CN104293691B - 一株能降低抗药性的嗜酸乳杆菌及其制备的生物制剂 - Google Patents
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Abstract
一株能降低抗药性的嗜酸乳杆菌及其制备的生物制剂。本发明公开嗜酸乳杆菌的新菌株(Lactobacillus acidophilus) XD13R，其保藏号为CCTCC M 2014216，该菌株具有减少动物体内抗药性细菌的比例的能力，可降低动物及人体对多种抗生素的抗药性。同时，本发明还公开了该嗜酸乳杆菌XD13R制备的生物制剂及方法，利用该生物制剂喂养畜禽动物可降低动物体内对不同抗生素抗药性细菌比例30~96%。
Description
技术领域
本发明涉及了一株能降低动物抗药性的嗜酸乳杆菌，尤其涉及一株能减少动物体内抗药性细菌比例的嗜酸乳杆菌。本发明同时还涉及了使用该嗜酸乳杆菌新菌株制备的生物制剂及方法。
背景技术
在过去的20年里，许多几乎已经销声匿迹或普遍认为对人类健康不构成重大威胁的疾病好像结核和肺炎，随着感染性疾病的爆发和耐药菌株的增长及其在全球的重新蔓延，又一次向全人类的健康布下了苍白的阴影。事实上，我们正在步入所谓的“后抗生素时代”——在抗生素被发现之前，人们经历了无法控制感染类疾病的黑暗时代，而今天，已经有数种细菌对几乎所有抗生素耐药。中国是世界上滥用抗生素最为严重的国家之一，由此造成的细菌耐药性问题尤为突出，临床分离的一些细菌对某些药物的耐药性已居世界首位，尤其值得注意的是，人们对其危害性的了解远远不足够。
所谓抗药性又称耐药性，是指某种细菌对某种抗菌药物反复接触后对抗菌药物的反应降低，对某种抗生素不再敏感，抗生素对它们不再起作用的现象。是由于长期使用抗菌药物，应用剂量不足时，细菌通过产生使药物失活的酶、改变膜通透性阻滞药物进入、改变靶结构或改变原有代谢过程而产生的。细菌耐药性一旦形成，不论感染在哪个人的身上，抗生素都不能有效的杀灭或抑制它们。因此，耐药细菌的危害会对整个人群健康构成威胁，而不是有人理解的那样：“谁滥用，谁受害”。这个科学道理决非空穴来风夸大其词，潜在的危害已经摆在了我们的面前。照此下去，人类将可能自食其果。
不仅如此，更为严重的是耐药细菌可以从一个区域转移到另一个地区或多个地区，从一个国家转移到一个或多个国家，甚至从人传给动物，动物传给人，随着人们交流的频繁与便捷，世界经济全球化的进程，人流，物流，信息流更加畅通，耐药菌种的传播速度越来越快，范围越来越广，所以，细菌耐药性和耐药性转移已成为全球性的、世纪性的严肃命题，已引起各国政府和科学家的高度重视。
为了更好地发挥抗生素药物的作用，对付细菌对抗菌药物产生抗药性，现有技术的方法是（1）加大抗生素药物的用药剂量；（2）交替使用抗生素药物；（3）对有适应证的动物或病人，药物种类、用量及使用时间都必须严格控制，能用窄谱的就不要用广谱抗菌药物，能用一种有效的就不必用多种，以避免耐药性和二重感染；（4）严格掌握抗菌药物的使用适应证，病毒感染不应采用抗菌药物治疗；（5）加快新型抗生素药物的研制。
现有技术对复合微生物菌剂的研究和应用已经十分普遍，这些微生物菌剂有由某一个属的多个菌种复合培养而成，也有由一个或两个以上的属中的多个菌种复合培养而成，目前应用最多的有乳酸菌、酵母、芽胞杆菌、双歧杆菌等，这些不同配方的复合微生物菌剂已经被广泛地应用到畜牧养殖业、水产养殖业及人体保健等多个技术领域，应用最为广泛的如乳酸菌制成的酸奶制品，还有EM菌剂、酵素菌、益生菌等等，这些产品的应用功能基本上都定位在用于提高动物及人体的免疫能力，平衡肠道的微生态菌群结构，改善微生态环境等等，至今所有的生物制剂均未发现具备降低抗药性细菌的比例的能力，无法降低动物体内或人体内细菌对抗生素的抗药性。
发明内容
