillus casei FERM BP-10059 (FERM P-19443).

Description

Nuevo Lactobacillus, preparación de Lactobacillus que activa un organismo vivo y agente preventivo o terapéutico contra la infección de un organismo vivo.

Campo técnico

La presente invención se refiere a una especie de Lactobacillus casei que tiene excelentes propiedades no suministradas por bacterias convencionalmente conocidas, a una preparación de lactobacilo que activa un organismo que tiene esta bacteria como componente principal que es extremadamente útil para restablecer, mantener y fomentar la salud y para mejorar el crecimiento y calidad de plantas y animales, y a una preparación de lactobacilo que es muy eficaz en prevenir y tratar infecciones de animales y plantas.

Antecedentes técnicos

Se produce una infección cuando bacterias invaden y se multiplican dentro de un organismo y el cuerpo muestra síntomas de enfermedad, y una vez que las bacterias empiezan a multiplicarse en el cuerpo, el cuerpo reacciona de varias maneras, y aparecen varios síntomas tales como enrojecimiento e hinchazón. El uso de fármacos tales como antibióticos es apropiado en este punto, y ayuda a curar la infección. Sin embargo, cuando es demasiado tarde para usar antibióticos, o cuando su uso es inapropiado, o cuando se interrumpe el uso en el curso de la terapia, o cuando no puede llegar suficiente fármaco a la infección, se previene la reducción o eliminación del patógeno y a la larga el tratamiento no tiene éxito en muchos casos. Además, recientemente han surgido problemas que afectan tanto a las bacterias como a sus huéspedes, complicando las circunstancias de modo que las infecciones duran más tiempo o son más graves y difíciles de tratar.

La primera victoria para los seres humanos en la guerra contra la enfermedad infecciosa se produjo a mediados del siglo veinte con la llegada de los antibióticos, empezando por la penicilina. De forma diferente a fármacos anteriores, este fármaco se saludó como una "bala mágica" por sus efectos espectaculares: parecía que se había conquistado la infección, y que el término "enfermedad infecciosa" pronto sería obsoleto. Sin embargo, las bacterias no se conquistan fácilmente, y el abuso de antibióticos condujo a la aparición y propagación de bacterias resistentes a fármacos. Tras sobrevivir y reagruparse, las bacterias vuelven a atacar. Las bacterias que han adquirido resistencia, han tenido éxito en transmitir esta resistencia a través de límites de especies mediante la conjugación de fragmentos especiales de ADN (genes de resistencia) denominados plásmidos R. Como resultado, la medicina parece estar realmente al borde de la derrota debido a la prevalencia y propagación de Staphyloccus aureus resistente a meticilina (SARM), una causa principal de las infecciones hospitalarias, y otras bacterias multirresistentes incluyendo Enterococcus resistente a vancomicina (ERV), Pseudomonas aeruginosa, Mycobacterium tuberculosis, Shigella flexneri y
similares.

Por ejemplo, se dice que el 80% de los adultos padecen periodontitis, en la que los tejidos circundantes que soportan los dientes incluyendo las encías, cemento, ligamentos periodontales, hueso alveolar y similares se inflaman y se destruyen gradualmente. Esto está producido por bacterias que preferentemente colonizan y forman la placa en el tejido periodontal, particularmente surcos en la parte cervical en límite entre los dientes y las encías. Las encías se inflaman localmente debido a las toxinas y enzimas producidas por estas bacterias, produciendo gingivitis, y según progresa esta se forman bolsas en las encías donde se acumula la placa, produciendo periodontitis. Según progresan los síntomas las bolsas se profundizan y ensanchan, la inflamación se extiende hacia y gradualmente destruye las raíces de los dientes, que antes o después se caen. Específicamente, en las fases iniciales de la periodontitis las encías de la parte cervical a la que se ha unido la placa enrojecen y se hinchan, perdiendo su elasticidad y sangrando durante el cepillado. Si esto se ignora, la placa crece gradualmente y forma sarro, extendiéndose a la parte cervical para formar bolsas periodontales. El sarro forma una barrera que previene el cepillado de la placa subyacente, de modo que las bacterias ganan fuerza y sus toxinas producen que las bolsas se hagan cada vez más grandes, y la inflamación se extiende desde las encías al ligamento periodontal y al hueso alveolar, produciendo hemorragia y pus con halitosis mientras que al mismo tiempo la infección se extiende uno por uno a los dientes circundantes. Si la inflamación de las bolsas se hace crónica, el hueso alveolar que soporta las raíces de los dientes empieza a disolverse desde la superficie, acompañado por edema de las encías, los dientes se tambalean y se notan sueltos porque no están adecuadamente apoyados, y se produce una fuerte halitosis junto con dolor cuando el paciente muerde con fuerza. Según progresa la enfermedad la mayoría del hueso alveolar se pierde, las raíces de los dientes se exponen, los dientes están más sueltos de modo que el paciente no puede comer alimentos duros, y finalmente los dientes se caen uno por uno. Por consiguiente, los expertos reconocen la periodontitis como un modelo clásico de una enfermedad infecciosa crónica que todavía es difícil de curar.

Otro problema tiene que ver con los fármacos mismos: los fármacos son extraños al cuerpo y producen efectos secundarios en mayor o menor grado, y los expertos señalan que cuanto más eficaz es el fármaco, mayores son los efectos secundarios. En general se dice que los efectos de los fármacos se reducen a la mitad y los efectos secundarios se duplican en las personas mayores -un hecho que no se puede ignorar considerando el envejecimiento de la sociedad. Tampoco se pueden ignorar las demandas cada vez más fuertes de seguridad y protección de la sociedad como un todo. Se siguen produciendo muertes accidentales por los efectos secundarios. Los antibióticos no son una excepción, de hecho producen una toxicidad en sangre mucho más fuerte que otros fármacos incluyendo la reacción alérgica llamada "choque de penicilina" así como leucopenia, anemia y similares, y se ha reconocido la pérdida resultante de potencia inmune en instituciones públicas. Puesto que los antibióticos son tan útiles, sin embargo, esto no ha sido un gran problema excepto en casos reales de enfermedad grave o muerte.

Los antibióticos tienen otro efecto secundario que no es inmediatamente obvio: atacan la flora intestinal, que algunas veces se denomina un órgano vital, produciendo sustitución microbiana. Es decir, la función inmune se deprime más por el efecto sinergístico de la toxicidad sanguínea combinada con un descenso en las bacterias intestinales beneficiosas que son muy sensibles a los antibióticos, fomentando infecciones crónicas y produciendo nuevas enfermedades víricas y otras infecciones. De hecho, las bacterias que producen infecciones crónicas típicas tales como periodontitis, sinusitis, hemorroides y similares son con frecuencia resistentes a antibióticos, y los efectos secundarios se acumulan mientras que el fármaco es ineficaz. Incluso sin resistencia, cuanto más se usa un antibiótico, mayor es el riesgo de mutación a cepas resistentes. A nivel individual, la exposición continua a las toxinas de bacterias patógenas puede ser fatal cuando se combina con un descenso en la función inmune, mientras que a nivel de sociedad las bacterias resistentes han cruzado las fronteras nacionales para producir daños no anticipados en todo el mundo.

Si se mira a los Estados Unidos y Europa, la idea de crear cuerpos que no enfermen más que tratarlos cuando enferman (medicina preventiva) ha estado vigente durante más de una década, y un medio eficaz para esto cuando se ha aceptado debido a su seguridad es "probióticos", que toma prestada ayuda de las bacterias beneficiosas.

La investigación en Lactobacillus se inició en Francia con Pasteur, el padre la de la microbiología moderna, produciendo la teoría de la "prolongación de la vida" del ruso Metchinikoff y muchas aplicaciones clínicas posteriores, pero todavía no se ha puesto en uso práctico real. Esto es debido a los resultados de estudios epidemiológicos no se han igualado con la investigación experimental. Recientemente, sin embargo, avances en bacteriología intestinal han mostrado que Lactobacillus tiene los siguientes papeles importantes.

(1) Normalización de la función inmune: Normaliza y aumenta la función inmune, que es indispensable para el mantenimiento de la vida.

(2) Limpieza intestinal: Equilibra la flora intestinal, suprime la proliferación de bacterias dañinas y suprime la fermentación y producción anormal de bacterias dañinas en los intestinos.

(3) Limpieza de la sangre: limpia la sangre como una extensión de la función de limpieza intestinal.

(4) Fomento de la utilización de alimento: Fomenta la síntesis de vitaminas y aminoácidos; ayuda a la absorción de nutrientes a través de las paredes intestinales.

(5) Prevención de infecciones por bacterias dañinas: previene la proliferación e infección en el intestino incluso si las bacterias dañinas invaden desde el exterior.

(6) Normalización celular: Fomenta la normalización de funciones celulares.

También en Japón, según envejece la sociedad y controlar los costes de salud se convierte en una preocupación nacional, se reconoce la importancia de la prevención de la enfermedad y la sociedad al completo se preocupa más por la salud. Como resultado, el número de productos que contienen Lactobacillus como un ingrediente aumenta constantemente, y se desarrollan cada vez más productos denominados "yogur funcional". Sin embargo, la verdad es que si estos productos se consumen de forma intermitente, los efectos tales como los mencionados en (1) a (6) anteriormente y otros efectos definitivos sobre la enfermedad serán muy escasos, mientras que la efectividad real contra la infección parecería ser la esperanza de un tonto.

En estas circunstancias, los inventores proponen que se use un bacilo del ácido láctico que tiene propiedades únicas, que los inventores aislaron y seleccionaron en mayo de 2000 contra infecciones con el fin de resolver las reacciones adversas a los antibióticos convencionales tales como bacterias resistentes a fármacos, alergias a fármacos, efectos secundarios y problemas que afectan a la flora bacteriana normal, y mandaron una solicitud de patente para una "Nueva bacteria del ácido láctico eficaz en enfermedades infecciosas y preparación de Lactobacillus que comprende una bacteria del ácido láctico como ingrediente principal" (Solicitud de patente japonesa accesible al público No. 2001-333766).

Esta solicitud se refiere a un bacilo del ácido láctico que es una especie de Lactobacillus casei que no sólo actúa para inhibir el crecimiento de bacterias patógenas sino que también produce "nuevas sustancias bioactivas" que tienen la propiedad de debilitar la toxicidad de bacterias patógenas, y a una preparación de Lactobacillus para infecciones agudas y crónicas que tiene esta bacteria como un componente principal. En detalle, de los Lactobacillus casei recogidos de la naturaleza se seleccionaron sólo aquellas cepas que producían un amplio espectro de antibiótico, y después se cribaron para mutaciones hemolíticas y S-R, con confirmación mediante ensayos en animales, para determinar si ese antibiótico debilitaba o no la toxicidad de bacterias patógenas, y por último se aplicaron a infecciones tres cepas de Lactobacillus casei que cumplían los criterios: FERM BP-6971, FERM BP-6972 y FERM BP-6973. A estas también se les dio resistencia a antibióticos ampliamente usados de modo que se podían usar en combinación con esos antibióticos. En casos de infecciones agudas tales como colitis aguda, cistitis aguda, bronquitis aguda y similares, se alcanzaron efectos de tratamiento más rápidos mediante el uso de estos Lactobacilli junto con la administración de antibióticos que los que se alcanzaron con antibióticos convencionales solos, incluyendo (i) dosis reducida de antibiótico, (ii) mejora más rápida de síntomas y recuperación más rápida con menos efectos secundarios y (iii) menos alteración de la flora intestinal, y se redujeron las reacciones adversas del fármaco. Sin embargo, llevó tiempo hasta que aparecieron los efectos y no se alcanzó una cura completa en el caso de infecciones crónicas tales como gingivitis, sinusitis, bronquitis y hemorroides.

Como se ha discutido anteriormente, la cuestión es hacer crecer un Lactobacillus casei capaz de colonizar y multiplicarse en las lesiones de una infección crónica que resiste el tratamiento, y de suministrar una acción de limpieza fuerte mientras se eliminan las bacterias causantes.

Divulgación de la invención

Como resultado de una investigación exhaustiva cuyo fin era resolver los problemas mencionados anteriormente, los inventores tuvieron éxito en alcanzar esta meta a partir de indicaciones obtenidas observando el sistema de limpieza vaginal, que mantiene un entorno limpio incluso cuando se expone constantemente a contaminación bacteriana.

La presente invención se define en las reivindicaciones.

Es decir, esta es una especie de Lactobacillus casei que tiene las propiedades descritas en (1), (2), (3), (4) y (5) a continuación, que es la especie de Lactobacillus casei FERM BP-10059 (FERM P-19443):

(1) La especie se puede hacer crecer en presencia de cualquiera de uno a cuatro aminoácidos como fuente de nitrógeno necesaria para el crecimiento;

(2) Cuando se inocula un medio de cultivo que fomenta el crecimiento con la especie y Escherichia coli en el mismo número y se somete a cultivo anaerobio mixto a 37ºC, el número final de lactobacilos es el 50% o más del número coliforme;

(3) Tras el cultivo en un medio de cultivo apropiado, el valor final de pH es 4,0 o menor, y la acidez máxima es del 1,5% o más;

(4) La especie es resistente a sales biliares al 5%;

(5) La especie produce un antibiótico.

En segundo lugar, la presente invención es una especie de Lactobacillus casei que tiene al menos una de las siguientes propiedades además de las propiedades enumeradas anteriormente, y esta especie de Lactobacillus casei es FERM BP-10059 (FERM P-19443):

(a) Tiene resistencia a antibióticos ampliamente usados;

(b) Tiene capacidad amilolítica;

(c) Fomenta el crecimiento de chlorella;

(d) Crece a temperaturas en el intervalo de 5ºC a 45ºC;

(e) Crece a valores de pH en el intervalo de pH 4,0 a pH 10,0;

(f) También puede crecer a cualquier presión de oxígeno.

En tercer lugar, la presente invención es una preparación de lactobacilo que activa un organismo que tiene la especie de Lactobacillus casei descrita anteriormente como ingrediente activo principal, en donde la especie de Lactobacillus casei anteriormente mencionada es FERM BP-10059 (FERM P-19443).

En cuarto lugar, la presente invención es un agente preventivo o terapéutico para una infección de un organismo que tiene la especie de Lactobacillus casei descrita anteriormente como un ingrediente primario principal, que preferiblemente contiene un antibiótico, y que preferiblemente se aplica a un área afectada en el tratamiento de periodontitis después de que el área afectada se haya desinfectado ya con un desinfectante bactericida, en donde dicho desinfectante bactericida contiene preferiblemente de 500 a 1.500 ppm de iones férricos, de 500 a 2.000 ppm de ácido L-ascórbico y de 200 a 2.000 ppm de uno o al menos dos de ácido sórbico, ácido benzoico y éster del ácido paraoxibenzoico como componentes principales, y dicha especie de Lactobacillus casei es FERM BP-10059 (FERM P-19443).

Actualmente, la sociedad en conjunto valora la seguridad y protección sobre todo lo demás, y en salud y medicina el concepto de "probióticos" ha tomado el centro del estrado en Occidente en particular. "Probióticos" se refiere al uso de bacterias y otros microorganismos que son organismos simbióticos que viven en los intestinos y son beneficiosos para el cuerpo, y a métodos de prevenir y tratar agresivamente enfermedades usando tales bacterias, especialmente el uso interno de lactobacilos incluyendo Lactobacillus bifidus y similares.

Los inventores en este caso hicieron uso rápidamente de esto para desarrollar la preparación de lactobacilo de la presente invención, que consiste en una especie de Lactobacillus casei a la que se han dado propiedades únicas. En la vanguardia de los probióticos, esta preparación no sólo tiene efectos muy claros en restaurar, mantener y fomentar la salud, sino que también ha tenido éxito en proporcionar efectos terapéuticos no proporcionados por productos convencionales del mismo tipo con respecto a casos crónicos de infección que son difíciles de tratar incluso por la medicina moderna. Además, debido a que el lactobacilo de la presente invención es resistente a antibióticos, se puede alcanzar un tratamiento más rápido en combinación con antibióticos. En este caso, la dosis mínima de antibiótico es suficiente, y se pueden reducir las varias reacciones adversas intrínsecas del fármaco tales como efectos secundarios y propagación de bacterias resistentes a fármacos. Además, en el contexto de aumentos en las enfermedades degenerativas de una sociedad envejecida y aumentos en infecciones crónicas debido al envejecimiento, junto con el inevitable aumento en los costes médicos, el papel de la preparación de lactobacilo de la presente invención como un medio de resolver estos problemas será cada vez más importante en el futuro.

Antes de la llegada de los antibióticos, se hicieron muy pocos esfuerzos en el mundo para tratar la periodontitis. También se pensaba que las bacterias dentro de las lesiones de la periodontitis eran una causa de enfermedad cardíaca y otras enfermedades mortales, y debido a este peligro percibido los dientes con caries malas o periodontitis se extraían sin vacilación. Debido a esta teoría la odontología consistía no en el tratamiento de la enfermedad sino en sacar dientes y hacer frente a los efectos de sacar los dientes mediante dentaduras postizas. Esta situación empezó a mejorar con la llegada de los antibióticos, y en la década de los ochenta la investigación en los patógenos de la periodontitis permitió que el progreso de la enfermedad entendiera mejor. Esto produjo la terapia fundamental de eliminar la placa y el sarro, con el resultado de que la inflamación bajó, las bolsas periodontales se hicieron menos profundas, los dientes sueltos se alinearon y no se movían más, y cuando eso no tenía éxito se hacía cirugía en las encías. De esta manera, se desarrollaron estrategias terapéuticas para conservar los dientes. Por otra parte, se reevaluó la intratabilidad de la periodontitis cuando se encontró que las bacterias escondidas en las encías forman estructuras colectivas y barreras especiales, que reducían los efectos farmacéuticos de los fármacos antibacterianos y bactericidas, y que también estaban implicados los hábitos del estilo de vida, afecciones sistémicas y factores genéticos del paciente en la aparición y evolución de la enfermedad. Tal vez por un sentido de inutilidad, ha habido poco progreso en la década pasada en el estudio básico y tratamiento de la periodontitis.

