ES2226228T5 - Crecimiento mejorado de las bacterias del acido lactico en la leche. - Google Patents
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Abstract
Un medio para el crecimiento de lactobacillus que comprende una base derivada de la leche, caracterizada por como mínimo cuatro aminoácidos, ribonucleósidos y hierro se añade en una cantidad suficiente para promover el crecimiento de los lactobacillus.
Description
Crecimiento mejorado de las bacterias del ácido
láctico en la leche.
La presente invención, se refiere a nuevos
medios adaptados a los lactobacilli, los cuales comprenden una base
derivada de la leche, suplementada mediante por lo menos cuatro
aminoácidos, ribonucleósidos y hierro. De una forma particular, la
presente invención, se refiere al uso de los citados nuevos medios,
para cultivar una variedad de diferentes cepas de lactobacillus,
por ejemplo, L. johnsonii, L. acidophilus, L. gallinarum para
la preparación de productos lácteos.
Las bacterias del ácido láctico, se han venido
utilizando desde hace mucho tiempo, para la producción de una
variedad de materiales alimenticios, tales como el yogurt, el queso,
la cuajada, etc. Adicionalmente a su uso general en la industria
alimentaria, para propósitos de fermentación, recientemente, algunas
cepas pertenecientes al genero Lactobacillus o Bifidobacteria, han
atraído una gran atención y representan un gran desafío, debido a
las propiedades probióticas que se atribuyen a éstas. Por
consiguiente, existía un deseo para mejorar las condiciones de
cultivo, de tal forma que se fuera capaz de maximizar la producción
de la biomasa microbiana.
Una deficiencia de bacterias del ácido láctico,
con respecto a su preparación a gran escala, y su capacidad de
aplicación, debe ser vista en sus diferentes requerimientos
nutricionales. En este contexto, ya diferentes capas pertenecientes
a un género o especies específicas, requieren diferentes medios para
un crecimiento óptimo, lo cual convierte a la producción
estandarizada de biomasas microbianas, en complicado e incómodo.
Así, de este modo, en la producción de una biomasa de diferentes
cepas del género lactobacillus, debe utilizarse una variedad de
diferentes medios, cumpliendo no obstante, cada uno de los cuales,
únicamente con las necesidades nutricionales de una cepa
particular, al mismo tiempo que no fomenten un crecimiento
suficiente de otras cepas de lactobacillus presentes en ésta.
Un medio frecuentemente utilizado para el
cultivo de cepas del ácido láctico, es la leche de vaca. Por una
parte, este medio, proporciona un entorno medioambiental natural,
complejo, y sus productos de fermentación, por ejemplo, yogurt,
pueden utilizarse directamente como material alimenticio. No
obstante, este medio, ha probado soportar únicamente el crecimiento
de un número limitado de cepas de bacterias del ácido láctico. Así
por ejemplo, los Lactobacilli del grupo A y B de Johnson, han
demostrado ser esencialmente incapaces de proliferar y de crecer en
la leche, lo cual convierte a este medio en no utilizable para las
citadas cepas.
En algunos casos, el crecimiento bacteriano,
podría mejorarse, cuando, a la leche, se han añadido substancias de
una composición no definida y muy compleja, tales como extractos de
levaduras o peptonas de varios orígenes. No obstante, estos
componentes adicionales, pueden provocar, a menudo, una exención o
desviación del sabor, con el resultado consistente en que, los
cultivos que crecen en un medio suplementado de este modo, no pueda
utilizarse para la fabricación industrial de dichos productos.
Adicionalmente, además, los costos involucrados y los resultados a
menudo variables, en cuanto a la repetitividad de las cuentas
bacterianas obtenibles, los convierten en no apropiados para una
fabricación comercial de las cepas microbianas.
En vista de estos hechos, un problema de la
presente invención, es el de proporcionar un medio que soporte el
crecimiento de cepas de Lactobacillus, al mismo tiempo que evite los
inconvenientes o deficiencias correspondientes al estado actual de
la técnica correspondiente a este arte.
Este problema, se ha solucionado procediendo a
proporcionar un medio para el crecimiento de cepas de Lactobacillus,
correspondientemente en concordancia con la reivindicación 1.