本发明的第一个目的是提供了一株嗜酸乳杆菌的新菌株(Lactobacillusacidophilus) XD13R，其保藏号为CCTCC NO：M 2014216，该菌株具有减少动物体内抗药性细菌的比例的能力，可降低动物及人体对多种抗生素的抗药性。
本发明的第二个目的是提供一种用上述嗜酸乳杆菌XD13R制备的生物制剂，利用该生物制剂喂养畜禽动物可降低动物体内对不同抗生素抗药性细菌比例30~96%。
本发明的第三个目的是提供一种用上述嗜酸乳杆菌XD13R制备生物制剂的方法。
本发明的第一个目的提供的嗜酸乳杆菌新菌株(Lactobacillus acidophilus)XD13R，它具有降低动物体内抗药性细菌的比例的能力。该嗜酸乳杆菌新菌株XD13R已经于2014年5月22日在中国典型培养物保藏中心保藏，并收到保藏登记号CCTCC NO：M 2014216。
本发明第二个目的通过以下技术措施来实现：一种用上述嗜酸乳杆菌XD13R制备的生物制剂，其由以下方法制备而成：
(1) 配制培养基：以蔗糖、蛋白胨、酵母膏、KH2PO4、西红柿汁和水为主要原料配制培养基，它们的重量百分比为：
蔗糖2.0~5.0%、蛋白胨1.5~4%、酵母膏0.5~3%、KH2PO4 0.2~3%、西红柿汁3~8%、水余量；
(2) 取嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus) XD13R菌液接种至经过高温灭菌的所述步骤（1）制备的培养基中，调整起始pH至5~6.5，在发酵罐中进行厌氧发酵3~15天，至终点pH为3~4，即得该嗜酸乳杆菌XD13R制备的生物制剂。
本发明步骤(2)中的嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus) XD13R按照常规的从100L种子罐到1000L发酵罐的发酵工艺及接种量培养，就可以实现本发明的目的。但是作为本发明的一个实施例，优选的嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus) XD13R菌液在种子罐的接种量在培养基总质量的5~10%范围内。
所述步骤(2)中嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus) XD13R菌液的制备方法：接种嗜酸乳杆菌XD13R的新鲜培养物至MRS培养基中，30-40℃培养18~48h即可。
本发明第三个目的通过以下技术措施来实现：一种用上述嗜酸乳杆菌制备生物制剂的方法，其包括以下步骤：
(1) 培养基的制作：以蔗糖、蛋白胨、酵母膏、KH2PO4、西红柿汁和水为主要原料配制培养基，它们的重量百分比为：
蔗糖2.0~5.0%、蛋白胨1.5~4%、酵母膏0.5~3%、KH2PO4 0.2~3%、西红柿汁3~8%、水余量；
(2) 取嗜酸乳杆菌XD13R菌液接种至经过高温灭菌的所述步骤（1）制备的培养基中，调整起始pH至5~6.5，在发酵罐中进行厌氧发酵3~15天，至终点pH为3~4，即得该嗜酸乳杆菌XD13R制备的生物制剂。
所述步骤(2)中嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus) XD13R菌液的制备方法：接种嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus) XD13R的新鲜培养物至装有MRS培养基的三角瓶中，在30-40℃的培养箱中培养18~48h，获得XD13R菌液。
本发明与现有技术相比具有以下优点：
1. 本发明提供的嗜酸乳杆菌菌株(Lactobacillus acidophilus) XD13R，是非致病菌，是一种益生菌，该菌株具有减少动物体内抗药性细菌的比例的能力，可降低动物及人体对多种抗生素的抗药性。