Con la llegada de una sociedad de vida larga, los expertos han divulgado gradualmente una asociación cercana entre los dientes y la salud física, dándose cuenta de que los dientes no solo sirven para una función de masticado sino que también son centrales a la vida misma, y la sociedad se ha dado cuenta que para prevenir la demencia, cáncer, ictus, enfermedad cardíaca y similares es importante tratar los dientes para sacar los poderes de curación naturales del cuerpo y potenciar las funciones sistémicas. Es decir, se ha dado cuenta de que los dientes son órganos irremplazables, y que por medio de los dientes es posible mejorar las funciones físicas y fisiológicas, prevenir el envejecimiento y mejorar la felicidad humana. La pérdida de dientes y la caries y el implante de dientes artificiales imperfectos para remplazarlos puede llevar a reacciones de estrés continuas y acumulativas en el cuerpo. Con el foco actual en los efectos secundarios y problemas de los fármacos, el desarrollo del agente preventivo y agente terapéutico seguro de la presente invención, que coloca poca carga física, psicológica o financiera sobre el médico o el paciente, contiene una gran promesa para revolucionar el tratamiento de la periodontitis, que con frecuencia se ridiculiza como tratamiento de "enjuagado", y está destinado a ser buenas noticias para la raza humana ya que el fin es una sociedad en la que sea natural mantener los propios dientes.

En lugar de los desinfectantes y antibióticos que se han usado ampliamente en el proceso de tratamiento, la preparación de lactobacilo de la presente invención, que tiene propiedades únicas y gran afinidad por membranas mucosas, en combinación con un desinfectante bactericida (USP 6296881B1) desarrollado por los inventores que es suave para las membranas mucosas pero que tiene efectos fuertes en bacterias patógenas, es un agente preventivo y un agente terapéutico excelente para periodontitis, capaz de efectuar una cura casi completa en casos de periodontitis desde las fases tempranas hasta las fases tardías independientemente de las habilidades técnicas del dentista mientras quede hueso alveolar para soportar al diente. Además, el agente terapéutico para periodontitis de la presente invención se puede administrar además de tratamientos convencionales para periodontitis.

Además, la administración de la preparación de lactobacilo de la presente invención puede fomentar el crecimiento animal durante la cría de cerdos, pollos, caballa, insectos y otros animales, contribuyendo a una calidad mejorada y prevención de enfermedades, y muestra efectos terapéuticos fuertes contra una variedad de enfermedades incluyendo infección por Saproglenia y enfermedad ulcerosa en peces de colores.

Además, se puede fomentar el crecimiento y la mayor calidad obtenida aplicando la preparación de lactobacilo de la presente invención a plantas incluyendo fresas, espinacas y otras verduras y plantas aromáticas. Además de prevenir la aparición de la enfermedad también es eficaz en el tratamiento de enfermedades vegetales tales como oídio y mildiu en pepinos.

La aparición de la preparación de lactobacilo de la presente invención lleva aire fresco en el concepto convencional fijo de tratamiento de infecciones con antibióticos o productos químicos agrícolas, y está llamado a contribuir mucho al reconocimiento y desarrollo futuro de "probióticos".

Los lactobacilos están ampliamente presentes en la naturaleza, desde los intestinos, cavidad bucal y otras partes del organismo hasta hojas de árboles, hierba, plantas cultivadas, frutos, tierra y aguas residuales, y se encuentran abundantemente en todos los sitios de actividad viviente. Como resultado, se han usado por rutina en el procesamiento y conservación de alimentos desde tiempos remotos cuando la gente no era consciente de su existencia, mientras que hoy en día el papel de los lactobacilos se aprecia desde una perspectiva científica y han ganado atención como probióticos.

Los inventores han ido un paso más allá para desarrollar un lactobacilo que tiene gran afinidad por el organismo y excelentes capacidades de limpieza que no estaban hasta ahora disponibles. Se ha mostrado que esta bacteria no sólo es eficaz en prevenir y tratar enfermedades, sino que también contribuye en gran manera a mejorar el crecimiento y calidad de animales y plantas. Por lo tanto, se piensa que su aplicabilidad industrial se extienda no sólo a la industria primaria sino también a la industria de la salud como un total en el sentido general y a la industria cosmética como una extensión de la industria de la salud, y se puede usar y aplicar ampliamente en la industria alimentaria o en general en todos los ambientes requeridos para la vida humana.

Breve descripción de las figuras

La figura 1 muestra la regeneración de piel de ratón después de la separación.

La figura 2 muestra la proliferación de la cepa de células de riñón de mono V-1.

La figura 3 muestra la proliferación de la cepa de células de mastocitoma de ratón P815.

La figura 4 muestra la proliferación de linfocitos de ratón CEA.

La figura 5 muestra la proliferación de chlorella.

Mejor manera para llevar a cabo la invención

La especie de Lactobacillus casei de la presente invención puede estar en forma de cuerpos celulares obtenidos mediante cultivo, un cultivo líquido o un filtrado de cultivo descontaminado, mientras que la preparación que contiene un nuevo Lactobacillus casei puede ser una preparación que contenga sólo el Lactobacillus casei de la presente invención o una preparación que contenga el Lactobacillus casei de la presente invención junto con un antibiótico.

La especie de Lactobacillus casei de la presente invención se desarrolló con referencia a la existencia de lactobacilos normalmente presentes en la vagina. Es decir, el bacilo de Doderlein, que normalmente está presente en la vagina, rompe el glicógeno que exuda de las paredes vaginales, produciendo ácido láctico que mantiene la acidez y previene la proliferación de bacterias putrefactivas que invaden desde el exterior, y de esta manera desempeña un papel vital en el mantenimiento de la limpieza. Esta bacteria es muy similar a Lactobacillus acidophilus, y cuando se suprime su crecimiento mediante antibióticos o similares se sabe que levaduras y otras bacterias proliferan y pueden causar varias inflamaciones. Es decir, se construye un sistema de prevención de infección el pilar principal del cual es un lactobacilo que se puede establecer y proliferar con una pequeña cantidad de nutrición en la vagina. Este sistema de limpieza parece ser uno básico y normal considerando que las intratables hemorroides se curan de forma natural si la flora intestinal llega a consistir principalmente en bacterias beneficiosas.

Basado en estos descubrimientos, los inventores perfeccionaron la presente invención recogiendo tantas ayudas digestivas con lactobacilo y productos comerciales de lactobacilo como fue posible y estudiando las cepas en ellos, cuando descubrieron que sólo aquellas cepas bacterianas que cumplen ciertas condiciones tenían el 100% de sus capacidades originales evidentes o latentes y podrían activar fundamentalmente los organismos de animales y plantas, con efectos económicos sobre su crecimiento y calidad, así como aumentar el sistema inmune (la capacidad natural de curación) contra enfermedades mientras que al mismo tiempo excluían firmemente las bacterias causales en casos de infección.

De las condiciones que debe cumplir el Lactobacillus casei de la presente invención, la primera condición esencial es que (1) la demanda de nutrientes sea mucho menor que la de Lactobacillus casei convencionales conocidos. Es decir, esto significa que la especie se puede hacer crecer en presencia de cualquiera de uno, dos, tres o cuatro aminoácidos como fuente nutriente de nitrógeno. (2) La proliferación es rápida en el entorno de crecimiento. Esto significa que cuando se inocula un medio de cultivo que fomenta el crecimiento con la especie y Escherichia coli en la misma cantidad y se somete a cultivo anaerobio mixto a 37ºC, el número final de lactobacilos es el 50% o más del número coliforme. (3) La capacidad de producción de ácido láctico es alta. Esto significa que tras el cultivo en un medio de cultivo adecuado, el valor final de pH es 4,0 o menos, y la acidez máxima es del 1,5% o más. (4) La especie tiene gran resistencia a ácidos biliares. Esto significa que la especie es resistente a sales biliares al 5%. (5) La especie produce un antibiótico y puede inhibir la proliferación de otras bacterias.

Más preferiblemente, la especie (a) tiene resistencia a antibióticos ampliamente usados; (b) tiene capacidad amilolítica; (c) fomenta el crecimiento de chlorella, (d) tiene un amplio intervalo de temperaturas de crecimiento (crece a temperaturas en el intervalo de 5ºC a 45ºC); (e) tiene un amplio intervalo de valores de pH de crecimiento (crece a valores de pH en el intervalo de pH 4,0 a pH 10,0) y (f) tiene un intervalo amplio de presión de oxígeno a la que puede crecer (es decir, puede crecer a cualquier presión de oxígeno).

Por lo tanto, los inventores aclimataron las especies de Lactobacillus casei FERM BP-6971, FERM BP 6972 y FERM BP-6973 (en adelante, especie original de Lactobacillus casei), para la que ya se ha enviado una solicitud de patente, y después de muchos esfuerzos dedicados a conferir las propiedades anteriormente mencionadas, tuvieron éxito en producir una cepa bacteriana que cumple las condiciones de la presente invención a partir de FERM BP-6971 mediante el proceso descrito a continuación.

Para tener un efecto en un organismo, una bacteria se debe adaptar a su ambiente, prevalecer en la competición de crecimiento con bacterias patógenas y reproducirse adecuadamente. Una condición necesaria para esto es la producción de un antibiótico que suprima el crecimiento de otras bacterias, y antes que eso el potencial básico o en otras palabras la potencia de proliferación de la bacteria debe ser fuerte. En general, los lactobacilos tienen grandes demandas de nutrientes, y por ejemplo el medio MRS ampliamente usado para el crecimiento de bacterias está compuesto de 10 g de extracto de carne, 5 g de extracto de levadura, 10 g de peptona, 0,2 g de MgSO_{4}\cdot7H_{2}O, 0,5 g de MnSO_{4}\cdot5H_{2}O, 5 g de acetato de sodio, 2 g de citrato de diamonio, 2 g de KH_{2}PO_{4} y 20 g de glucosa por litro. El Lactobacillus casei de la presente invención no es una excepción, pero puesto que es un Lactobacillus casei aislado de la naturaleza sus demandas naturales de nutriente son moderadas, y puede proliferar con concentraciones apropiadas de aminoácidos, vitaminas, azúcares utilizables y sales inorgánicas, tales como por ejemplo un medio que consista en medio S-W más 1 g de casaminoácidos y 0,1 g de vitaminas. El medio S-W contiene 1 g de KH_{2}PO_{4}, 0,7 g de MgSO_{4}\cdot7H_{2}O, 1 g de NaCl, 4 g de (NH_{4})_{2}PO_{4}, 0,03 g de FeSO_{4}\cdot7H_{2}O y 5 g de glucosa por litro. Se preparó medio de placa con esta composición, y se aplicó a la misma la especie original de Lactobacillus casei dispersada en solución esterilizada de cloruro de sodio y se cultivó de forma anaerobia durante 48 a 72 horas a 37ºC. Se seleccionaron las colonias resultantes más grandes, se recogieron y se cultivaron de nuevo mediante el mismo procedimiento anterior, y se repitió la misma operación de seleccionar y recoger las colonias cuando crecían para obtener la cepa con el crecimiento y proliferación más rápidos en esta composición de medio. A continuación, se seleccionó una cepa con buen crecimiento en el medio, después de lo cual se identificaron colonias que crecían en medio con la concentración de nutriente gradualmente reducida a 1/4, 1/8 y 1/16 para obtener una cepa con la capacidad de crecer y proliferar rápidamente en entornos de nutrición extremadamente baja.

Los Lactobacillus casei convencionales conocidos incluyendo la especie original de Lactobacillus casei requieren una variedad de aminoácidos como fuentes de nitrógeno para el crecimiento, pero la especie de Lactobacillus casei de la presente invención puede crecer con cualquier aminoácido o con 2, 3 ó 4 aminoácidos como fuente de nitrógeno. Un ejemplo serían sales inorgánicas más azúcar más vitaminas más clorhidrato de L(+)-lisina más ácido L-glutámico. Cuando se hizo crecer junto con Escherichia coli, una bacteria que como Lactobacillus casei es una bacteria familiar que crece en cualquier lugar en la naturaleza y que es conocida como una especie indicadora de contaminación medioambiental, la especie de Lactobacillus casei de la presente invención no era inferior a Escherichia coli en términos de extensión y velocidad de crecimiento en las fases iniciales y medias, y el recuento final de lactobacilos fue del 50% o más del recuento coliforme. Cuando esta relación de las bacterias es del 30% o menos, una cepa bacteriana puede tener poco efecto en un organismo por muy importantes que sean sus capacidades.

A continuación, otra propiedad importante necesaria para prevalecer en la competición de crecimiento con otras bacterias es la capacidad de suprimir el crecimiento de otras bacterias en un entorno de pH reducido. Esto significa una cepa bacteriana con una fuerte capacidad de producción de ácido láctico. En particular, el ácido láctico producido en el aparato digestivo protege el cuerpo de la invasión y proliferación de varias bacterias patógenas del exterior, y secundariamente induce el peristaltismo en los intestinos, fomentando la excreción de productos de desecho de los intestinos y suprimiendo la producción de productos de putrefacción. Se ha mostrado experimentalmente que un pH final de 4,0 o menos y una acidez máxima del 1,5% o más es una condición importante para aumentar las funciones de los lactobacilos. Sin embargo, en el caso del Lactobacillus casei más conocido el pH final no alcanza 4,2 o menos y la acidez máxima es menor del 1,5%. Un ejemplo de un método de crecimiento para aumentar la productividad de ácido láctico es cultivar las bacterias de forma anaerobia durante 48 a 72 horas a 37ºC en un medio opaco que consiste en 3 g de CaCO_{3} añadido al medio descrito anteriormente que contiene 10 g de extracto de carne, 5 g de extracto de levadura, 10 g de peptona, 0,2 g de MgSO_{4}\cdot7H_{2}O, 0,5 g de MnSO_{4}\cdot5H_{2}O, 5 g de acetato de sodio, 2 g de citrato de diamonio, 2 g de KH_{2}PO_{4} y 20 g de glucosa por litro, unir las colonias, y seleccionar repetidamente aquellas con los anillos transparentes más anchos alrededor. Esto hace uso del hecho de que cuando se produce ácido láctico el carbonato de calcio opaco se une al ácido láctico y cambia a lactato de calcio.

El aparato digestivo está unido al exterior a través de un único tubo, y una razón por la que las bacterias que viven en el duro ambiente del mundo exterior no se establecen y proliferan en el ambiento rico en nutrientes y suave de los intestinos tiene que ver con la presencia de ácidos biliares secretados por la vesícula biliar. Por consiguiente, la mayoría de los medios de aislamiento y selección para bacterias intestinales tienen ácidos biliares añadidos a la composición para suprimir el crecimiento de otras bacterias. Según los descubrimientos de los inventores, cuando la concentración de ácidos biliares tales como desoxicolato de sodio alcanza el 0,1%, las bacterias intestinales siguen creciendo pero la mayoría de las bacterias que no viven en el intestino no crecen. La especie original de Lactobacillus casei fue capaz de crecer hasta una concentración de ácido biliar del 0,2%, pero la conclusión se alcanzó parcialmente por las siguientes razones de que la actividad en el cuerpo requería crecimiento a una concentración de ácido biliar del 0,5%. Por consiguiente, se hizo crecer una cepa bacteriana mediante un método común de resistencia a sales biliares. Es decir, se empezó añadiendo ácidos biliares al 0,2% a un medio de alto contenido nutriente tal como el medio de selección de ácido láctico LBS y el medio de proliferación MRS, y se aumentó la concentración de ácido biliar en pasos hasta el 0,5% según crecían las bacterias. Una vez que se ha obtenido una cepa resistente, se mostró que mantenía su resistencia independientemente del tipo de medio, y también se mostró por primera vez en estos experimentos que la resistencia a ácidos biliares se correlaciona con afinidad por membrana mucosa. Es decir, según aumenta la resistencia a ácidos biliares o en otras palabras según aumenta la afinidad por ácidos biliares las bacterias se vuelven cada vez más capaces de colonizar membranas mucosas fuera de los intestinos, tales como la cavidad bucal, la membrana mucosa nasal, la vagina y similares.

La capacidad de producir antibióticos que impida la supervivencia de otras bacterias también es importante. El Lactobacillus casei original produce un antibiótico de amplio espectro que no sólo impide el crecimiento de otras bacterias sino que también se ha descrito que debilita la toxicidad de bacterias patógenas, y el Lactobacillus casei de la presente invención retiene esta capacidad. Además, el Lactobacillus casei de la presente invención necesita ser resistente a antibióticos ampliamente usados, pero el Lactobacillus casei original es resistente a antibióticos, y el Lactobacillus casei de la presente invención retiene esta capacidad.

La capacidad de usar almidones abundantemente presentes en todo el mundo natural como fuentes de energía es deseable para la colonización, supervivencia y proliferación en organismos. Sin embargo, la mayoría de los Lactobacillus casei no son amilolíticos, o sólo lo son ligeramente. La especie original de Lactobacillus casei no es una excepción y carece de capacidad amilolítica, pero mediante el proceso de aclimatación fue posible conferir una alta capacidad amilolítica sin afectar la capacidad de romper glucosa y lactosa, produciendo el Lactobacillus casei de la presente invención. Un ejemplo de un método de crecimiento para aumentar la capacidad amilolítica es añadir 4,5 g de glucosa y 0,5 g de almidón (almidón el 10% de azúcares) a un medio nutriente de medio a bajo con un pH de 7,4 que consiste en 1 g de extracto de carne, 1 g de extracto de levadura, 3 g de peptona, 1 g de NaCl, 0,5 g de K_{2}HPO_{4}, 0,5 g de MgSO_{4}\cdot7H_{2}O, 0,05 g de MnSO_{4}\cdot5H_{2}O, 5 g de acetato de sodio, 1 g de acetato de sodio, 0,5 g de citrato de diamonio y 12 ml de BTB al 0,2% por litro, y después cultivar de forma anaerobia durante 48 horas a 37ºC. Se repite después el subcultivo en medio de la misma composición, e incluso si se confirma algo de amilolisis el porcentaje de almidón se aumenta al 20%. De esta manera, el porcentaje de almidón de los azúcares se aumenta hasta el 100% según se repite el subcultivo, y se adquiere rápidamente la capacidad de romper almidón de la misma manera que para glucosa. En cualquier medio, el pH disminuye según se rompen los azúcares para producir ácidos, y el color del medio cambia de azul a amarillo. Es importante seguir subcultivando hasta que la intensidad del amarillo del medio con almidón añadido es la misma que con glucosa al 100%. Afortunadamente, la mayoría de las bacterias que producen infecciones crónicas son incapaces de obtener energía de la rotura del almidón, por lo tanto dar a la especie de Lactobacillus casei esta capacidad es particularmente eficaz como medida contra infecciones.