En concordancia con una forma de presentación
preferida, la cantidad de precursores de ribonucleósidos (es decir,
bases libres, ribonucleósidos, desoxirribonucleósidos) a ser añadida
al medio, es la correspondiente a un valor comprendido dentro de
unos márgenes que van desde aproximadamente 10 hasta aproximadamente
500 mg/litro de medio, de cada uno, de una forma preferible, desde
aproximadamente 10 hasta aproximadamente 100 mg/litro de medio.
En concordancia con todavía otra forma de
presentación preferida, se procede a añadir hierro al medio, en una
cantidad correspondiente a un valor de aproximadamente 50 - 100
mg/litro de leche.
Adicionalmente, además, el medio, se suplementa
mediante por lo menos cuatro aminoácidos, los cuales pueden ser
cualesquiera de los aminoácidos existentes y susceptibles de poderse
obtener por parte de aquéllas personas expertas en el arte
especializado de la técnica. La cantidad de aminoácidos a ser
añadida a la base láctica, es la correspondiente a un valor
comprendido dentro de unos márgenes que van desde aproximadamente 10
hasta aproximadamente 200 mg/litro, de una forma preferible, desde
aproximadamente 50 hasta aproximadamente 100 mg/litro de leche.
Todavía, en concordancia con una forma preferida de presentación de
la presente invención, los aminoácidos, se seleccionan de entre el
grupo consistente en alanina, serina, e isoleucina, los cuales se
ha encontrado que mejoraran, de una forma particular, la condiciones
de crecimiento para los Lactobacilli.
En concordancia con todavía otra forma de
presentación de la presente invención, el medio, puede también
suplementarse mediante compuestos que proporcionen una actividad
reductora, tales como los consistentes en el ácido ascórbico, la
vitamina E, el tocotrienol, el ubiquinol, el
\beta-caroteno y otros carotinoides, compuestos de
romero (por ejemplo, el carnosol), y otros flavonoides, y otros
antioxidantes que contienen azufre, incluyendo a la glutationa,
ácidos lipóicos, N-acetilcisteína y compuestos que
portan grupos sulfhidrilo, cisteína ó ácido tioglicólico, o mezclas
de entre éstos. Con respecto al uso de un amino ácido, se prefiere
la cisteína, como un compuesto tal que proporciona una actividad
reductora.
La base derivada de la leche a ser incluida en
el medio, puede ser leche, en todas sus variaciones, tales como la
leche entera o parcialmente descremada, la leche descremada o la
leche UHT, o puede prepararse a partir de leche en polvo
deshidratada, mediante la adición de agua. La base láctica fluida,
puede utilizarse tal cual, o pueden añadirse otros componentes
conocidos, tales como por ejemplo agua, para diluir la leche al
grado deseado.
En las figuras,
La figura 1, muestra una comparación entre
curvas RABIT obtenidas después de 24 horas de incubación, para
L. johnsonii La1 (NCC 533), en 10% de leche descremada y
leche entera, suplementada con un 1% de extracto de levadura, y una
mezcla de cuatro ribonucleósidos, cuatro aminoácidos y sulfato
ferroso; (1) leche UHT entera + cuatro ribonucleósidos; (2) leche
entera UHT + extracto de levadura; (3) leche descremada + extracto
de levadura; (4) leche descremada + cuatro ribonucleósidos + cuatro
aminoácidos + sulfato ferroso; (5) leche descremada + adenosina +
cuatro aminoácidos + sulfato ferroso.
La figura 2, muestra el efecto de la
suplementación de 10% de leche descremada y leche entera UHT, con
cuatro ribonucleósidos, cuatro aminoácidos y sulfato ferroso, en el
crecimiento de L. gallinarum DSM 33197^{T}; (1) leche
descremada al 10%; (2) leche descremada al 10% + cuatro aminoácidos
+ cuatro ribonucleósidos + sulfato ferroso; (3) leche entera UHT;
(4) leche entera UHT + cuatro aminoácidos + cuatro ribonucleósidos
+ sulfato ferroso.
Durante los estudios extensivos que condujeron a
la presente invención, se encontró el hecho de que, varios
parámetros, parecían ser responsables para el crecimiento de
Lactobacilli en un medio a base de leche.