2. 本发明的嗜酸乳杆菌制备的生物制剂，利用该生物制剂喂养畜禽动物可降低动物体内对不同抗生素抗药性细菌比例30~96%，将其应用于畜禽养殖中，可以降低养殖动物对目前常用的多种抗生素的抗药性，降低常见疫病的治疗难度。
本发明的嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus) XD13R已经于2014年5月22日在中国典型培养物保藏中心保藏，地址：武汉市武昌珞珈山武汉大学，并收到保藏登记号(CCTCC NO：M 2014216)。
附图说明
图1是嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus) XD13R的DNA测序图。
具体实施方式
实施例一：
嗜酸乳杆菌XD13R菌株的驯化和筛选：从广东省微生物研究所菌种保藏中心购买了4株芽孢杆菌（XD05B-XD08B），3株乳酸菌（XD05R-XD07R），1株酵母（XD05J），从广州百佳超市购买了2株酵母（XD06J-XD07J），再从自然界分离筛选了8株菌斑形态、菌体形态均有别于上述菌株的乳酸菌（XD08-RXD15R），合计共收集了4株芽孢杆菌（XD05B-XD08B），11株乳酸菌（XD05R-XD15R），3株酵母（XD05J-XD07J），然后将它们分别经10代高抗药性细菌比例的生猪粪水环境的诱变培养，最后挑选出能适应上述生猪粪水环境的，能降低抗药性细菌比例的菌株。
上述的高抗药性细菌比例的生猪粪水：是从十多个养殖场取来新鲜猪粪各15公斤，按猪粪比水的重量比为1﹕5的比例配制后，滤去粪渣，将粪水分别添加0mg/kg、25mg/kg、50mg/kg、100mg/kg的链霉素和盐酸林可霉素后，在35度培养箱培养36小时，分别进行细菌总数的计数，将各种抗生素分别添加25mg/kg、50mg/kg、100mg/kg的细菌总数除以添加0mg/kg的对照组的细菌总数，得出该粪水中的细菌在该抗生素该浓度下的抗药性细菌比例，挑选出抗药性细菌比例最高的粪水来自清远市清城区沙田养猪场，作为本发明用于筛选具有降低抗药性细菌比例功能的粪水。
上述的降低抗药性细菌比例的检验方法：将上述方法制成的粪水分别装入144个500ml的三角瓶中，分别接种上述的18种菌，每种菌接种8瓶，在35度的培养箱培养8小时后，分别添加0mg/kg、25mg/kg、50mg/kg、100mg/kg的链霉素和盐酸林可霉素，在35度培养箱培养36小时，分别进行细菌总数的计数，将各种抗生素分别添加25mg/kg、50mg/kg、100mg/kg的细菌总数除以添加0mg/kg的对照组的细菌总数，得出该粪水中的细菌在该抗生素该浓度下的抗药性细菌比例，本发明首先筛选出具有降低粪水中抗药性细菌比例的菌株，再经过上述步骤重复10次，最终筛选出降低抗药性细菌能力最强的菌株为XD13R，对该菌株我们送华南农业大学分子遗传实验室进行DNA测序（见图1），结果证明该菌株是一株嗜酸乳杆菌的菌株。
实施例二：
(1) 制备嗜酸乳杆菌XD13R菌液：接种嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)XD13R的新鲜培养物至装有MRS培养基的10~20个500ml三角瓶中，在30℃的培养箱中培养48h，得嗜酸乳杆菌XD13R菌液；
(2) 培养基的制作：以蔗糖、蛋白胨、酵母膏、KH2PO4、西红柿汁和水为主要原料配制培养基，它们的重量百分比为：
蔗糖4%、蛋白胨2.5%、酵母膏1%、KH2PO4 1%、西红柿汁4%、水余量。
(3) 取上述嗜酸乳杆菌XD13R菌液接种至经过高温灭菌的上述培养基中，调整起始pH至5~6.5，在发酵罐中进行厌氧发酵15天，至终点pH为3~4，即得该嗜酸乳杆菌XD13R制备的生物制剂。
实施例三：