Chlorella es una planta unicelular con gran vitalidad que ha continuado realizando fotosíntesis y produciendo generaciones mediante divisiones celulares repetidas durante más de mil millones de años en este planeta, y se ve como el ancestro de varias plantas vivas. Es decir, se puede decir que chlorella es la forma y fuente original de vida en la tierra. Si un lactobacilo fomenta el crecimiento y proliferación de chlorella, significa que las sustancias producidas por este lactobacilo activan y tienen un efecto regenerador en células vivas, de modo que también deberían ser eficaces para organismos que son acumulaciones de células. Se ha sabido durante décadas que los productos metabólicos de chlorella fomentan la proliferación de lactobacilos, pero hasta ahora no se ha descrito que al contrario, los productos metabólicos de lactobacilos estimulen la proliferación de chlorella. Por consiguiente, como ejemplo de un método de crecimiento para aumentar la capacidad de fomentar el crecimiento de chlorella, un medio con un pH de 6,8 que consistía en 5 g de peptona, 2 g de extracto de carne, 5 g de glucosa, 5 g de extracto de levadura, 3 g de KNO_{3}, 2 g de K_{2}HPO_{4}, 0,1 g de MgSO_{4}\cdot7H_{2}O, 0,1 g de CaCl_{2}\cdot2H_{2}O, 0,1 g de NaCl, 0,01 g de MnSO_{4}\cdot5H_{2}O, 0,05 g de ZnSO_{4}\cdot5H_{2}O, 3 g de CaCO_{3} y 15 g de agar por litro se esterilizó a alta presión durante 15 minutos a 120ºC y se enfrió a aproximadamente 50ºC después de la esterilización, se añadió una cantidad adecuada de chlorella cultivada pura y se mezcló uniformemente, y la mezcla se echó en placas Petri. Después de 48 a 72 horas de precultivo en un incubador iluminado a 28ºC, la especie original de Lactobacillus casei dispersada en solución salina esterilizada se aplicó al medio y se subcultivó de forma aerobia y anaerobia (un % pequeño de CO_{2}) de 28ºC a 32ºC con luz. Este se observó cada 24 horas para determinar si la chlorella alrededor de la colonias proliferativas de Lactobacillus casei proliferaban más densamente que en otras áreas. Las colonias que mostraban incluso la más ligera de tal tendencia se recogieron repetidamente para preparar la especie de Lactobacillus casei de la presente invención que fomenta el crecimiento de chlorella.

También es una condición deseable un intervalo amplio de posibles presiones de oxígeno, temperaturas y valores de pH para el crecimiento para adaptarse y competir con éxito en ambientes duros, y esto se puede alcanzar mediante un método normal de aclimatación con la selección de un medio apropiado.

Las diferencias entre Lactobacillus casei conocidos, convencionales, la especie original de Lactobacillus casei y la especie de Lactobacillus casei de la presente invención se muestran en la tabla 1. Como se muestra en la tabla 1, debido a que la especie de Lactobacillus casei de la presente invención que se cribó mediante selección y aclimatación tiene propiedades únicas que no están presentes en Lactobacillus casei conocidos o en la especie original de Lactobacillus casei, cuando se uso en un organismo la especie de Lactobacillus casei de la presente invención puede no sólo proporcionar efectos drásticos que no se obtienen de los varios productos de ácido láctico empujándose en las estanterías de alimentos y estanterías de alimentos naturales, sino que puede actuar bastante claramente para restablecer, mantener e incrementar la salud y producir efectos económicos tales como mejora de la calidad y similares cuando se usa en plantas y animales, y puede ser bastante eficaz contra infecciones. La preparación de lactobacilo de la presente invención se puede llamar de esta manera una preparación de lactobacilo que activa un organismo o un agente preventivo o terapéutico contra la infección en animales y plantas.

TABLA 1 Comparación de las propiedades de diferentes especies de Lactobacillus casei

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Se dice que la placa que es la causa de la periodontitis es una acumulación de alrededor de 400 tipos de bacterias, de las cuales se ha mostrado que las más patógenas para la periodontitis son Poryphyromonas gingivalis, Prevotella intermedia y Actinobacillus actinomycetemcomitans, estando implicadas Walinella recta, Bacteroides forsythus, Eikenella corrodens, Fusobacteria, Treponema y similares como auxiliares. La especificidad de la periodontitis es el mayor factor que hace difícil curar esta enfermedad. Debido a que los dientes están directamente unidos al interior del cuerpo, cuando una reacción inflamatoria es grave el cuerpo no trata de curar la periodontitis sino que en su lugar forma surcos profundos en los límites entre los dientes y las encías, destruyendo el tejido que soporta los dientes y sacrificando los dientes para proteger el cuerpo como un lagarto que vive con la cola cortada. En otras palabras, no es un enemigo externo el que destruye el tejido que soporta los dientes sino la inflamación misma, que es un medio de proteger el cuerpo del enemigo externo. El cuerpo no reconoce como propias las raíces de los dientes que se han contaminado y han sido penetradas por las toxinas y enzimas bacterianas, que actúa para excluirlas como factores causantes junto con el tejido circundante. Es decir, una reacción curativa realmente exacerba la periodontitis. Por consiguiente, una vez que se caen todos los dientes afectados con periodontitis, la enfermedad se cura completamente.

Otros factores incluyen (1) el hecho que la cavidad bucal es un medio adecuado para el crecimiento y proliferación de bacterias, y es difícil de mantener limpia, y las bacterias con fuerte patogenicidad periodontal en particular se adhieren con fuerza a los dientes y encías produciendo glucanos pegajosos, fructanos y otros polisacáridos insolubles, sustancias que también sirven para proteger a los patógenos periodontales, (2) el hecho de que puesto que las toxinas y enzimas que producen penetran discretamente en el tejido periodontal, la enfermedad progresa con pocos síntomas subjetivos, y la aparición de síntomas no es uniforme pero implica una variedad de factores que incluyen suciedad alrededor de los dientes, inflamación, retracción de las encías, envejecimiento y similares, mientras que una vez que las bolsas de las encías se han formado generalmente no se cierran lo que en combinación con (1) anterior produce la reaparición repetida, (3) el hecho de que pocos dentistas emprendan terapia usando fármacos adecuados en cooperación con especialistas en bacteriología, (4) el hecho de que tanto médicos como pacientes asumen que en el peor caso los dientes se pueden sacar y (5) el hecho de que la periodontitis no es un problema local sino una enfermedad sistémica que con frecuencia implica por ejemplo diabetes y otros trastornos endocrinos, trastornos genéticos, estrés, osteoporosis, trastornos circulatorios y similares, y no se puede curar completamente simplemente mediante terapia sintomática. La periodontitis implica muchos factores perjudiciales, y se considera incurable a menos que el tratamiento se empiece en fases tempranas.

Actualmente, la forma principal de terapia temprana es un tratamiento tal como raspado y alisado radicular para eliminar la placa y el sarro, que son los semilleros de la periodontitis. El sarro supragingival que se adhiere a las superficies de los dientes por encima de la línea de las encías es relativamente fácil de eliminar, pero el sarro subgingival que se adhiere a las superficies (raíces) de los dientes por debajo de la línea de las encías es denso y duro, de color negruzco-verde y muy adherente, y las bacterias y sus toxinas no se pueden eliminar fácilmente simplemente mediante cepillado. Por consiguiente, recientemente se han adoptado métodos de destruirlo de forma eficaz con ultrasonido o láser o disolviéndolo con productos químicos especiales. Después de eso, se inyecta un desinfectante o antibiótico y se fija en la bolsa periodontal hasta que la inflamación se cura. Sin embargo, cuando el sitio de inflamación es profundo y la terapia mencionada anteriormente no produce resultados favorables, el sitio de inflamación o daño se elimina mediante cirugía. Posteriormente, las encías se cosen o reconstruyen con material artificial. Las técnicas más recientes incluyen cirugía según métodos GTR (regeneración guiada de tejidos) y aplicación de un tipo de proteína llamada Emdogain como auxiliar a la cirugía para recrear un entorno similar al proceso de regeneración del diente y estimular la regeneración del tejido periodontal, pero estos no son eficaces contra todos los casos avanzados de periodontitis, y su aplicación es limitada. En cualquier caso, actualmente el tratamiento básico para la periodontitis tiene como fin controlar la inflamación de las encías, detener el progreso de la periodontitis, regenerar el tejido periodontal perdido, mejorar la apariencia externa y mantener el tejido recién recuperado, pero como se ha mencionado anteriormente la periodontitis también implica factores de riesgo sistémicos, y por desgracia en la actualidad no hay terapia que sea lo suficientemente eficaz para ser favorita, y muchos dentistas están contentos si pueden evitar que la situación empeore.

El desinfectante bactericida discutido en la presente invención (en adelante, "este desinfectante bactericida") es un desinfectante bactericida que contiene de 500 ppm a 1.500 ppm de iones férricos, de 500 ppm a 2.000 ppm de ácido L-ascórbico y de 200 ppm a 2.000 ppm de uno o dos de ácido sórbico, ácido benzoico o éster del ácido paraoxibenzoico como componentes principales. Ya se ha concedido una patente de EE.UU. (USP6296881B1), y sus componentes se reconocen en Japón como aditivos alimentarios. En la actualidad, los desinfectantes ampliamente usados por las instituciones médicas incluyen alcoholes, fenoles, compuestos halógenos, sales de amonio cuaternario, compuestos de biguanida, aldehídos y similares, pero ninguno cumple todas las condiciones de acción bactericida excelente, seguridad y baja toxicidad, mantenibilidad excelente y bajo precio. Por ejemplo, el compuesto de biguanida que tiene el nombre comercial de "Hibitane" es un desinfectante excelente cuya baja toxicidad y alta eficacia han hecho de él un superventas en el mundo durante décadas, pero tiene poco efecto sobre hongos y ningún efecto sobre bacilos tuberculares y esporas, Algunas bacterias comunes también han desarrollado resistencia, y son la causa de infecciones hospitalarias. Por otra parte, "este desinfectante bactericida", que se desarrolló para llenar en los huecos del tratamiento convencional, mata la mayoría de bacterias y hongos en sólo 10 segundos, y es capaz de destruir incluso esporas en 1 a 120 minutos. A pesar de sus excelentes propiedades bactericidas, sin embargo, su toxicidad es menor que la de cualquier otro desinfectante existente como se muestra a continuación.

(1) Efectos en la piel: No aparecieron anormalidades de la aplicación a la pata trasera (almohadillas de los pies) de ratones dos veces al día durante 6 meses.

(2) Efectos de la administración oral: se administró 1 ml/ratón pero no se observó toxicidad. Esta dosis corresponde a 1,8 L para un ser humano. La DL_{50} estimada es 10 ml/ratón, que corresponde a 18 L para un ser humano.

(3) Efectos de la administración intraperitoneal: La DL_{50} es alrededor de 1 ml/ratón.

(4) Efectos en células (animales) cultivadas: una dilución de 10^{3} veces de la concentración para uso no inhibió la proliferación celular. Esto es alrededor de 1/10 la toxicidad de Hibitane.

(5) Efectos en seres humanos:

a)

Desinfección de mano y dedo: No se observaron anormalidades incluso después de 7 años de uso diario, aparte de un ligero enrojecimiento de la piel.

b)

Gargarismo: No se observaron anormalidades de las membranas mucosas después de 7 años de hacer gárgaras cada mañana y noche, y no aparecieron efectos secundarios o toxicidad. Además, no se produjeron caries durante ese periodo y no fue necesario consultar al dentista.

Los siguientes son resultados de varios ensayos de "este desinfectante bactericida" en relación con periodontitis.

Se preparó "este desinfectante bactericida" preparando una solución acuosa de 3.000 ppm de cloruro férrico hexahidrato (FeCl_{3}\cdot6H_{2}O) como Fe^{3+}, una solución acuosa de ácido L-ascórbico con una concentración de 3.000 ppm y una solución acuosa de sorbato de potasio con una concentración de 1.500 ppm, y mezclando cantidades iguales de estas soluciones acuosas.

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Ejemplo de ensayo 1

Se preparó una suspensión (1 x 10^{9} células/ml de solución salina) de la bacteria de prueba, se dejó gotear un 2% en peso de "este desinfectante bactericida" en este líquido celular. Las células se recogieron a lo largo del tiempo con un aro de platino, se sembraron en medio de crecimiento de bacterias y se cultivaron en un ambiente óptimo, y se observaron los efectos bactericidas según la presencia o ausencia de proliferación bacteriana. El desinfectante bactericida usado en el ensayo se ajustó a la concentración normalmente usada. Se muestran los resultados después de 10 a 60 segundos de contacto y los resultados después de 1 a 120 minutos de contacto en la tabla 2. Como está claro a partir de la tabla 2, "este desinfectante bactericida" mató la mayoría de las especies bacterianas en sus formas activas en alrededor de 10 segundos. Los patógenos periodontales fuertes P. gingivalis, P. intermedia y A. actinomycetemconitans no fueron una excepción. Sin embargo, tardó de 1 a 120 minutos para matar las esporas de las bacterias esporulantes dependiendo de la fase de formación. Según la estadística, el tiempo que tardan en lavarse las manos y hacer gárgaras trabajadores médicos y otros es de 10 a 15 segundos, y en este contexto "este desinfectante bactericida" es muy eficaz. Cuando se realizó el mismo ensayo usando el compuesto de biguanida Hibitane, solución de peróxido de hidrógeno al 3% y etacridina, que son desinfectante ampliamente usados en hospitales y consultas de dentistas, se requirieron de 30 a 60 segundos, y como se ha mencionado anteriormente Hibitane fue ineficaz contra Mycobacteria y esporas, mientras que la solución de peróxido de hidrógeno al 3% también fue ineficaz contra esporas y tardó 1 minuto o más en matar Mycobacterium. Los resultados para etacridina fueron similares a los de la solución de peróxido de hidrógeno al 3%.

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TABLA 2 Efectos bactericidas del desinfectante bactericida

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Ejemplo de ensayo 2

En general, se sabe que los efectos de los desinfectantes se reducen por contaminación con materia orgánica, particularmente proteínas, de modo que se investigaron los efectos bactericidas en presencia de materia orgánica. Primero, se añadieron leche desnatada y extracto de levadura a "este desinfectante bactericida" en cantidades de 1 ppm, 50 ppm y 100 ppm, mientras que al mismo tiempo se dejó gotear un 2% en peso de una solución salina fisiológica de 1 x 10^{9} células/ml de SARM o E. coli O-157 como bacteria de prueba en estas soluciones acuosas. El tiempo de contacto entre la bacteria de prueba y "este desinfectante bactericida" fue de 10 segundos a 5 minutos, y se recogieron muestras de 10 \mul del líquido de la mezcla de bacteria de prueba a lo largo del tiempo, se sembraron en el medio apropiado y se cultivaron a 37ºC para evaluar los efectos bactericidas según la presencia o ausencia de crecimiento bacteriano. Los resultados son como se muestran en la tabla 3. La presencia de materia orgánica no tuvo efecto cuando la concentración de materia orgánica fue de 1 ppm, pero cuando la concentración de materia orgánica fue de 50 ppm o más tuvo un efecto ligero. También se realizó el mismo ensayo con especies bacterianas diferentes de las dos mencionadas anteriormente, con resultados similares. También se realizó el mismo ensayo usando desinfectantes normalmente usados en consultas de dentistas, pero a concentraciones por encima de 50 ppm las bacterias no murieron después de 1 minuto de contacto con Hibitane, y sobrevivieron 5 minutos de contacto en algunos casos dependiendo del tipo y cantidad de materia orgánica. Los resultados obtenidos con una solución de peróxido de hidrógeno al 3% y etacridina fueron similares a los de Hibitane.

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TABLA 3 Efectos bactericidas en presencia de materia orgánica

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Ejemplo de ensayo 3

Se investigó si en el proceso de putrefacción después de la preparación de alimentos, rociar "este desinfectante bactericida" sobre los alimentos pararía el progreso de la putrefacción, y cuál sería el grado de ese efecto bactericida. Normalmente los desinfectantes no se aplican a los alimentos tras la preparación, pero con frecuencia los restos de comida llegan a las bolsas periodontales, suministrando una fuente de nutrición para las bacterias, y puesto que los ingredientes en "este desinfectante bactericida" son compuestos reconocidos como aditivos alimentarios, es importante evaluar estos efectos. Se aplastaron "arroz cocido", "tofu", "espinacas con sésamo" y "carne y verduras fritas" inmediatamente después de su preparación como muestras, se homogenizaron, y se dejaron a 28ºC. Después de 5 horas, se tomó parte de cada muestra para contar las bacterias vivas, mientras que el resto de cada muestra se roció totalmente con el desinfectante. Se contaron las células vivas 1 hora, 2 horas y 24 horas después del rociado. Se roció agua sola como control. Después de haber dejado cada una de las muestras durante 24 horas, se tomó parte para contar las células vivas mientras que el resto de cada muestra se roció completamente con cada desinfectante. Como cuando las muestras se dejaron 5 horas, se contaron las células vivas 1 hora, 2 horas y 24 horas después del rociado. Se roció agua sola como control. Se contaron las células vivas mediante el método de vertido en placa usando 5 g de cada muestra, que se tomó y diluyó mediante métodos normales.