Se conoce el hecho de que, la leche de vaca,
tiene un contenido específico de ribonucleósidos, el cual varía en
dependencia de la estación o temporada y el país de producción. Los
derivados de la purina, cuentan para únicamente una reducida
cantidad, mientras que, aproximadamente más de un 95% de lo
ribonucleósidos en la leche, se encuentra representado por el ácido
orótico, el cual se utiliza como un precursor de pirimidina en
células bacteriana. El bajo contenido de nucleótidos de adenina y
guanina en la leche, afecta negativamente al crecimiento
bacteriano, con la condición de que algunas cepas que pueden
realizar una síntesis "de novo" de precursores de DNA y
RNA, tales como L. casei y L. plantarum. No obstante,
se han observado incluso efectos inhibitorios, en algunos casos,
cuando se procede a añadir derivados de purina a la leche.
Dada la incapacidad de algunas cepas de
Lactobacillus, tales como L. johnsonii, L. gasseri, L. crispatus,
L. amilovorus, L. gallinarum y L. acidophilus, para
reproducirse en una alta densidad, en la leche, se procedió a
estudiar una combinación de diferentes productos químicos, los
cuales, hipotéticamente, podían ser capaces de reemplazar a
substancias estimuladoras del crecimiento, de una composición no
definida.
Con objeto de encontrar la identidad de otras
substancias putativas estimuladoras, se procedió a llevar a cabo
varios ensayos con precursores de ribonucleótidos, es decir, bases
libres (adenina, guanina, cistosina, timina, uracilo),
ribonucleósidos (adenosina, citidina, uridina, guanosina), y
2'desoxirribonucleósidos (desoxiadenosina, desoxiganosina,
desoxicitidina, desoxiuridina, y timidina). Éstos se suplementaron a
una leche como soluciones alcalinas o neutras, concentradas, a
diferentes concentraciones.
Una adición de ribonucleósidos, mejoraba las
condiciones de crecimiento para los Lactobacilli, en la leche,
mostrando los efectos más fuertes, la adenosina y la guanidina. Este
descubrimiento, confirmaba la hipótesis consistente en que, el bajo
nivel de purinas en la leche, afectaba obviamente, de una forma
negativa, al crecimiento negativo, en su seno. De una forma
general, se encontró el hecho de que, el alto contenido en ácido
orótico, representa un factor estimulante para el crecimiento de
Lactobacillus, permitiendo la síntesis de bases de pirimidina. No
se detectaron diferencias significativas en los valores del pH,
mediante la adición de bases libres y desoxirribonucleósidos, entre
condiciones aeróbicas y anaeróbicas. Se observó un incremento de más
de 1 log, indicando un efecto positivo que concernía,
particularmente, a los ribonucleótidos, en el entorno
medioambiental anaeróbico.
Las mejores mejoras para incrementar el número
de Lactobacilli, mediante la adición de ribonucleósidos y los
valores más fuertes de acidificación, respectivamente, se lograron
mediante la adición de adenosina, guanosina, y/o citidina y
uridina, en una cantidad de aproximadamente 0,1 g/litro, de cada una
de ellas. No obstante, a pesar del hecho de que, esta mezcla, por
sí sola, reveló la capacidad de soportar el crecimiento de L.
johnsonii, l. acidophilus, y L. gallinarum, a niveles
comparables a los alcanzados mediante la adicción de extracto de
levadura (véanse las figuras 1, 2 y la tabla 3), no se observaron
efectos remarcablemente positivos con otras cepas de lactobacillus,
procedentes de las especies L. amilovorus, L. crispatus y
L. gasseri.
Con la adición de bases libres a la leche
(adenina, citosina, uracilo, timina y guanina), reemplazando a los
ribonucleósidos, como suplementos, se obtuvieron unos resultados
similares. No obstante, en estos casos, las cepas tendían a mostrar
un requerimiento en cuanto a magnesio y ácido aspártico.
\newpage
\global\parskip0.900000\baselineskip
Adicionalmente, además, se procedió a llevar a
cabo varios ensayos, suplementando leche, con diferentes
2'-desoxirribonucleósidos, los cuales produjeron un
incremento del número de células viable de únicamente algunas cepas
particulares.