(1) 制备嗜酸乳杆菌XD13R菌液：接种嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)XD13R的新鲜培养物至装有MRS培养基的10~20个500ml三角瓶中，在38℃的培养箱中培养40h，得嗜酸乳杆菌XD13R菌液；
(2) 培养基的制作：以蔗糖、蛋白胨、酵母膏、KH2PO4、西红柿汁和水为主要原料配制培养基，它们的重量百分比为：
蔗糖4%、蛋白胨2.5%、酵母膏1%、KH2PO4 1%、西红柿汁4%、水余量。
(3) 取上述嗜酸乳杆菌XD13R菌液接种至经过高温灭菌的上述培养基中，调整起始pH至5~6.5，在发酵罐中进行厌氧发酵4天，至终点pH为3~4，即得该嗜酸乳杆菌XD13R制备的生物制剂。
实施例四：
(1) 制备嗜酸乳杆菌XD13R菌液：接种嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)XD13R的新鲜培养物至装有MRS培养基的10~20个500ml三角瓶中，在40℃的培养箱中培养18h，得嗜酸乳杆菌XD13R菌液；
(2) 培养基的制作：以蔗糖、蛋白胨、酵母膏、KH2PO4、西红柿汁和水为主要原料配制培养基，它们的重量百分比为：
蔗糖5%、蛋白胨2%、酵母膏1.5%、KH2PO4 1.2%、西红柿汁6%、水余量。
(3) 取上述嗜酸乳杆菌XD13R菌液接种至经过高温灭菌的上述培养基中，调整起始pH至5~6.5，在发酵罐中进行厌氧发酵5天，至终点pH为3~4，即得该嗜酸乳杆菌XD13R制备的生物制剂。
实施例五：
(1) 制备嗜酸乳杆菌XD13R菌液：接种嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)XD13R的新鲜培养物至装有MRS培养基的10~20个500ml三角瓶中，在35℃的培养箱中培养35h，得嗜酸乳杆菌XD13R菌液；
(2) 培养基的制作：以蔗糖、蛋白胨、酵母膏、KH2PO4、西红柿汁和水为主要原料配制培养基，它们的重量百分比为：
蔗糖5.0%、蛋白胨4%、酵母膏3%、KH2PO4 3%、西红柿汁8%、水余量。
(3) 取上述嗜酸乳杆菌菌液接种至经过高温灭菌的上述培养基中，调整起始pH至5~6.5，在发酵罐中进行厌氧发酵10天，至终点pH为3~4，即得该嗜酸乳杆菌XD13R制备的生物制剂。
试验例一：
以将所筛选出来的嗜酸乳杆菌XD13R菌株制成的生物制剂在广东省清远市清城区沙田养猪场、广东省鹤山市鹤城镇邓三辉养猪场，鹤山市源生态农民专业合作社马山养殖场进行养殖了3个批次共90头肉猪的养殖试验，试验的方法是选择30公斤左右的普通瘦肉型中猪，将上述实施例三所制成的生物制剂按重量比1﹕50的比例稀释后每天供生猪饮用，经60-90天的喂养试验结果表明，这种生物制剂适口性好，生猪喜欢饮用，安全性好，没有出现任何不良反应，吃了这种饲料的生猪极少发病，栏舍内的氨气浓度一直保持在0-5ppm之间，明显优于国家行业标准（栏舍内氨气浓度≤30ppm），生猪粪便中的抗药性细菌比例如表一所示：
表一：
试验例二：
将所筛选出来的嗜酸乳杆菌XD13R菌株制成的生物制剂在广东省鹤山市桃源镇麦明益养猪场、广东省鹤山市雅瑶镇李建芳养猪场，鹤山市源生态农民专业合作社马山养殖场进行养殖了3个批次共90头肉猪的养殖试验，试验的方法是选择30公斤左右的普通瘦肉型中猪，将上述实施例三所制成的生物制剂按重量比1﹕300的比例添加到饲料中每天供生猪食用，经60-90天的喂养试验结果表明，这种生物制剂适口性好，生猪喜欢用，安全性好，没有出现任何不良反应，吃了这种饲料的生猪极少发病，栏舍内的氨气浓度一直保持在0-4ppm之间，明显优于国家行业标准（栏舍内氨气浓度≤30ppm）。
试验例三：
将所筛选出来的嗜酸乳杆菌XD13R菌株制成的生物制剂在广东省鹤山市古劳镇冯景强、王耀文养殖场进行养殖了3个批次共90头肉猪的养殖试验，试验方法是选择30公斤左右的三元杂中猪，将述实施例二所制成的生物制剂直接投喂（即喂养100%的发酵饲料），经60-90天的喂养试验结果，与上述试验例一和二采用瘦肉猪养殖的差异不显著。