El grado de putrefacción naturalmente difiere según el método de preparación, material alimentario y ambiente. En el caso de estas muestras, el recuento de células vivas en el arroz cocido fue de 2 x 10 células/g de muestra inmediatamente después de la preparación, 1 x 10^{3} células/g de muestra después de 5 horas, 5 x 10^{5} células/g de muestra después de 24 horas y 7 x 10^{6} células/g de muestra después de 48 horas. En el caso del tofu el recuento inicial de células vivas fue de 2 x 10^{4} células/g de muestra, pero este aumentó a 8 x 10^{5} células/g de muestra después de 5 horas, 9 x 10^{7} células/g de muestra después de 24 horas y 1 x 10^{9} células/g de muestra después de 48 horas, con un nivel mayor de putrefacción. En el caso de las espinacas con sésamo, el recuento fue de 2 x 10^{3} células/g de muestra inmediatamente después de la preparación, aumentando a 5 x 10^{4} células/g de muestra después de 5 horas, 3 x 10^{7} células/g de muestra después de 24 horas y 2 x 10^{8} células/g de muestra después de 48 horas. En el caso de carne y verduras fritas, el recuento fue de 5 x 10 células/g de muestra inmediatamente después de la preparación, aumentando a 2 x 10^{3} células/g de muestra después de 5 horas, 2 x 10^{8} células/g de muestra después de 24 horas, momento en el que había un ligero olor a putrefacción, y 3 x 10^{9} células/g de muestra después de 48 horas, momento en el que la putrefacción había progresado a un nivel mayor.

Los resultados del ensayo se muestran en la tabla 4. Cinco horas después de la preparación cuando las bacterias no habían proliferado demasiado, el rociado de desinfectante redujo inmediatamente el número de células de 1/100 a 1/200, con algunas diferencias dependiendo del tipo de alimento preparado. Después de 1 hora este había caído de 1/1000 a 1/5000 del recuento original y después de 2 horas las células habían muerto, con recuentos de 10 células/g de muestra o menos. Las bacterias supervivientes no proliferaron incluso después de 24 horas. En la carne y otros alimentos ricos en proteínas, sobrevivieron 7 x 10^{2} células/g de muestra (alrededor del 1%) 2 horas después de rociar el desinfectante. 24 horas después de la preparación los números de células estaban en el orden de 10^{7} a 10^{8}, pero estos cayeron de 1/1000 a 1/10.000 inmediatamente después de rociar el desinfectante, de 1/10.000 a 1/500.000 después de 1 hora y de 1/300.000 a 1/2.000.000 después de 2 horas. El recuento de células en este momento era de alrededor de 10^{2} células/g de muestra. Después de 24 horas el recuento de células era ligeramente mayor que después de 2 horas, pero se pensó que esto reflejaba no tanto la proliferación de bacterias supervivientes como bacterias que caían del aire. Por consiguiente, en general se alcanzó efecto bactericida aunque no lo fue la erradicación completa. Es decir, hay un efecto bactericida y un efecto de supresión en el crecimiento de bacterias de putrefacción en alimentos.

Se realizó el mismo ensayo usando desinfectante ampliamente usados en consultas de dentistas además de "este desinfectante bactericida", con los resultados mostrados en la tabla 4. Cuando se roció Hibitane, la tasa de disminución en el recuento de células inmediatamente después de rociar fue menor que la alcanzada con "este desinfectante bactericida", aunque la tendencia era la misma. Sin embargo, este efecto se debilitó a lo largo del tiempo y las bacterias empezaron a proliferar de nuevo. Es decir, aunque se suprimió el crecimiento de bacterias de putrefacción en alimentos a un cierto grado, no hubo un auténtico efecto bactericida. Además, la mayoría de las bacterias sobrevivieron inmediatamente después de rociar una solución de peróxido de hidrógeno al 3%, y después de 24 horas los alimentos estaban en el punto de putrefacción.

TABLA 4 Aumentos y descensos en el recuento de células inducidos por desinfectantes en alimentos preparados

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Los datos para "este desinfectante bactericida" en los ejemplos de ensayos 1 a 3 sugieren el potencial para un efecto bactericida fuerte contra patógenos periodontales escondidos en las bolsas periodontales. Por el contrario, los desinfectantes ampliamente usados en odontología son de alguna manera eficaces cuando el patógeno periodontal no tiene una barrera, pero cuando se forma placa o sarro y cuando hay una fuente nutricional tal como materia orgánica o residuos de alimentos, sus efectos son mucho menores.

Basado en los resultados de los ensayos anteriores, se probó la eficacia de cada desinfectante bactericida usando como material de prueba placa, que se considera como la causa fundamental de la periodontitis.

Ejemplo de ensayo 4

Se recogió placa que se adhiere al sarro supragingival, se remojaron secciones cortadas de un espesor de 200 \mum y placa en polvo molida a un tamaño de grano de 10 \mum en 1 ml de "este desinfectante bactericida", y se midió el número de células vivas contenidas allí a lo largo del tiempo mediante métodos normales. Los resultados son como se muestra en la tabla 5. El número de células vivas de 4 x 10^{9} células contenidas en 20 mg de secciones de placa se redujo en 3/4 después de 1 minuto de inmersión, cayendo a 1/5.000 del recuento original de células después de 5 minutos, y después de 10 minutos todas las bacterias habían muerto. Se eliminaron todas las bacterias en la placa en polvo en los 3 minutos. Es decir, se mostró que "este desinfectante bactericida" atraviesa la barrera, penetrando en el interior de la placa y teniendo un efecto bactericida en las bacterias allí. En el caso de Hibitane (Hibitane en gel), solución de peróxido de hidrógeno al 3% y etacridina, que son ampliamente usados en el campo dental, las bacterias en la superficie de la placa se eliminaron principalmente en 3 minutos, pero las bacterias en el interior de la placa toleraron incluso 60 minutos de inmersión, sobreviviendo la mitad de las células. Esto significa que no podía dañar claramente la placa, que es una agregación de bacterias. Cuando se realizó el mismo ensayo usando placa que se adhiere al sarro subgingival (denso y duro), todas las bacterias se eliminaron en alrededor de 15 minutos en el caso de placa con forma de lámina y en 3 minutos en la caso del polvo. Por el contrario, cuando se usaron Hibitane y similares las bacterias en el interior de la placa toleraron 60 minutos de inmersión y siguieron sobreviviendo como se ha descrito anteriormente.

TABLA 5 Cambios inducidos por el tratamiento desinfectante bactericida en el recuento de células vivas en la placa

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A continuación, considerando los casos en los que materia orgánica adicional se adhiere o contamina la placa que se adhiere al sarro, se mezclaron 20 mg de placa con 20 mg de extracto de levadura y se realizó un ensayo mediante los métodos descritos anteriormente. Los resultados son como se muestra en la tabla 6. Hubo poco efecto de la materia orgánica, cayendo el recuento de células hasta alrededor de 1/2.000 del recuento original después de 5 minutos de inmersión y siendo eliminadas todas las bacterias después de 10 minutos de inmersión en el caso de placa con forma de lámina. En el caso de la placa en polvo, se eliminaron todas las bacterias después de 3 minutos de inmersión. Por el contrario, con los desinfectantes usados normalmente la desinfección de la superficie de la placa tardó 10 minutos debido a la presencia de materia orgánica, y la mayoría de las bacterias internas sobrevivieron. Es decir, se muestra que a menos que la placa se elimine completamente en el tratamiento, aunque se puede ver una mejora temporal el problema reaparecerá repetidamente.

TABLA 6 Cambios inducidos por el tratamiento desinfectante bactericida en el recuento de células vivas en la placa y materia orgánica

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Como está claro de los varios resultados de los ensayos dados en los ejemplos de ensayo 1 a 4 anteriormente, "este desinfectante bactericida" causa serios daños en las bacterias supervivientes en forma activa en varios ambientes. Los patógenos de la periodontitis que viven las bolsas periodontales y se esconden en la placa difícil de eliminar no son una excepción, y se mostró que la inyección de "este desinfectante bactericida" en estos casos destruye las bacterias en segundos hasta alrededor de 10 minutos, con algunas diferencias dependiendo de la fase de crecimiento y tipo de placa. Además, se debe mencionar que en ensayos en animales y experimentos en seres humanos tales como los descritos anteriormente, se mostró que "este desinfectante bactericida" tenía muy poco efecto perjudicial sobre células y tejidos, y que fomentaba la regeneración de tejidos.

Ejemplo de ensayo 5

Se separó alrededor de 1 cm^{2} de piel de ratón y se aplicaron varios desinfectantes bactericidas a concentraciones normales a las heridas usando algodón absorbente cada mañana y noche. Se aplicó agua como control. Los resultados son como se muestra en la tabla 7. En el caso del ratón control se necesitaron 5 días para que se regenerara una piel fina sobre la herida, 12 días para que la piel recuperara su espesor original y 35 días para que el pelo creciera de nuevo, mientras que con la aplicación de "este desinfectante bactericida" se necesitaron 4 días para que la herida se cerrara, 10 días para que la piel recuperara su espesor original y sólo 30 para que el pelo creciera de nuevo. Estos resultados se ajustan con los obtenidos con tintura de yodo, lo que significa que tanto "este desinfectante bactericida" como la tintura de yodo fomentan la regeneración de tejidos. Por el contrario, con la aplicación de Hibitane en gel, solución de peróxido de hidrógeno al 3% y etacridina, que se usan ampliamente en odontología, se necesitaron 5 días para que se formara un piel fina, de 12 a 15 días para que la piel recuperara su espesor original y 40 días para que el pelo creciera de nuevo. Es decir, estos desinfectantes actúan como venenos que suprimen la regeneración de tejido.

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TABLA 7 Recuperación de heridas de la piel inducida por desinfectante bactericida

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Ejemplo de ensayo 6

Cuando se añadieron diluciones de "este desinfectante bactericida" a medio, como se muestra en la tabla 8, estimularon el crecimiento del bacilo del ácido láctico usado en la presente invención. Es bien sabido que el crecimiento de los lactobacilos se fomenta mediante la adición de ácido acético, pero es sorprendente que un desinfectante bactericida con acción bactericida tenga un efecto de fomento del crecimiento incluso en dilución. Sin embargo, como se muestra en la tabla 9, los patógenos de periodontitis y otras bacterias patógenas no están afectados de esta manera. Esto significa que si "este desinfectante bactericida" se inyecta primero en una bolsa periodontal que se lava después con agua y se rellena con la nueva especie de Lactobacillus casei (en adelante, "nuevo lactobacilo") de la presente invención que tiene capacidades únicas como se describe más adelante, el crecimiento del "nuevo lactobacilo" se estimulará, aumentando los efectos terapéuticos contra la periodontitis. Por el contrario, cuando al medio se añadieron desinfectantes ampliamente usados en diferentes concentraciones, el crecimiento bacteriano se suprimió algunas veces pero nunca se estimuló. Además, el principal componente Fe^{3+} de "este desinfectante bactericida" es adsorbido por las superficies de los dientes y sirve como una barrera para protegerlos contra la readhesión de patógenos periodontales. Debido a que tiene un efecto astringente, además, la secreción de líquido del surco periodontal que suministra una fuente de nutriente para los patógenos periodontales se reduce temporalmente, suprimiendo de esta manera el crecimiento y proliferación cortando parte del suministro de nutrientes a los patógenos periodontales escondidos dentro de los surcos.

TABLA 8 Efecto de este desinfectante bactericida sobre el crecimiento de bacilos del ácido láctico

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TABLA 9 Efecto de este desinfectante bactericida sobre el crecimiento de bacterias patógenas

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Ejemplos

La presente invención se explica en detalle a continuación basado en ejemplos. Los procesos de producción se pueden cambiar, y por supuesto se puede obtener cualquier número de células usando un extensor o excipiente conocido. La preparación se puede formular de cualquier manera junto con excipientes adecuados, como un polvo, gránulos, cápsulas o similares por ejemplo.

Ejemplo de producción 1

Se sembró el Lactobacillus casei (FERM BP-10059, FERM P-19443) de la presente invención en 10 L de medio de pH 7,2 que contenía 10 g de peptona, 5 g de extracto de carne, 5 g de extracto de levadura, 10 g de lactosa, 2 g de K_{2}HPO_{4}, 0,1 g de MgSO_{4}\cdot7H_{2}O, 1 g de NaCl, 2 g de citrato de diamonio, 5 g de acetato de sodio, 3 g de CaCO_{3}, 0,3 g de MnSO_{4}\cdot5H_{2}O, 0,03 g de FeSO_{4}\cdot7H_{2}O y 1 g de L-cisteína por litro, y se cultivó de forma anaerobia durante 72 horas a 37ºC. Después de la conclusión del cultivo, el cultivo líquido se filtró en papel para eliminar el CaCO_{3}, y se enfriaron 3 L del filtrado mientras que el líquido restante se centrifugó para obtener un sobrenadante y una masa bacteriana de 8,4 g. Esta se lavó después en 420 ml de solución salina fisiológica, y se centrifugó dos veces. La masa bacteriana purificada resultante se colocó en una solución que consistía en 70 g de leche desnatada, 20 g de almidón soluble, 0,5 g de glutamato de sodio y 1000 ml de agua purificada, se agitó, y se liofilizó por medios normales para obtener 101 g de preparación bacteriana. Cuando se midió, el número de células de esta preparación bacteriana fue de 2,5 x 10^{10} células/g. La preparación resultante consistía en 101 g de células bacterianas liofilizadas (incluyendo conservante), 3000 ml de cultivo líquido y 6700 ml de filtrado de cultivo (líquido desinfectado).

Ejemplo de producción 2

Se sembró el Lactobacillus casei (FERM BP-10059, FERM P-19443) de la presente invención en 10 L de medio de pH 6,8 que contenía 3 g de casaminoácidos, 2 g de extracto de levadura, 50 ml de zumo de tomate, 2 g de glucosa, 1 g de NaCl, 1 g de KH_{2}PO_{4}, 0,7 g de MgSO_{4}\cdot7H_{2}O, 1 g CaCl_{2}\cdot2H_{2}O, 0,5 ml de Tween 80 y 0,5 g de almidón soluble por litro, y se cultivó en un cultivo anaerobio facultativo durante 96 horas a 30ºC. Después de la conclusión del cultivo, se enfriaron 3 L del cultivo mientras que los 7 L restantes se centrifugaron para obtener un sobrenadante y una masa bacteriana de 5,6 g. Esta se lavó después en 280 ml de solución salina fisiológica, y se centrifugó de nuevo. Se mezclaron bien 2,6 g de la masa bacteriana purificada resultante con 10,4 g de fécula de patata, y se enfriaron. Los restantes 3 g de masa bacteriana purificada se colocaron en una solución que consistía en 15 g de leche desnatada, 15 g de almidón soluble, 5 g de trehalosa, 0,2 g de cisteína y 500 ml de agua purificada, se agitó y se liofilizó por medios ordinarios para obtener 39 g de preparación bacteriana. Cuando se midió, el número de células de esta preparación bacteriana era de 2 x 10^{10} células/g. La preparación resultante consistía en 39 g de células bacterianas liofilizadas (incluyendo conservante), 13 g de células bacterianas húmedas (incluyendo conservante), 3000 ml de cultivo líquido y 6700 ml de filtrado de cultivo (líquido desinfectado).

Ejemplo de producción 3

Se sembró el Lactobacillus casei (FERM BP-10059, FERM P-19443) de la presente invención en 5 L de medio que contenía 100 g de leche desnatada y 1 g de trehalosa por litro que se había ajustado a pH 6,8, y se cultivó en un cultivo anaerobio facultativo durante 72 horas a 37ºC. A continuación, se añadieron 75 g de trehalosa a este cultivo líquido (yogur), que se agitó bien y se liofilizó mediante métodos normales para obtener 590 g de preparación bacteriana. Cuando se contaron, el número de células de esta preparación bacteriana fue de 5 x 10^{9} células/g. La preparación bacteriana resultante contenía células bacterianas y productos de fermentación de la leche desnatada.

Ejemplo de producción 4

Para preparar la nueva preparación de lactobacilo (FERM BP-10059, FERM P-19443) de la presente invención, el nuevo lactobacilo resistente a antibióticos (FERM BP-10059, FERM P-19443) de la presente invención se sembró en 10 L de medio de pH 7,2 que contenía 5 g de peptona, 3 g de extracto de carne, 2 g de extracto de levadura, 1 g de CGF, 5 g de almidón, 1 g de lactosa, 2 g de citrato de diamonio, 3 g de acetato de sodio, 0,2 g de MgSO_{4}\cdot7H_{2}O, 0,03 g de FeSO_{4}\cdot7H_{2}O y 1 g de L-cisteína por litro, y se cultivó de forma anaerobia durante 3 días a 37ºC. Después de la conclusión del cultivo, el cultivo líquido se filtró en papel para eliminar el CaCO_{3} y después se centrifugó, y se dispersaron 7,8 g de las células bacterianas resultantes en 370 ml de solución salina fisiológica y se centrifugó de nuevo dos veces. La masa de células purificadas resultante se dispersó en 450 ml de una solución de almidón al 5% previamente esterilizada y se liofilizó por medios normales para obtener 30 g de preparación de lactobacilo nuevo. El contenido de células vivas de esta preparación bacteriana fue de 1 x 10^{11} células/g.

Ejemplo de producción 5

Se mezclaron los cuerpos celulares purificados producidos en el ejemplo de producción 4 con 15,7 ml de aceite de oliva para producir una preparación oleaginosa. El contenido de células vivas de esta preparación bacteriana fue de 2 x 10^{11} células/g. Se mezclaron 10 g de esta preparación oleaginosa en 10 g de pomada hidrofílica para producir una crema de lactobacilo. A continuación, se mezclaron 400 mg de amoxicilina (AMPC), 100 mg de eritromicina (EM), 100 mg de neomicina (FRM) y 100 mg de cefaclor (CCL) como antibióticos con la crema de lactobacilo para producir una crema de lactobacilo que contiene antibiótico.

Ejemplo 1

Se investigaron la velocidad y porcentaje de mutaciones S-R en E. coli O-157 debido a los efectos de antibióticos que debilitan toxinas producidos por Lactobacillus casei cuando estaban presentes tanto E. coli O-157 como Lactobacillus casei por medio de un cultivo mixto de E. coli O-157 y la especie original de Lactobacillus casei (FERM BP-6971) y un cultivo mixto de E. coli O-157 y la especie de Lactobacillus casei de la presente invención (FERM BP-10059, FERM P-19443). El medio estaba compuesto de 5 g de extracto de carne, 1 g de extracto de levadura, 5 g de peptona, 2 g de NaCl, 1 g de CaCO_{3} y 2 g de glucosa o almidón por litro, con el pH ajustado a 7,2. El cultivo fue anaerobio a 37ºC, con subcultivos cada 72 horas que se diluyeron y aplicaron cada vez a medio en placa. Se observaron las colonias resultantes y se contaron el número de tipos S (original) y tipo R (toxinas debilitadas) y se compararon los porcentajes. Los resultados se muestran en la tabla 10 y la tabla 11. Como se muestra en la tabla 10, cuando se usó glucosa como azúcar el recuento de células fluctuó mucho con el subcultivo cuando se subcultivó E. coli O-157 junto con el Lactobacillus casei original (FERM BP-6971). A partir de aproximadamente el 5º subcultivo apareció el tipo R (30%) y el porcentaje de tipo R aumentó según seguía el subcultivo, de modo que todas las bacterias eran de tipo R en el 18º subcultivo. El tipo S no reapareció con subcultivo posterior. Por el contrario, cuando se subcultivó E. coli junto con la especie de Lactobacillus casei de la presente invención (FERM BP-10059, FERM P-19443), el tipo R apareció en el tercer subcultivo a una tasa del 5%, alcanzando el 50% en el 5º subcultivo, y en el 12º subcultivo toda las E. coli O-157 eran del tipo R. Es decir, E. coli O-157 estaba afectada más por la especie de Lactobacillus casei de la presente invención que por la especie original de Lactobacillus casei. Esto se atribuye a la diferencia en potencia de proliferación entre las dos especies de Lactobacillus casei.

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TABLA 10 Resultados del cultivo mixto de E. coli O-157 con la especie original de Lactobacillus casei y la especie de Lactobacillus casei de la presente invención con glucosa como azúcar

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Como se muestra en la tabla 11, cuando se usó almidón como azúcar la potencia proliferativa de E. coli O-157 disminuyó, pero la proliferación de la especie original de Lactobacillus casei disminuyó aún más, y el recuento final de células fue menor que 5 x 10^{8} células. Debido a esta reducción en la eficacia E. coli O-157 mutó más despacio al tipo R, con un porcentaje del 10% en la 7ª generación y del 50% en la 20ª generación. El porcentaje de tipo R nunca superó el 70% con el subcultivo continuo. Sin embargo, la potencia proliferativa de la especie de Lactobacillus casei de la presente invención no fue diferente que con glucosa, y en este caso la potencia proliferativa de E. coli O-157 disminuyó en cada subcultivo, alcanzando el porcentaje de tipo R el 15% en la 3ª generación y el 100% en la 7ª generación.

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TABLA 11 Resultados del cultivo mixto de E. coli O-157 con la especie original de Lactobacillus casei y la especie de Lactobacillus casei de la presente invención con almidón como azúcar

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TABLA 12 Tasas de aparición de patógenos de tipo R en cultivo mixto

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Ejemplo 2

Ya se ha realizado un ensayo en el que la ingestión diaria de 2 g de células bacterianas liofilizadas (5 x 10^{8} células/g) producidas en el ejemplo de producción 1 y que consistía en el Lactobacillus casei original produjo un aumento en Lactobacillus y Bifidobacterium, que se sabe que son componentes beneficiosos de la flora intestinal, y contrariamente un descenso en Clostridium y Veillonella, que se sabe que son bacterias dañinas. En este ejemplo se miden los resultados de la ingestión de la especie de Lactobacillus casei de la presente invención por 10 sujetos sanos y se comparan en el tiempo durante 3 meses. Los resultados se muestran en la tabla 13. Cuando se ingirió el Lactobacillus casei original (FERM BP-6971) Bifidobacterium aumentó alrededor del 90% en 3 meses y Lactobacillus casei aumentó el 150%, mientras que Clostridium descendió el 50% y Veillonella descendió el 25%. Sin embargo, cuando se ingirió el Lactobacillus casei de la presente invención (FERM BP-10059, FERM P-19443) Bifidobacterium aumentó el 133% en 3 meses y Lactobacillus casei aumentó el 300%, mientras que Clostridium descendió el 96% y Veillonella descendió el 98,4%. Es decir, los efectos en las bacterias beneficiosas y dañinas que forman la flora intestinal son mucho mayores con el Lactobacillus casei de la presente invención. La capacidad de reducir bacterias dañinas es particularmente sorprendente.

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TABLA 13 Cambios en la flora intestinal en sujetos sanos

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Ejemplo 3

A continuación, se administraron 2 g de las células bacterianas liofilizadas producidas en el ejemplo de producción 1 de Lactobacillus casei anteriormente mencionado a 10 enfermos, y se midieron las bacterias y se compararon en el tiempo durante 3 meses. Los resultados se muestran en la tabla 14. Como se muestra en las tablas 13 y 14, antes de la administración los sujetos sanos tenían alrededor de 2 veces el número de bacterias beneficiosas en su flora intestinal que los enfermos, y sólo alrededor de 1/3 de los números de bacterias dañinas. Esto demuestra que el estado de la flora intestinal refleja el estado actual de salud. En respuesta a un estudio, todos los sujetos sanos que habían participado en el ensayo se sintieron más sanos, mientras que los enfermos informaron de más confianza en su salud. Las respuestas específicas incluyeron informes de que (1) disminuyó la fatiga, (2) mejoró el color, (3) se curaron las anormalidades en las heces, (4) la piel recuperó la tirantez y belleza, (5) la obesidad mejoró, (6) la presión sanguínea alta volvió a ser normal y (7) la atopia mejoró considerablemente, y la proporción de tales respuestas fue mucho mayor entre los que ingirieron el Lactobacillus casei de la presente invención.

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TABLA 14 Cambios en la flora intestinal de enfermos

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Ejemplo 4

Se prepararon tres macetas de 600 mm de anchura x 200 mm de profundidad x 150 mm de altura, y cada una se llenó tierra normal de campo mezclada con 100 g de compost maduro y 12 g de fertilizante químico (Nippon Godo Fertilizer Co. Green Map, N: 8%, P: 5%, K: 5%) y se dispersaron 10 g de cal de magnesio (NAC Co., mejorador de tierra que consiste en óxido de magnesio del 5 al 7% mezclado con cal muerta). A continuación, se hicieron surcos hasta una profundidad de 5 a 8 mm, y se plantaron a mano con semillas de rábano. La germinación se produjo en el quinto día, y al día siguiente 2 g de masa bacteriana centrifugada, que consistía en Lactobacillus casei original (FERM BP-6971) que se había cultivado en el medio descrito en el ejemplo de producción 2 se añadieron a 200 ml, se agitó bien y se aplicó al grupo control. Al mismo tiempo, 2 g de masa bacteriana centrifugada, que consistía en Lactobacillus casei de la presente invención (FERM BP-10059, FERM P-19443) que se había cultivado en el medio descrito en el ejemplo de producción 2 se añadieron a 200 ml de agua, se agitó bien y se aplicó al grupo de prueba. Se aplicó agua sola al grupo sin tratar. Alrededor del 10º día después de surgir las hojas, estas se recogieron a intervalos de alrededor de 5 cm, dejando 30 plantas de rábano en cada maceta. Se aplicaron suspensiones de las respectivas masas de células centrifugadas al grupo control y al grupo de prueba junto con 150 ml de una dilución de 500 veces de fertilizante, mientras que sólo se aplicaron 150 ml de una dilución de 500 veces de fertilizante al grupo sin tratar. Se regaron después los rábanos según se necesitó para prevenir que se secaran y se recogieron en el 28º día. Los resultados se muestran en la tabla 15. Los rábanos recogidos del grupo de prueba que se había tratado con el Lactobacillus casei de la presente invención fueron superiores no sólo respecto a los rábano no tratados sino también respecto a las plantas en el grupo control que se habían tratado con el Lactobacillus casei original en términos de todas las medidas de calidad incluyendo peso, brillo, olor, carne, sabor y la textura crujiente.

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TABLA 15 Resultado del crecimiento de rábanos

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Ejemplo 5

Se realizó un ensayo de crecimiento realizado con grupos de prueba como en el ejemplo 4 mediante cultivo hidropónico de semillas de rábano oriental. Se extendió esponja en el fondo de una caja de polietileno de 100 mm de anchura x 100 mm de profundidad x 180 mm de altura, se empapó con agua, y se sembró en su totalidad con semillas de rábano oriental. Con la temperatura ajustada a 22ºC estas se cubrieron con una tela negra durante 5 días para bloquear la luz, después de lo cual se eliminó la tela y se hicieron crecer en luz natural. Para el grupo control, se añadieron 1 g de células bacterianas liofilizadas de la especie original de Lactobacillus casei (FERM BP-6971) a 100 ml de agua, se agitaron bien y se aplicó mediante nebulización en los días 3º y 5º. Para el grupo de prueba, se añadieron 1 g de células bacterianas liofilizadas de Lactobacillus casei de la presente invención (FERM BP-10059, FERM P-19443) producidas en el ejemplo de producción 1 a 100 ml de agua, se agitaron bien y se aplicó mediante nebulización en los días 3º y 5º. Se aplicó solo agua al grupo sin tratar. Como se muestra mediante los resultados de crecimiento en la tabla 16, la aplicación del Lactobacillus casei de la presente invención produjo brotes de rábano oriental mejores que en el grupo sin tratar o el grupo control.

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TABLA 16 Resultados de crecimiento para rábano oriental

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Como está claro de los ejemplos 1 a 5, se ha confirmado que la especie de Lactobacillus casei de la presente invención, que ha adquirido varias propiedades mediante aclimatación mientras que retiene las propiedades de la especie original de Lactobacillus casei, mejora la vitalidad a un nivel incalculable en el organismo, y es fundamentalmente una cepa diferente de la especie original de Lactobacillus casei.

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Ejemplo 6

Respecto a la toxicidad de P. gingivalis y P. intermedia, se ha mostrado que se puede estimar la calidad y cantidad de las toxinas producidas de los resultados de ensayos en animales observando el color y olor de colonias negras hechas crecer en placas de sangre y la potencia de la adhesividad a la placa, mientras que en el caso de A. actinomycetemcomitans, se puede estimar la calidad y cantidad de las toxinas producidas observando la adhesividad y la potencia hemolítica. Por lo tanto se cultivaron los principales patógenos periodontales anteriormente mencionados junto con el "nuevo lactobacilo" para investigar qué tendencias y reacciones mostrarían los patógenos periodontales. Usando el caldo GAM modificado por Nissui como medio, se cultivaron las bacterias de forma anaerobia a 37ºC con subcultivos cada 72 horas, tiempo al que se diluyó el cultivo y se aplicó mediante métodos normales a un medio en placa con sangre, y se observaron los números de células y las condiciones de las colonias resultantes a lo largo del tiempo. Los resultados se muestran en las tablas 17, 18 y 19. Como está claro a partir de la tabla 17, el número de células de P. gingivalis cayó gradualmente con cada subcultivo, desapareciendo en el 25º subcultivo. Durante este tiempo la toxicidad se debilitó gradualmente empezando en el 5º subcultivo, y mientras aún estaba presente alguna toxicidad ligera en el 15º subcultivo, en el 20º subcultivo había desaparecido virtualmente. Se confirmó que ratones infectados por vía periodontal con estas bacterias no desarrollaron periodontitis. Como está claro a partir de la tabla 18, el recuento de células de P. intermedia disminuyó gradualmente con el subcultivo, y las bacterias habían desaparecido en el 15º subcultivo. También descendió la patogenicidad como resultado, desapareciendo en el 12º subcultivo. Como está claro a partir de la tabla 19, el recuento de células de A. actinomycetemcomitans disminuyó con cada subcultivo, pero no tan rápidamente como P. gingivalis y P. intermedia. Pasado un cierto punto, sin embargo, A. actinomycetemcomitans disminuyó rápidamente, desapareciendo en el 18º subcultivo. En ensayos en ratón, la patogenicidad había desaparecido completamente en el 12º subcultivo. Se realizaron ensayos de cocultivo similares usando otras bacterias implicadas en la periodontitis, tales como F. nucleatum, B. forsythus, L. buccalis, E. corrodens y también Streptococcus, que son comunes en la cavidad bucal, pero todas ellas fueron superadas por la potencia proliferativa y sustancias bioactivas del lactobacilo de la presente invención, y se mostró que los recuentos de células y toxicidad disminuían con cada subcultivo.

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Ejemplo 7

Cuando el "nuevo lactobacilo" (FERM BP-10059, FERM P-19443) se cultiva en estrías de forma anaerobia durante 72 horas a 37ºC en el centro de una placa con un diámetro de 90 mm, y se cultivan en estrías varios patógenos periodontales en el margen de la misma, el desarrollo de los patógenos periodontales se detiene cerca de las áreas ocupadas por el FERM BP-10059 (FERM P-19443) por efecto de las sustancias bioactivas semejantes a antibiótico producidas por FERM BP-10059 (FERM P-19443). Por lo tanto, se observó cómo cambiaría en intervalo de crecimiento cuando los patógenos periodontales que crecían en el margen donde se detenía el desarrollo se recogían repetidamente y se cultivaban en estrías en placas de FERM BP-10059 (FERM P-19443). En este ejemplo, el FERM BP-10059 (FERM P-19443) no se mezcló con los patógenos periodontales como en el ejemplo 5. Se usó medio GAM modificado en las placas. Los resultados se muestran en la tabla 20. El rango de detención debido a FERM BP-10059 (FERM P-19443) era aproximadamente igual después de varios subcultivos que en el cultivo inicial, pero pasado un cierto punto el rango de detención creció rápidamente, y para el 13^{er} a 15º subcultivo los patógenos se habían eliminado de la placa Petri. La toxicidad descendió gradualmente al mismo tiempo y por último desapareció.

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TABLA 20 Efectos del nuevo lactobacilo (FERM BP-10059) sobre bacterias que producen periodontitis

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En un ensayo de sensibilidad usando antibióticos existentes, el rango de detención se redujo gradualmente en todos los casos con cada pase, y por último se alcanzó la resistencia. Es decir, aparecieron cepas resistentes a antibióticos, y las toxinas bacterianas bien no cambiaron o con frecuencia se hicieron más fuertes. Es bien sabido que la aparición y difusión de SARM, ERV, y M. tuberculosis, Ps. aeruginosa y similares multirresistentes es un serio problema en el mundo. Los ejemplos 6 y 7 anteriores dan evidencia de que los patógenos periodontales no desarrollan resistencia debido a los fuertes efectos de FERM BP-10059 (FERM P-19443) ya sea por contacto directo o no, sino que más bien se suprime su capacidad de crecer y proliferar a lo largo del tiempo y su toxicidad se elimina completamente.

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Ejemplo 8

Para medir la adhesividad del "nuevo lactobacilo" (FERM BP-10059, FERM P-19443) en bolsas periodontales, se inyectó una solución de células (2 x 10^{10}/ml) suspendidas en solución salina fisiológica en bolsas de profundidad equivalente, se inyectó solución salina fisiológica estéril en las bolsas al día siguiente, y después de 5 minutos la solución salina inyectada se aspiró fuera de las bolsas y se observó el crecimiento y disminución de FERM BP-10059 (FERM P-19443) cada día durante una semana. Se preparó un mucílago de L. acidophilus, que coloniza las membranas mucosas, como control, y se inyectaron este y el muy adhesivo B. natto por separado en el mismo número y se observó el progreso. Los resultados se muestran en la tabla 21. Cuando se inyectaron 2 x 10^{10}/ml de FERM BP-10059 (FERM P-19443), la mayoría (del 90% al 95%) se eliminó por lavado, pero las bacterias que quedaron permanecieron alrededor de una semana, y la tasa de colonización fue mayor cuanto más profunda era la bolsa. Esto significa que FERM BP-10059 (FERM P-19443) es capaz de crecer usando líquido de surcos periodontales como su principal fuente de nutrientes, y que puede ser más activo en periodontitis más avanzada. Por el contrario, no se vio L. acidophilus a partir del 4º día ni B. natto a partir del 3^{er} día. Es decir, estas bacterias no se pudieron establecer y proliferar en las bolsas periodontales.

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Ejemplo 9

Se observaron el crecimiento y disminución en los números de células cuando se inyectó el "nuevo lactobacilo" (FERM BP-10059, FERM P-19443) en bolsas periodontales en días sucesivos y cuando se inyectó en días alternos. Como se muestra en la tabla 22, cuando se inyectaron las bacterias cada día el recuento de células en las bolsas aumentó gradualmente, siendo mejor la colonización y la proliferación cuanto más profunda era la bolsa, mientras que cuando se inyectaron en días alternos la proliferación y colonización de las bacterias era de alguna manera más lenta que con la inyección diaria, pero el número de células aumentó gradualmente en conjunto. Esto sugiere que es suficiente inyectar las bacterias en días alternos.

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El "nuevo lactobacilo" (FERM BP-10059, FERM P-19443) no sólo es eficaz contra todo tipo de infecciones agudas y crónicas, sino que también es eficaz mejorando las afecciones sistémicas crónicas tales como diabetes que son factores asociados con la periodontitis. Es decir, la administración del nuevo lactobacilo de la presente invención aumenta el poder de curación natural del cuerpo, que se traduce en vitalidad. Vitalidad es la capacidad del cuerpo para fomentar el crecimiento y regenerar tejidos.