试验例四：
将所筛选出来的嗜酸乳杆菌XD13R菌株制成的生物制剂在广东省鹤山市古劳镇冯景强、王耀文养殖场进行养殖了3个批次共90头肉猪的养殖试验，试验方法是选择30公斤左右的三元杂中猪，将实施例二所制成的生物制剂30%，添加60%左右的普通中猪饲料，经60-90天的喂养试验结果，与上述试验例一和二采用瘦肉猪养殖的差异不显著。
Claims (7)
1.一种嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)新菌株XD13R，其保藏号为CCTCC M2014216，其具有降低动物体内抗药性细菌的比例的能力。
2.一种用权利要求1所述的嗜酸乳杆菌制备的生物制剂，其特征在于，其由包括以下步骤的方法制备而成：
(1)配制培养基：以蔗糖、蛋白胨、酵母膏、KH2PO4、西红柿汁和水为主要原料配制培养基，它们的重量百分比为：
蔗糖2.0～5.0％、蛋白胨1.5～4％、酵母膏0.5～3％、KH2PO4 0.2～3％、西红柿汁3～8％、水余量；
(2)取嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)XD13R菌液接种至经过高温灭菌的所述步骤(1)制备的培养基中，调整起始pH至5～6.5，在发酵罐中进行厌氧发酵3～15天，至终点pH为3～4，即得该嗜酸乳杆菌制备的生物制剂。
3.根据权利要求2所述的嗜酸乳杆菌制备的生物制剂，其特征在于，所述步骤(2)中嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)XD13R按照常规的从100L种子罐到1000L发酵罐的发酵工艺及接种量进行培养，所述嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)XD13R菌液在种子罐的接种量在培养基总质量的5～10％范围内。
4.根据权利要求2所述的嗜酸乳杆菌制备的生物制剂，其特征在于，所述步骤(2)中嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)XD13R菌液的制备方法：接种XD13R的新鲜培养物至MRS培养基中，30-40℃培养18～48h即可。
5.一种用权利要求1所述的嗜酸乳杆菌制备生物制剂的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)配制培养基：以蔗糖、蛋白胨、酵母膏、KH2PO4、西红柿汁和水为主要原料配制培养基，它们的重量百分比为：
蔗糖2.0～5.0％、蛋白胨1.5～4％、酵母膏0.5～3％、KH2PO4 0.2～3％、西红柿汁3～8％、水余量；
(2)取嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)XD13R菌液接种至经过高温灭菌的所述步骤(1)制备的培养基中，调整起始pH至5～6.5，在发酵罐中进行厌氧发酵3～15天，至终点pH为3～4，即得该嗜酸乳杆菌制备的生物制剂。
6.根据权利要求5所述的用权利要求1所述的嗜酸乳杆菌制备生物制剂的方法，其特征在于，所述的步骤(2)中嗜酸乳杆菌XD13R菌液的接种量在培养基总质量的5～10％范围内。
7.根据权利要求5所述的用权利要求1所述的嗜酸乳杆菌制备生物制剂的方法，其特征在于，所述步骤(2)中嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)XD13R菌液的制备方法：接种XD13R的新鲜培养物至MRS培养基中，30-40℃培养18～48h即可。
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