Ejemplo 10

Se dividieron 45 peces de colores (Wakin) con una longitud media de 4,2 cm que mostraban síntomas iniciales enfermedad por Saproglenia en tres grupos, un grupo sin tratar, un grupo control y un grupo de prueba, y se observaron durante 2 meses en un total de 9 tanques de agua con las temperaturas del agua para cada grupo ajustadas a 15ºC, 20ºC y 25ºC. En cada tanque se criaron cinco peces de colores en 5 litros de agua. Se administró 1 g de células bacterianas liofilizadas (5 x 10^{6} células/ml de agua del tanque) de la especie original de Lactobacillus casei (FERM BP-6971) al grupo control. Se administró 1 g de células bacterianas liofilizadas (5 x 10^{6} células/ml de agua del tanque) de la especie de Lactobacillus casei de la presente invención (FERM BP-10059, FERM P-19443) producidas en el ejemplo de producción 1 al grupo de prueba. Los peces de colores en el grupo sin tratar se criaron sin ningún tratamiento. Los resultados se muestran en la tabla 23. Como se muestra en la tabla 23, en el grupo sin tratar todos los peces de colores murieron en menos de un mes independientemente de la temperatura del agua, con un tiempo medio de supervivencia de 18 días. En el grupo control que recibía la especie original de Lactobacillus casei, todos los peces de colores murieron en menos de un mes en el tanque de 25ºC, con un tiempo medio de supervivencia de 23 días, pero en los tanques ajustados a 15ºC y 25ºC la Saproglenia creció más despacio y los peces de colores sobrevivieron más tiempo, muriendo 2 después de un mes y muriendo otros 2 después de 2 meses a 15ºC, con un índice de mortalidad del 80%. A 20ºC, murieron 2 después de un mes y todos después de 2 meses, con un índice de mortalidad del 100%. Por el contrario, usando la especie de Lactobacillus casei de la presente invención 1 pez murió en el día 45 de crianza en el tanque de 20ºC, mientras que en el tanque de 25ºC murió un pez en el día 25 y un pez murió en el día 50, pero los otros peces de colores estaban todos sanos y la Saproglenia que se adhiere a las superficies de sus cuerpos disminuyó hasta que era casi imperceptible. La tasa de crecimiento fue la misma que la de los peces de colores sanos. Esto indica que la especie de Lactobacillus casei de la presente invención, que se ha aclimatado a bajas temperaturas, es eficaz incluso a una temperatura baja de 15ºC.

TABLA 23 Resultados experimentales contra la enfermedad de Saproglenia en peces de colores

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Ejemplo 11

Se realizó un ensayo de alimentación en tanques ajustados a las mismas condiciones que en el ejemplo 10 usando grupos de 5 peces de colores (Wakin) que padecían de enfermedad ulcerosa de peces de colores, en la que Aeromonas invade a través de una herida y disuelve la carne circundante, produciendo que en casos graves los órganos internos se expongan. Los síntomas de la enfermedad ulcerosa de peces de colores variaron de leves a moderados, y los peces de colores se criaron durante 2 meses con los síntomas equilibrados entre los tanques. Los resultados se muestran en la tabla 24. Como se muestra en la tabla 24, los síntomas de los peces de colores en el grupo sin tratar progresaron independientemente de la temperatura del agua, y en 2 meses los órganos estaban expuestos y todos los peces murieron. En el grupo control que recibió la especie original de Lactobacillus casei (FERM BP-6971), los peces con síntomas leves mantuvieron su estado en el agua a temperatura más baja, pero cuando la temperatura del agua era alta los síntomas progresaron lentamente y por último del 60% al 80% de los peces murieron en 2 meses. Por el contrario, en el grupo de prueba que recibió la especie de Lactobacillus casei de la presente invención (FERM BP-10059, FERM P-19443) aquellos peces con síntomas más leves en su mayor parte se curaron independientemente de la temperatura del agua. Incluso en el caso de síntomas moderados las heridas sanaron gradualmente, y no murió ningún pez incluso después de 2 meses.

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(Tabla pasa a página siguiente)

TABLA 24 Resultados experimentales para la enfermedad ulcerosa en peces de colores

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Ejemplo 12

Se separó alrededor de 1 cm^{2} de piel de ratón, después de lo cual se aplicó agua dos veces por la mañana y por la noche al grupo sin tratar, mientras que se aplicaron células centrifugadas de la cepa estándar ATCC 393 de L. casei y el "nuevo lactobacilo" (FERM BP-10059, FERM P-19443) a los grupos de tratamiento bacteriano, y se observó la evolución. Como se muestra en la figura 1, cuando se aplicó FERM BP-10059 (FERM P-19443) se necesitaron sólo 3 días para que una fina película cubriera la superficie entera de la herida, 8 días para que la piel se recuperara completamente, y 22 días para que el pelo volviera a crecer del todo. Por el contrario, esto necesitó 4 días, 10 días y 28 días usando ATCC 393 y 5 días, 12 días y 35 días usando agua. Este ensayo también muestra los notables efectos de restablecimiento de tejido del "nuevo lactobacilo" (FERM BP-10059, FERM P-19443).

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Ejemplo 13

Para investigar el aumento de células con células animales y células vegetales, se sembraron la cepa estándar ATCC 393 de L. casei y el "nuevo lactobacilo" (FERM BP-10059, FERM P-19443) en medio de pH 7,2 que contenía 3 g de peptona, 2 g de triptona, 3 g de extracto de carne, 1 g de CGF, 1 g de extracto de levadura, 3 g de almidón, 1 g de trehalosa, 1,5 g de KH_{2}PO_{4}, 0,7 g de MgSO_{4}\cdot7H_{2}O, 1 g NaCl, 1 g de citrato de diamonio, 1 g de (NH_{4})_{2}HPO_{4}, 2 g de acetato de sodio, 2 g de CaCO_{3}, 0,2 g de MnSO_{4}\cdotxH_{2}O, 0,03 g de FeSO_{4}\cdot7H_{2}O, 0,01 g de ZnSO_{4}, 0,2 g de L-cisteína y 1 g de taurina por litro, y se cultivaron de forma anaerobia durante 72 horas a 37ºC, se mezclaron 2 x 10^{5} células/ml de células de riñón de mono (V-1), células de mastocitoma de ratón P815 y linfocitos de ratón CEA con cultivos líquido que consistía en medio GIT de Japan Pharmaceutical Co. para cultivo animal al que se había añadido o no sobrenadante centrifugado al 5% de los cultivos de lactobacilo, y se contaron las células vivas después de 48 horas. Los resultados se muestran en las figuras 2, 3 y 4. Como se muestra en estas figuras, cuando se añadió filtrado de cultivo de lactobacilo al 5% a su líquido de cultivo celular las células animales se volvieron más prolíficas, con un aumento del 10 al 15% usando la cepa estándar ATCC393 y un aumento del 40 al 50% usando FERM BP-10059 (FERM P-19443). Esto indica que las sustancias producidas por los lactobacilos (sustancias bioactivas) estimulan y fomentan la proliferación (división celular), y el aumento en la proliferación de linfocitos sugiere una contribución al reforzamiento del sistema inmune. Además, como se muestra en la figura 5, en un ensayo similar usando células vegetales de chlorella la tasa de proliferación también aumentó aunque no tanto como con células animales.

Los patógenos periodontales tienen varios factores patogénicos que infligen daño directo o indirecto en el tejido periodontal, incluyendo factores relacionados con adhesión, proteinasas y toxinas, sustancias que actúan como toxinas, productos metabólicos y similares. Los ejemplos específicos incluyen endotoxinas (LPSI), colagenasas, enzimas similares a tripsina, enzimas supresoras de fibroblastos y otras enzimas destructivas, lecocitotoxinas, estreptolisina, sulfuro de hidrógeno, ácidos grasos y otras toxinas celulares así como adhesión física por medio de cilios largos al epitelio de la mucosa, glóbulos rojos de la sangre y otras bacterias. Las endotoxinas en particular tienen numerosos efectos incluyendo la activación de osteoclastos (fomento de la absorción del hueso alveolar), daño a fibroblastos y fomento de reacciones inmunopatológicas (daño a la circulación de tejido periodontal). El "nuevo lactobacilo" (FERM BP-10059, FERM P-19443) no sólo bloquea la proliferación de patógenos periodontales y actúa para debilitar su patogenicidad, sino que también convierte y detoxifica algunas de las toxinas producidas por los patógenos periodontales.

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Ejemplo 14

Se cultivaron células de patógenos periodontales durante 120 horas de forma anaerobia a 37ºC en caldo GAM modificado, se recogieron mediante centrifugación, se resuspendieron en solución salina fisiológica y se lavaron tres veces mediante centrifugación. Después se resuspendieron uniformemente en cinco veces la cantidad de agua y se enfriaron a 0ºC, y se añadió la misma cantidad de una solución acuosa helada de ácido tricloroacético 0,5 N y se dejó durante 3 horas a 0ºC. Se eliminó después el residuo de cuerpos celulares mediante centrifugación, se añadieron 2 equivalentes volúmenes de etanol frio al sobrenadante, y se centrifugó el precipitado. El precipitado se lavó con una pequeña cantidad de etanol y después con éter, produciendo una endotoxina en forma de polvo blanco. Se impregnó un disco con 5 mg de esta endotoxina y se secó para preparar un disco de sensibilidad. A continuación se aplicaron la cepa estándar de L. casei ATCC 393 y el "nuevo lactobacilo" (FERM BP-10059, FERM P-19443) a medio de placa BCP que contenía 2,5 g de extracto de levadura, 5 g de peptona, 1 g de glucosa, 0,1 g de L-cisteína, 1 g de polisorbato 80 y 0,06 g de BCP por litro, se colocó el disco de sensibilidad preparado anteriormente en el centro del medio, y se cultivaron las bacterias de forma anaerobia durante 48 horas a 37ºC. Como resultado, el crecimiento de ATCC393 se bloqueó a 12 mm del borde del disco, mientras que FERM BP-10059 (FERM P-19443) creció prolíficamente en el borde del disco. Esto indica que FERM BP-10059 (FERM P-19443) estaba incorporando estas endotoxinas en sus células como factores de crecimiento similares a vitaminas. Además, el "nuevo lactobacilo" (FERM BP-10059, FERM P-19443) tiene la capacidad de disminuir agresivamente compuestos odoríferos de azufre tales como ácidos grasos y sulfuro de hidrógeno, y su proliferación se estimula mediante la adición de estas sustancias.

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Ejemplo 15

Se subdividieron tres grupos de 15 pacientes que padecían respectivamente colitis aguda, cistitis aguda y conjuntivitis, enfermedades producidas por bacterias similares y que tienen síntomas similares, cada uno en 3 subgrupos de 5 pacientes cada uno. En cada grupo, el subgrupo A se trató durante 5 días con 1000 mg/días de antibióticos solo, el subgrupo B se trató durante 5 días con 500 mg/día de antibióticos y durante 10 días con 2 g/día (5 x 10^{10} células/día) de células liofilizadas de la especie de Lactobacillus casei resistente a antibióticos de la presente invención (FERM BP-10059, FERM P-19443) producido mediante los métodos del ejemplo de producción 1, y el subgrupo C se trató primero con 1000 mg/día de antibióticos solo, y una vez que los síntomas agudos habían disminuido se paró el antibiótico (normalmente de 2 a 3 días) y el grupo se trató entonces como el subgrupo B durante 7 días con 2 g/día de células bacterianas liofilizadas. Los efectos medios del tratamiento para cada grupo a lo largo de 10 días se muestran en la tabla 25. Como está claro de la tabla 25, el uso de la preparación de lactobacilo de la presente invención junto con la administración de antibióticos convencionales para el tratamiento de infección aguda o la administración de la preparación de lactobacilo de la presente invención después de la administración de antibióticos ofrece grandes ventajas, especialmente a la luz de los problemas de resistencia a fármacos encontrados con la terapia convencional usando sólo antibióticos, incluyendo (a) permitir que la dosis de antibiótico se reduzca a la mitad, (b) permitir que la carga sobre los pacientes se reduzca mucho acortando el tiempo requerido para reducir, mejorar y eliminar los síntomas sin virtualmente efectos secundarios y (c) evitar tales problemas como alteración de la flora intestinal y sustitución microbiana. Para infecciones agudas, los resultados son similares (con algunas diferencias en patógenos y síntomas) a los resultados terapéuticos alcanzados con la especie original de Lactobacillus casei en el ejemplo comparativo 1 más adelante.

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(Tabla pasa a página siguiente)

TABLA 25 Efectos terapéuticos de la especie de Lactobacillus casei de la presente invención contra infección aguda

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Ejemplo comparativo 1

Como en el ejemplo 15, se dividieron cada uno de tres grupos de 15 pacientes que padecían respectivamente colitis aguda, cistitis aguda y conjuntivitis, enfermedades causadas por bacterias similares y que tienen síntomas similares, en 3 subgrupos de 5 pacientes cada uno. En cada grupo, el subgrupo A se trató durante 5 días con 1000 mg/día de antibióticos solo, el subgrupo B se trató durante 5 días con 500 mg/día de antibióticos y durante 10 días con 2 g/día (5 x 10^{9} células/día) de células liofilizadas de FERM BP-6972, una de las especies de Lactobacillus casei originales resistentes a antibióticos, que se produjo mediante los métodos del ejemplo de producción 1, y el subgrupo C se trató primero con 1000 mg/día de antibióticos solo, y una vez que los síntomas agudos habían disminuido se paró el antibiótico (normalmente de 2 a 3 días) y el grupo se trató entonces como el subgrupo B durante 7 días con 2 g/día de células bacterianas liofilizadas. Los efectos medios del tratamiento para cada grupo a lo largo de 10 días se muestran en la tabla 26. Este ejemplo comparativo corresponde al ejemplo de ensayo 1 (Tabla 6) de la solicitud de patente japonesa accesible al público No. 2001-333766

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TABLA 26 Efectos terapéuticos de la especie original de Lactobacillus casei contra infección aguda

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Existen muchas teorías respecto al mecanismo de aparición de la periodontitis, pero el consenso es que se produce como una afección inflamatoria crónica causada por una acumulación de placa. La placa es una agregación de muchos tipos de bacterias que producen toxinas que causan inflamación de las encías, y si esto progresa las bolsas periodontales entre los dientes y las encías se abren, se produce halitosis, y el tejido de apoyo de los dientes incluyendo el ligamento periodontal y el hueso alveolar se destruye. El 80% de los adultos padece periodontitis en algún grado, que se puede extender a los dientes circundantes y si no se trata produce pérdida de dientes, y se reconoce como un modelo típico de una enfermedad que aún es difícil de curar. Los patógenos principales incluyen Poryphyromonas gingivalis, Actinobacillus actinomycetemcomitans, Provoutel intermedia, Prevotella intermedia y similares, que no producen toxinas como las bacterias que envenenan los alimentos de modo que la enfermedad progresa con pocos síntomas subjetivos y en muchos casos es demasiado tarde para el tratamiento una vez que se diagnostica. Además, la cavidad bucal se contamina constantemente por bacterias y proporciona un entorno adecuado para su proliferación, de modo que el problema se sigue produciendo, y por desgracia hay pocos dentistas que tratan la periodontitis de forma fiable. Los síntomas que se producen cuando se desarrollan lesiones profundas en las encías y el pus sigue filtrándose son similares a las de las hemorroides, sugiriendo algún tipo de asociación profunda en la aparición de infecciones intratables a la entrada y salida del aparato digestivo. La prevención y tratamiento de la periodontitis básicamente consiste en lo siguiente: (1) Se eliminan la placa y el sarro (residuos de placa) tanto como sea posible mediante cepillado, o más recientemente se destruye y elimina eficazmente con ultrasonidos y láser o se disuelve con productos químicos especiales (eliminación del lecho bacteriano). (2) Como desinfectante, se administra una preparación antibiótica o enzimática antiinflamatoria mediante inyección en la bolsa periodontal hasta que el área inflamada mejora, en un esfuerzo para suprimir la inflamación. (3) Sin embargo, cuando el sitio de la inflamación es profundo y los tratamientos (1) y (2) anteriores no producen resultados favorables por sí mismos, el sitio de inflamación o daño se elimina mediante cirugía. (4) Posteriormente, las encías se cosen o reconstruyen con material artificial. Se han hecho intentos recientes para estimular la regeneración de tejido periodontal inyectando fármacos que tienen proteínas formadoras de esmalte como componentes principales. (5) Cuando todos los tratamientos son ineficaces, los dientes se sacan y se reconstruyen. Es decir, el fin es controlar la inflamación de las encías, detener el progreso de la periodontitis, regenerar el tejido periodontal perdido, mejorar la apariencia externa y mantener el tejido recién
recuperado.

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Ejemplo 16

Se dividieron 20 pacientes de periodontitis en 4 grupos (A a D) con cinco personas en cada grupo, y una vez que se había eliminado tanta placa y sarro como fue posible de todos los pacientes mediante raspado y alisado radicular, se llenaron las bolsas periodontales con una pomada antibiótica o con células bacterianas liofilizadas de la presente invención preparadas en un gel con una pequeña cantidad de agua. En el grupo A, se usó un antibiótico solo o junto con una preparación enzimática antiinflamatoria según fuera necesario. En el grupo B, se administró una preparación que consistía en una mezcla de cantidades iguales de células bacterianas resistentes a antibiótico liofilizadas preparadas en el ejemplo de producción 1 y la preparación bacteriana resistente a antibiótico preparada en el ejemplo de producción 3 junto con un antibiótico. En el grupo C, inicialmente se administró un antibiótico o preparación enzimática antiinflamatoria, seguido por la preparación bacteriana mencionada anteriormente. En el grupo D, no se usó antibiótico desde el principio, y sólo se administró la preparación bacteriana. Para fines de tratamiento se aislaron las bacterias causantes principales y se ensayó la sensibilidad a fármacos, y se seleccionó el antibiótico apropiado en cada caso basado en los resultados. Los resultados se muestran en las tablas 27 y 28. Como se puede ver de las tablas 27 y 28, la administración de la preparación de lactobacilo de la presente invención sola o junto con un antibiótico produjo la eliminación de las bacterias causantes en menos de medio mes incluso en casos de periodontitis para los que se esperaba que los antibióticos o enzimas antiinflamatorias solos tuvieran poco efecto, y con 1 a 2 meses de administración continua se alcanzaron efectos que nunca se podrían haber alcanzado con terapia convencional, incluyendo la eliminación del mal aliento y mejoras en el estado de las encías, el interior de las bolsas periodontales y dientes sueltos, aunque con diferencias individuales. De esta manera, los efectos terapéuticos de la cepa original de Lactobacillus casei como se describen en el ejemplo comparativo 2 más adelante se han mejorado más, y se deben hacer notar los efectos drásticos sobre el espesor y firmeza del tejido de la encía de las bolsas periodontales.

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Ejemplo comparativo 2

Se dividieron 8 pacientes con periodontitis en 4 grupos A a D, 2 pacientes por grupo, y al grupo A se le dio antibióticos solo o junto con una preparación enzimática antiinflamatoria dependiendo de los síntomas. En el grupo B, se administró una preparación que consistía en una mezcla de cantidades iguales de células bacterianas liofilizadas de la especie original de Lactobacillus casei producida mediante los métodos del ejemplo de producción 1 y una preparación bacteriana producida mediante los métodos del ejemplo de producción 3 (ambas resistentes a antibióticos) junto con un antibiótico. En el grupo C, se administró inicialmente un antibiótico o una preparación enzimática antiinflamatoria, seguido por la preparación bacteriana anteriormente mencionada. En el grupo D, no se usó antibiótico desde el principio, y sólo se administró la preparación bacteriana. Este ejemplo comparativo corresponde al ejemplo de ensayo 2 usando pacientes periodontales (pacientes que sufren absceso alveolar y gingivitis) en la solicitud de patente japonesa accesible al público No. 2001-333766, y los resultados se dan en la tabla 29 (correspondiente a parte de la tablas 7 a 10 en la solicitud de patente japonesa accesible al público No. 2001-333766).

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(Tabla pasa a página siguiente)

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Ejemplo 17

Se realizó un ensayo de tratamiento para las infecciones crónicas sinusitis crónica, bronquitis crónica y úlceras de decúbito. Al grupo A se le dio antibióticos solos o junto con una preparación enzimática antiinflamatoria dependiendo de los síntomas. En casos de sinusitis crónica, los senos en general se lavaron con una solución acuosa de una preparación de antibiótico suspendido, mientras que en los casos de úlceras de decúbito se aplicó una preparación de antibiótico al área afectada después de una limpieza. Los resultados del tratamiento se muestran en la tabla 30. En el grupo B, se administró una preparación que consistía en una mezcla de cantidades iguales de las células bacterianas liofilizadas (FERM BP-10059, FERM P-19443) producidas en el ejemplo de producción 1 y la preparación de lactobacilo (FERM BP-10059, FERM P-19443) producida en el ejemplo de producción 3 junto con un antibiótico. En casos de sinusitis crónica, el método básico de administrar la preparación de lactobacilo fue mediante lavado nasal usando una suspensión de 2 g de células bacterianas liofilizadas en 1 litro de agua templada. En casos de úlceras de decúbito, las células liofilizadas se enjuagaron o se dispersaron sobre las úlceras de decúbito. Los resultados del tratamiento se muestran en la tabla 31. En el grupo C, inicialmente se administró un antibiótico, solo o junto con una preparación enzimática antiinflamatoria, seguido por la preparación de lactobacilo anteriormente mencionada. Los resultados del tratamiento se muestran en la tabla 32. En el grupo D, no se usó antibiótico desde el principio, y sólo se administró la preparación de lactobacilo. Los resultados del tratamiento se muestran en la tabla 33. Para fines de tratamiento se aislaron las bacterias principales causantes de las infecciones crónicas y se ensayó su sensibilidad a fármacos, y se seleccionó el antibiótico apropiado en cada caso basado en los resultados. Como se puede ver de las tablas 30 a 33, se obtuvieron efectos terapéuticos fuertes usando la preparación de lactobacilo de la presente invención para infecciones crónicas que son difíciles de curar con antibióticos. El uso combinado de un antibiótico con la preparación de lactobacilo de la presente invención, que tiene resistencia a antibióticos, fue particularmente eficaz. Los resultados fueron incluso mejores que los obtenidos con la especie original de Lactobacillus casei como se describe posteriormente.

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(Tabla pasa a página siguiente)

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Ejemplo comparativo 3

Se dividieron 8 pacientes de sinusitis crónica y 8 pacientes de bronquitis crónica cada uno en 4 grupos A a D, dos personas por grupo, y al grupo A se le dio un antibiótico solo o junto con una preparación enzimática antiinflamatoria dependiendo de los síntomas. En el grupo B, se administró una preparación que consistía en una mezcla de cantidades iguales de las células bacterianas liofilizadas de la especie original de Lactobacillus casei producidas mediante los métodos del ejemplo de producción 1 y una preparación de lactobacilo producida mediante los métodos del ejemplo de producción 3 junto con un antibiótico. En el grupo C, inicialmente se administró un antibiótico, solo o junto con una preparación enzimática antiinflamatoria, seguido por la preparación de lactobacilo anteriormente mencionada. En el grupo D, no se usó antibiótico desde el principio, y sólo se administró la preparación de lactobacilo. Este ejemplo comparativo corresponde al ejemplo de ensayo 2 para sinusitis crónica y bronquitis crónica en la solicitud de patente japonesa accesible al público No. 2001-333766, y los resultados se dan en las tablas 34 y 35 (correspondientes a parte de las tablas 7 a 10 en la solicitud de patente japonesa accesible al público No. 2001-333766).

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(Tabla pasa a página siguiente)

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Ejemplo 18

Se administraron 2 g por día de 20 g de una preparación de células bacterianas liofilizadas (FERM BP-6971) producida mediante los métodos del ejemplo de producción 2 mezclada con 100 g de lactosa a pacientes que sufrían afecciones crónicas que no eran infecciones, incluyendo estreñimiento, diarrea, diabetes, un trastorno no infeccioso, síndrome de fatiga crónica, dermatitis atópica, presión sanguínea baja, neurosis y presión sanguínea alta. La dosis administrada de bacterias fue 2 g/día a 1 x 10^{10} células/g. En un ensayo de tratamiento de la preparación de lactobacilo de la presente invención (FERM BP-10059, FERM P-19443), la preparación se administró durante 2 meses a 10 pacientes que sufría cada uno síntomas iguales o similares, y se muestra la mejora media en la tabla 36. Alrededor del 15% de los pacientes no mostraron mejora en los síntomas incluso después de recibir la preparación de lactobacilo de la presente invención, pero en ningún caso empeoraron los síntomas. También se demostró la eficacia a varios grados para muchas afecciones crónicas diferentes de las mostradas en la tabla 36, incluyendo arterioesclerosis, gota, obesidad y hepatitis crónica. Como está claro de la tabla 36, si se alcanzan los efectos de la preparación de lactobacilo al 100% sin interferencia, aumenta el poder de curación natural del cuerpo, y se restablece la vitalidad. Por ejemplo, si se limpian los intestinos mediante administración interna, la sangre se limpia de forma natural de modo que hormonas, enzimas, anticuerpos, sustancias inmunes y otras sustancias esenciales se transportan libremente por todo el cuerpo, haciendo el metabolismo más fluido, mejorando funciones sistémicas y permitiendo una vida no afectada por la enfermedad. En verdad, la tesis de la "prolongación de la vida" de Metchinikoff se ha realizado por fin después de un siglo.

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(Tabla pasa a página siguiente)

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Como se muestra en el ejemplo 16, se alcanzaron buenos efectos mediante la administración adecuada de este lactobacilo en el tratamiento de periodontitis, pero desgraciadamente esto no se puedo denominar cura dependiendo de la evolución de la periodontitis. Por consiguiente, los inventores mostraron como resultado de investigación exhaustiva que los efectos se podrían mejorar mediante la aplicación de las características del desinfectante bactericida como pretratamiento, con los resultados que se explican a continuación.

Ejemplo 19

Se lavaron las áreas afectadas de 5 pacientes que sufrían periodontitis superficial con "este desinfectante bactericida", y después se trataron mediante inyección de la "nueva preparación de lactobacilo" producido en el ejemplo de producción 4 en el área afectada. Los resultados se muestran en la tabla 37.

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Ejemplo 20

Se trataron cinco pacientes que sufrían periodontitis superficial desinfectando primero las áreas afectadas con "este desinfectante bactericida", y después inyectando una "nueva preparación de lactobacilo que contiene antibióticos" producido en el ejemplo de producción 5 en las áreas afectadas. Los resultados se muestran en la tabla 38.

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Ejemplo comparativo 4

Como comparación, se trataron 5 pacientes que cada uno sufría periodontitis con "este desinfectante bactericida", la "nueva preparación de lactobacilo" producido en el ejemplo de producción 4, con la "nueva preparación de lactobacilo que contiene antibióticos" producido en el ejemplo de producción 5 y con terapia convencional. Los resultados se muestran en la tabla 39.

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TABLA 39 Resultados del tratamiento para periodontitis superficial usando terapia convencional

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Cuando la periodontitis era superficial, el color, hinchazón y elasticidad de encías se recuperó en 2 a 3 semanas de tratamiento con terapia convencional y las bolsas se hicieron más superficiales pero nunca se cerraron. Por el contrario, cuando se combinó la desinfección con "este desinfectante bactericida" con la "nueva preparación de lactobacilo" de la presente invención, la mejora fue rápida desde el inicio del tratamiento, la hinchazón disminuyó rápidamente, el color y la elasticidad de las encías se recuperaron en gran parte en alrededor de 2 semanas y las bolsas se hicieron gradualmente más superficiales, cerrándose en alrededor de un mes para una cura completa.

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Ejemplo 21

Se trataron cinco pacientes que sufrían periodontitis intermedia desinfectando primero las áreas afectadas con "este desinfectante bactericida" e inyectando después la "nueva preparación de lactobacilo" producida en el ejemplo de producción 4. Los resultados se muestran en la tabla 40.

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Ejemplo 22

Se trataron cinco pacientes que sufrían periodontitis intermedia desinfectando primero las áreas afectadas con "este desinfectante bactericida" e inyectando después la "nueva preparación de lactobacilo que contenía antibióticos" producida en el ejemplo de producción 5. Los resultados se muestran en la tabla 41.

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TABLA 41 Resultados del tratamiento de periodontitis intermedia mediante una combinación de desinfección con "este desinfectante bactericida" y la "nueva preparación de lactobacilo" de la presente invención ("nueva preparación de lactobacilo" usada como preparación de lactobacilo)

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Ejemplo comparativo 5

Como comparación, se trataron 5 pacientes cada uno con periodontitis intermedia con "este desinfectante bactericida", la "nueva preparación de lactobacilo" producida en el ejemplo de producción 4, la "nueva preparación de lactobacilo que contenía antibióticos" producida en el ejemplo de producción 5 y terapia convencional. Los resultados se muestran en la tabla 42.

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TABLA 42 Resultados del tratamiento para periodontitis intermedia usando terapia convencional

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Cuando la periodontitis era intermedia, la hinchazón disminuyó pero el color y la elasticidad eran aún insatisfactorios con terapia convencional, y mientras las bolsas se hicieron algo más superficiales y estrechas, el cambio no fue muy grande. Por el contrario, cuando se combinó la desinfección con "este desinfectante bactericida" con la "nueva preparación de lactobacilo" de la presente invención, aunque la evolución hacia una cura era más lenta que en el caso de periodontitis superficial, había mejora clara y casi una cura completa en 2 a 3 meses.

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Ejemplo 23

Se trataron cinco pacientes que sufrían periodontitis profunda desinfectando primero las áreas afectadas con "este desinfectante bactericida" e inyectando después la "nueva preparación de lactobacilo" producida en el ejemplo de producción 4. Los resultados se muestran en la tabla 43.

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TABLA 43 Resultados del tratamiento de periodontitis profunda mediante una combinación de desinfección con "este desinfectante bactericida" y la "nueva preparación de lactobacilo" de la presente invención ("nueva preparación de lactobacilo" usada como preparación de lactobacilo)

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Ejemplo 24

Se trataron cinco pacientes que sufrían periodontitis profunda desinfectando primero las áreas afectadas con "este desinfectante bactericida" e inyectando después la "nueva preparación de lactobacilo que contenía antibióticos" producida en el ejemplo de producción 5. Los resultados se muestran en la tabla 44.

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TABLA 44 Resultados del tratamiento de periodontitis profunda mediante una combinación de desinfección con "este desinfectante bactericida" y la "nueva preparación de lactobacilo" de la presente invención ("nueva preparación de lactobacilo que contenía antibióticos" usada como preparación de lactobacilo)

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Ejemplo comparativo 6

Como comparación, se trataron 5 pacientes cada uno con periodontitis profunda con "este desinfectante bactericida", la "nueva preparación de lactobacilo" producida en el ejemplo de producción 4, la "nueva preparación de lactobacilo que contenía antibióticos" producida en el ejemplo de producción 5 y terapia convencional. Los resultados se muestran en la tabla 45.

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TABLA 45 Resultados del tratamiento para periodontitis profunda usando terapia convencional

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Cuando la inflamación era profunda, la hinchazón, color, elasticidad y otros síntomas de las encías se recuperaron ligeramente con terapia convencional, pero las bolsas virtualmente no cambiaron y el statu quo apenas se mantuvo. Por el contrario, cuando se combinó la desinfección con "este desinfectante bactericida" con la "nueva preparación de lactobacilo" de la presente invención, las encías empezaron a mejorar después de alrededor de 2 semanas de terapia con diferencias individuales, y la salud se recuperó en su mayor parte en alrededor de 2 meses. Las bolsas disminuyeron lenta pero continuamente, a unos pocos mm en alrededor de 3 meses. Algunos pacientes permanecieron en el mismo estado, mientras que en otros casos las bolsas finalmente se cerraron para una cura completa.

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Ejemplo 25

Se trataron cinco pacientes que sufrían periodontitis en fase final desinfectando primero las áreas afectadas con "este desinfectante bactericida" e inyectando después la "nueva preparación de lactobacilo" producida en el ejemplo de producción 4. Los resultados se muestran en la tabla 46.

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TABLA 46 Resultados del tratamiento de periodontitis en fase final mediante una combinación de desinfección con "este desinfectante bactericida" y la "nueva preparación de lactobacilo" de la presente invención ("nueva preparación de lactobacilo" usada como preparación de lactobacilo)

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Ejemplo 26

Se trataron cinco pacientes que sufrían periodontitis en fase final desinfectando primero las áreas afectadas con "este desinfectante bactericida" e inyectando después la "nueva preparación de lactobacilo que contenía antibióticos" producida en el ejemplo de producción 5. Los resultados se muestran en la tabla 47.

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TABLA 47 Resultados del tratamiento de periodontitis en fase final mediante una combinación de desinfección con "este desinfectante bactericida" y la "nueva preparación de lactobacilo" de la presente invención ("nueva preparación de lactobacilo que contenía antibióticos" usada como preparación de lactobacilo)

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Ejemplo comparativo 7

Se trataron cinco pacientes con periodontitis de fase final con regeneración de tejidos usando Emdogain, que ha atraído interés como una terapia de vanguardia existente. Los resultados se muestran en la tabla 48.

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TABLA 48 Resultados del tratamiento de periodontitis de fase final usando regeneración guiada de tejidos

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Cuando la periodontitis estaba en la fase final, parecía ser demasiado tarde para la terapia convencional, y por último se tuvieron que extraer los dientes. Aunque los dientes se podían haber apoyado quirúrgicamente sin sacarlos, la enfermedad entonces reaparecía, y en muchos casos la extracción sólo se retrasaba. Por el contrario, con una combinación de "este desinfectante bactericida" y la "nueva preparación de lactobacilo" de la presente invención era posible eliminar los patógenos y retirar los factores causantes, produciendo un efecto sinergístico que produjo regeneración de tejido de modo que en el 70 al 80% de los casos la extracción no fue necesaria y los dientes se salvaron incluso si no se alcanzó una cura completa.

Ejemplo 27

Se dividieron lechones Landrace de dos meses de edad con un peso medio de 18 kg en 3 grupos de 10 lechones machos y 10 hembras por grupo, y se criaron en jaulas para cerdos individuales, sin ventanas, ventiladas mediante ventiladores. El pienso era pienso estándar de cerdo (Nosan Corporation), suministrado, con pienso siempre disponible en el contenedor de pienso, y el agua se suministró automáticamente mediante una taza de agua. Al grupo control se le dio pienso preparado con el Lactobacillus casei original (FERM BP-6971), mientras que al grupo de prueba se le dio pienso preparado con el Lactobacillus casei de la presente invención producido en el ejemplo de producción 3 (FERM BP-10059, FERM P-19443), 1 x 10^{6} células húmedas/g de pienso en cada caso, y no se dio lactobacilo al grupo sin tratar. Después de criarlos durante 1 mes en estas condiciones de crianza, como se muestra en la tabla 49 los lechones en el grupo de prueba que recibieron el Lactobacillus casei de la presente invención tenían mejores pelajes que los del grupo sin tratar, y pesaban una media de 4,8 kg más, lo que indica un efecto de fomento del crecimiento evidente. No había signos de diarrea u otros síntomas comunes en lechones, y no mostraron signos de enfermedad después del ensayo. También hubo menos olor fecal. También se obtuvieron buenos resultados en el grupo control, que se había tratado con la especie original Lactobacillus casei, pero en menor grado que en el grupo de prueba. En un ensayo de textura de carne por un especialista la calidad en el grupo de prueba se evaluó como extremadamente buena, con una gran cantidad de carne roja y una textura elástica.

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TABLA 49 Resultados del ensayo de alimentación de lechones

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Ejemplo 28

Se precriaron durante 3 días 30 pollos machos y 30 hembras recién nacidos (peso medio 43 g) de una variedad de pollo para asar especializada (Arbor Acre) y se dividieron en tres grupos con números iguales de machos y hembras en cada grupo, y se confirmó que no había variación en el peso corporal con un peso medio de 50 g en cada grupo. Estos se alimentaron con pienso inicial estándar para engorde de pollos de asar (Kyodo Shiryo, Golden G) durante 4 semanas. La crianza fue en jaulas hasta las 4 semanas de edad (temperatura de aislamiento 35ºC \pm 2ºC). Al grupo control se le dieron células liofilizadas de la especie original Lactobacillus casei (FERM BP-6971) y al grupo de prueba se le dieron células liofilizadas de la especie de Lactobacillus casei de la presente invención producidas en el ejemplo de producción 3 (FERM BP-10059, FERM P-19443) mezcladas con pienso estándar a 2 x 10^{7} células/g de pienso en cada caso. Al grupo sin tratar no se le dio lactobacilo. Se suministró agua libremente mediante un alimentador de agua, mientras que el pienso se suministró de forma continua con el pienso siempre disponible en el contenedor del pienso. Los resultados se muestran en la tabla 50, y muestra claramente que como resultado de la crianza durante 4 semanas el grupo control mostró alrededor del 15% y el grupo de prueba alrededor del 27% mayor ganancia de peso que el grupo sin tratar. No se produjo enfermedad en el grupo de prueba durante el periodo de crianza, sin síntomas de diarrea y una reducción en el olor fecal. Esto es evidencia adicional de que los efectos de una preparación de lactobacilo usando la especie de Lactobacillus casei de la presente invención son mucho mejores que los de una preparación de lactobacilo usando la especie original Lactobacillus casei.

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TABLA 50 Resultados del ensayo de alimentación de pollos de asar

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Ejemplo 29

Usando 4 jaulas flotantes de malla pequeña poblados con 100 caballas jóvenes con un peso medio de 65 g, se asignaron 3 jaulas de peces a grupos de prueba y 1 al grupo sin tratar. A los peces se les dieron pellas húmedas que consistían en una mezcla 1:1 de sardinas picadas y pienso fórmula de dorado comercial (Nisshin Feed, "Itomate"). En el grupo de prueba 1, el pienso se mezcló con 1 x 10^{9} células/g de pienso con la especie de Lactobacillus casei de la presente invención (FERM BP-10059, FERM P-19443) producidas en el ejemplo de producción 2, y se dieron inmediatamente. En el grupo de prueba 2, se añadió al pienso 0,02 ml/g de una solución de cultivo de la misma especie de Lactobacillus casei (FERM BP-10059, FERM P-19443) de la presente invención producida en el ejemplo de producción 2. En el grupo de prueba 3, se añadió al pienso 0,02 ml/g de un filtrado de cultivo de la misma especie de Lactobacillus casei (FERM BP-10059, FERM P-19443) de la presente invención producida en el ejemplo de producción 2. La temperatura del agua durante el periodo de prueba fue de 20ºC a 22ºC. Los resultados se muestran en la tabla 51. Como se puede ver de la tabla 51, las caballas en los grupos de prueba crecieron mejor que aquellas en el grupo sin tratar, con menos mortalidad durante el periodo de ensayo. De los grupos de prueba, los resultados fueron mejores para el grupo de prueba 2, que recibió una solución de cultivo de la especie de Lactobacillus casei de la presente invención.

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TABLA 51 Resultados del ensayo de alimentación de caballas usando la preparación de lactobacilo de la presente invención

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Ejemplo comparativo 8

Se realizó el mismo ensayo que en el ejemplo 29 usando la especie original de Lactobacillus casei (FERM BP-6971), con los resultados mostrados en la tabla 52. Como se muestra en la tabla 52, los resultados no fueron tan buenos como los obtenidos con la especie de Lactobacillus casei de la presente invención.

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TABLA 52 Resultados del ensayo de alimentación de caballas usando la preparación de lactobacilo de la especie original de Lactobacillus casei

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Ejemplo 30

Se realizó un ensayo de alimentación usando lombrices rojas, que son valiosas como pienso para pájaros y cebos de pesca. Se prepararon 4 cajas de madera de 600 mm de anchura x 400 mm de profundidad x 150 mm de altura y se llenaron hasta el 80% con una mezcla de 1 kg de moho de hojas mezclado con 0,5 kg de levadura de panadería cruda, después de lo cual se colocaron en cada caja 100 lombrices rojas jóvenes con una longitud media de 10 mm y un peso medio de 40 mg. Estas se criaron en una habitación ajustada a una temperatura ambiente de 25ºC, con 10 lux de iluminación de día y sin luz por la noche. El grupo de prueba 1 se roció con 0,01 g de cuerpos celulares húmedos de la especie de Lactobacillus casei de la presente invención (FERM BP-10059, FERM P-19443) producidos en el ejemplo de producción 2. El grupo de prueba 2 se roció con 200 ml de una solución de cultivo de la especie de Lactobacillus casei de la presente invención (FERM BP-10059, FERM P-19443) producida en el ejemplo de producción 2 diluida 100 veces con agua, y el grupo de prueba 3 se roció con 200 ml de un filtrado de cultivo de la especie de Lactobacillus casei de la presente invención (FERM BP-10059, FERM P-19443) producida en el ejemplo de producción 2. Esta operación se realizó una vez cada 10 días, y el grupo sin tratar se roció con agua. Cada caja de crianza se roció con una cantidad adecuada de agua en días alternos de modo que la tierra no se secara. A las lombrices se les dio levadura seca y chlorella como pienso una vez a la semana, 1 g de cada al principio de la crianza aumentando un 20% cada semana. Los resultados de la crianza después de tres meses se muestran en la tabla 53. Como se muestra en la tabla 53, el rendimiento fue mejor en los grupos de prueba 1 y 2 que en el grupo sin tratar, y los pesos corporales fueron alrededor del 20% más. Los resultados para el grupo de prueba 3 fueron intermedios.

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TABLA 53 Resultados del ensayo de alimentación de lombrices rojas

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Cuando también se realizaron ensayos de alimentación con escarabajos jóvenes, gusanos de seda y similares así como con lombrices rojas, aquellos en los grupos de prueba crecieron más deprisa y más. Además, los capullos y adultos también fueron mayores. También se obtuvieron buenos resultados cuando los ensayos anteriormente mencionados se realizaron usando la especie original de Lactobacillus casei, pero las tasas de crecimiento y rendimientos fueron del 5 al 10% menores que con la especie de Lactobacillus casei de la presente invención.

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Ejemplo 31

Se usaron pepinos para ensayar la prevención y tratamiento del oídio y mildiu lanoso, que son problemas comunes en el cultivo de invernadero. En el oídio el hongo invade desde la superficie de las hojas y tallos, formando primero puntos blancos, pero según progresan los síntomas las superficies de la hoja aparecen como salpicadas con un polvo blanco, volviéndose gradualmente gris. El crecimiento de la hoja se para, y en el caso de los pepinos sólo se recogen pepinos pequeños, finos y duros. En el mildiu lanoso primero aparecen puntos grisáceo-blancos similares a moho en la parte inferior de las hojas, formando gradualmente marcas irregulares, sucias que siguen extendiéndose en las superficies de las hojas. Las hojas finalmente se vuelven amarillo-marrones y pegajosas y se pudren de modo que no puede esperar cosecha.

Se separó completamente con un tabique una sección de un invernadero de pepinos, y se roció 1 g de células liofilizadas de la especie de Lactobacillus casei de la presente invención (FERM BP-10059, FERM P-19443) producidas en el ejemplo de producción 1 mezcladas con 1 litro de agua (2 x 10^{7} células/ml) completamente en las hojas y tallos antes de florecer. Una semana después, se aplicaron esporas de oído (Sphaeratheca fuliginea) y mildiu lanoso (Pseudopernospora cubensis) en cantidades suficientes para producir las enfermedades, pero en lugar de enfermar las plantas florecieron y los pepinos resultantes eran si acaso mejores de lo normal. Todas las plantas de pepino a las que se aplicaron las esporas sin aplicación previa del lactobacilo de la presente invención desarrollaron las enfermedades. Algunas plantas de pepino (del 10 al 20% en total) rociadas con los cuerpos celulares liofilizados obtenidos de la especie original de Lactobacillus casei (FERM BP-6971) desarrollaron la enfermedad, y en este caso no se pudieron recoger pepinos.

Cuando las plantas de pepino infectadas como se describe anteriormente se rociaron completamente en la fase más temprana de la infección con una solución (1 x 10^{8} células/ml) de 5 g de células liofilizadas de la especie de Lactobacillus casei de la presente invención (FERM BP-10059, FERM P-19443) producidas en el ejemplo de producción 1 resuspendidas en 1 litro de agua, y después se volvieron a rociar con la misma cantidad de nuevo una semana más tarde, las lesiones desaparecieron gradualmente, la floración fue normal, y se obtuvieron buenos pepinos. Cuando se aplicó la especie original de Lactobacillus casei (FERM BP-6971) de la misma manera, alrededor del 50% de las plantas mejoraron, pero en el otro 50% las enfermedades progresaron y no se pudieron recoger pepinos.

Se realizaron ensayos similares usando plantas cultivadas diferentes de pepinos, incluyendo patatas, pimientos, calabazas y similares, y en todos los casos se mostró que la aplicación de células liofilizadas de la especie de Lactobacillus casei de la presente invención fue eficaz. Por ejemplo, se obtuvieron buenos resultados cuando se redujo la aplicación de productos químicos agrícolas tales como tiopanato de metilo al 3% (Nippon Soda, Topsin-M), y quinoxalina (Yashima Chemical, Morestan) de 1/2 a 1/3, y se aplicó después una cantidad adecuada de la preparación de lactobacilo de la presente invención.

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Ejemplo 32

Se prepararon cuatro semilleros de 600 mm de anchura x 400 mm de profundidad x 150 mm de altura, se mezclaron 20 g de fertilizante químico (NAC Co. #38, N: 8%, P: 5%, K: 5%) y 5 g de fosfato de magnesio fusionado con la capa más inferior de tierra en cada uno, y se añadió tierra que consistía en 10 g de cal de magnesio (NAC Co., mejorador de tierra que consiste en óxido de magnesio del 5 al 7% mezclada con cal muerta) a 10 L de una mezcla tierra de campo normal con hongo de hoja al 30% por encima hasta una profundidad de alrededor del 80%. A mediados de agosto, se plantaron 6 plántulas de fresas Allso en cada semillero, y empezando dos semanas después hasta mediados de diciembre, a todas las plantas de fresa en el semillero del grupo de prueba 1 se les dio fertilizante líquido cada semana y al mismo tiempo se rociaron totalmente con célula liofilizadas de la especie de Lactobacillus casei de la presente invención producidas en el ejemplo de producción 1 (FERM BP-10059, FERM P-19443) resuspendidas a 1 x 10^{7} células/ml en agua. Al grupo de prueba 2 se aplico una dilución de 200 veces de un cultivo líquido de la especie de Lactobacillus casei de la presente invención producido en el ejemplo de producción 1 (FERM BP-10059, FERM P-19443). Al grupo de prueba 3 se aplico una dilución de 200 veces de un filtrado de cultivo de la especie de Lactobacillus casei de la presente invención producido en el ejemplo de producción 1 (FERM BP-10059, FERM P-19443). Se aplicó agua sola al semillero sin tratar. En marzo del año siguiente, una vez que se habían desarrollado los capullos se aplicaron una vez por semana el fertilizante líquido y la preparación de lactobacilo mencionada anteriormente. Se recogieron gradualmente fresas rojas, maduras de 1 a 2 meses después de la floración. Los resultados se muestran en la tabla 54. Como se muestra en la tabla 54, las fresas de los grupos de prueba 1 y 2, que recibieron la preparación de lactobacilo de la presente invención, no sólo crecieron más deprisa, sino que se recogieron 200 g de fresas por planta. Además, se encontró que todas eran de primera calidad en términos de olor, color, sabor y tamaño. Por el contrario, se recogieron menos fresas en el grupo sin tratar, y eran de calidad media, inferior a las fresas de alta calidad en los grupos de prueba.

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TABLA 54

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Ejemplo 33

Se prepararon ocho semilleros de 600 mm de altura x 400 mm de profundidad x 150 mm de altura, se mezcló tierra de campo normal con hongo de hojas al 30%, y para el perejil japonés se añadieron 8 g de cal de magnesio (NAC Co., mejorador de tierra que consiste en óxido de magnesio del 5 al 7% mezclada con cal muerta) a 10 litros de esto, y 1 semana después la capa más inferior en 3 semilleros se fertilizó con 20 g de fertilizante químico (NAC Co. #38, N: 8%, P: 5%, K: 5%). Para las espinacas, se mezclaron bien 20 g de cal de magnesio con 20 g de fertilizante químico (NAC Co. #38, N: 8%, P: 5%, K: 5%) y se añadió a 3 semilleros. Se plantaron entonces las semillas a finales de septiembre en los respectivos semilleros. Cuando el perejil japonés y las espinacas brotaron se entresacaron de modo que las hojas no se solaparan, y una vez que las hojas principales empezaron a desarrollarse se fertilizaron una vez por semana con fertilizante líquido y se regaron de modo que la tierra no se secara. Cuando se aplicó el fertilizante líquido las plantas del grupo 1 se rociaron completamente al mismo tiempo con células liofilizadas de la especie de Lactobacillus casei de la presente invención (FERM BP-10059, FERM P-19443) producidas en el ejemplo de producción 2 resuspendidas a 1 x 10^{7} células/ml en agua. Las plantas del grupo de prueba 2 se rociaron de la misma manera con una dilución de 300 veces de un cultivo líquido de la especie de Lactobacillus casei de la presente invención (FERM BP-10059, FERM P-19443) producido en el ejemplo de producción 2. Las plantas del grupo de prueba 3 se rociaron con una dilución de 300 veces de un filtrado de cultivo de la especie de Lactobacillus casei de la presente invención (FERM BP-10059, FERM P-19443) producido en el ejemplo de producción 2. Se roció agua sola al grupo sin tratar. Los resultados para el perejil japonés se muestran en la tabla 55. Como se muestra en la tabla 55, las plantas en los grupos de prueba 1 y 2 que se trataron con la especie de Lactobacillus casei de la presente invención crecieron rápidamente, con hojas anchas, gruesas y blandas, y olían mucho mejor que el perejil japonés comercial crecido de forma hidropónica. Se recogió perejil japonés de calidad intermedia del grupo de prueba 3

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TABLA 55

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Los resultados para las espinacas se muestran en la tabla 56. Como se muestra en la tabla 56, en los grupos de prueba las raíces eran más rojas y firmes que en el grupo sin tratar, y se produjeron hojas de gran calidad verde profundo que eran grandes, gruesas y brillantes, que tenían una dulzura única. Algunas de las plantas en el grupo sin tratar desarrollaron enfermedad de manchas en las hojas (en la que aparecen manchas marrones en las hojas, se desarrollan mohos negruzco-marrones en las manchas y las plantas se marchitan), pero esto no sucedió en los grupos de tratamiento. También se realizaron ensayos comparativos usando verduras tales como repollo, perejil y apio, frutas tales como uvas y naranjas, basidiomicetos tales como setas, plantas ornamentales tales como potos y flores tales como claveles y en todos los casos se recogieron plantas de mayor calidad más rápidamente que en los grupos sin tratar, con poca aparición de enfermedades.

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TABLA 56 Resultados del ensayo de crecimiento de espinacas

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Ejemplo 34

Se compraron plántulas de menta (con 6 hojas), se mezcló tierra de campo con moho de hojas al 50%, se establecieron los grupos de prueba 1, 2 y 3 y un grupo sin tratar como en los ejemplos 15 y 16 anteriormente, y se roció la preparación de lactobacilo de la presente invención (FERM BP-10559, FERM P-19443) una vez a la semana. Las plantas se fertilizaron individualmente una vez al mes. Como resultado, la menta en los grupos de prueba 1, 2 y 3 tenía hojas más densas que en el grupo sin tratar, con un olor fuerte característicamente dulce. También se realizaron ensayos usando otras plantas aromáticas incluyendo manzanilla, salvia, lavanda y melisa, pero los olores característicos de las plantas aromáticas parecían más fuertes como en el caso de la menta. Los ensayos con hortalizas y plantas aromáticas anteriormente mencionados también se realizaron usando la especie original de Lactobacillus casei (FERM BP-6971), que se usó en la solicitud de patente japonesa accesible al público No. 2001-333766, pero aunque los resultados eran buenos, evaluando en general a partir del rendimiento, calidad, olor, aparición de enfermedad y similares no igualaron los resultados obtenidos de la solicitud de la especie de Lactobacillus casei de la presente invención (FERM BP-10059, FERM P-19443).

Claims (6)

1. Especie de Lactobacillus casei FERM BP-10059 (FERM P-19443).

2. Una preparación de lactobacilo que tiene una especie de Lactobacillus casei según la reivindicación 1 como ingrediente activo principal.

3. Un agente preventivo o terapéutico contra infecciones en seres humanos, animales y plantas que tiene una especie de Lactobacillus casei según la reivindicación 1 como ingrediente activo principal.

4. El agente preventivo o terapéutico contra infecciones en seres humanos, animales y plantas según la reivindicación 3, en donde el agente preventivo o terapéutico contra infecciones en seres humanos, animales y plantas según la reivindicación 3 contiene un antibiótico.

5. El agente preventivo o terapéutico contra infecciones en seres humanos, animales y plantas según la reivindicación 3 ó 4 para el tratamiento de periodontitis, en donde dicho agente se tiene que aplicar a un área afectada después de que el área afectada se haya desinfectado con un desinfectante bactericida.

6. El agente preventivo o terapéutico contra infecciones en seres humanos, animales y plantas según la reivindicación 5, en donde desinfectante bactericida es un desinfectante bactericida que contiene de 500 a 1.500 ppm de iones férricos, de 500 a 2.000 ppm de ácido L-ascórbico y de 200 a 2.000 ppm de uno o dos de ácido sórbico, ácido benzoico o éster del ácido paraoxibenzoico como componentes principales.