A pesar del descubrimiento anterior, de arriba,
en cuanto al hecho de que ninguno de los productos químicos
mencionados era capaz de soportar el crecimiento bacteriano para una
pluralidad de diferentes cepas bacterianas, en un alto nivel, si se
añadían solos a la leche, se ha encontrado no obstante, de una forma
sorprendente, el hecho de que, una combinación consistente en
aminoácidos, ribonucleósidos y hierro (por ejemplo, en forma de
sulfato de hierro), fomenta realmente el crecimiento de varias
especies de Lactobacillus. En experimentos, en los cuales, se
procedió a reducir a un mínimo, el número de los diferentes
compuestos, en la mezcla de la combinación anteriormente
mencionada, arriba, pudo observarse el hecho de que, el número más
pequeño para cada uno de los compuestos especificados a ser
añadidos a la leche, es por lo menos el de dos ribonucleósidos, de
una forma preferible, adenosina y guanosina, cuatro aminoácidos y
hierro. Esta mezcla, era capaz de mejorar el crecimiento de una
variedad de diferentes cepas de Lactobacilli, tales como las
correspondientes a aquéllas del grupo de Johnson, con un recuento
de células y un valor pH final, comparable a los obtenidos mediante
la adición, a la leche, de extracto de levadura o peptonas.
Adicionalmente, además, la adición de hierro en
una cantidad correspondiente a un valor comprendido dentro de unos
márgenes que van de 10 a 200 mg/litro, a una mezcla consistente en
el medio, suplementado con una combinación de los productos
químicos anteriores, de arriba, ha probado incluso el mejorar los
resultados obtenidos. Este descubrimiento, puede explicarse de tal
forma que, a pesar de su rica composición, la leche, presenta una
fuerte deficiencia en hierro que se encuentre complejado, como la
lactoferrina, y es por lo tanto inasequible para cualesquiera
microorganismos que crezcan en ella.
Así, de este modo, los mejores resultados, se
obtuvieron mediante la adición de adenosina, guanosina y/o citidina
y uridina, en una cantidad de 0,1 g/litro de cada una de ellas,
alanina, serina, isoleucina, cisteína (0,05 g/litro cada una de
ellas) y FeSO_{4} (0,1 g/l).
El hecho consistente en que, ambas, la leche T
descremada y la leche UHT de nata entera, proporcionaron unos
resultados óptimos cuando se suplementaron con la combinación de los
compuestos de anteriores, de arriba, condujo a la presunción de
que, los componentes grasos de la leche, no tenían ningún rol
interpretativo en la estimulación del crecimiento de Lactobacillus,
así como los tratamientos de esterilización (UHT), no afectaban
negativamente al potencial de la leche, para soportar el desarrollo
bacteriano.
Los ejemplos que se facilitan a continuación,
ilustran la invención, sin limitar la misma.
Las cepas de L. johnsonii ATCC
33200^{T}, La 1 (NCC 533) ATCC 11506 (anteriormente conocida como
L. acidophilus R-26), ATCC 332, DSM 20553,
L. acidophilus ATCC 4356^{T}, La 10 (NCC 90). L.
gasseri DSM 20243^{T}, L. Crispatus DSM 20531^{T},
L. amylovorus DSM 20584^{T}, y L. gallinarum DMS
33199^{T}, se propagaron en caldo MRS (Difco) o agar, a una
temperatura de 37ºC. Se utilizó leche descremada (Difco) al 10%
peso/volumen, en agua estéril y leche UHT de nata entera (Parmalat,
Italia), para realizar los ensayos de crecimiento. Los tubos de
leche, se inocularon al 1%, a partir de un cultivo en MRS de una
noche, se lavaron dos veces y, finalmente, se resuspendieron con la
misma cantidad de agua estéril bidestilada, con objeto de evitar la
transferencia de nutriente vía el medio.
Los tubos de leche, se incubaron aeróbicamente
en un termostato (Sorvall Heraeus), a una temperatura de 37ºC,
durante un transcurso de tiempo de 24 horas, y anaeróbicamente, en
un incubador anaeróbico (modelo 1024, Forma Scientific, USA) a una
temperatura de 37ºC, durante un transcurso de tiempo de 24
horas.
Los productos químicos suplementados a la leche,
se añadieron como soluciones concentradas, preparadas en
concordancia con las instrucciones de índice de Merck. El valor pH
final de la leche, se ajustó a un nivel de 6,8, después de la
suplementación, utilizando NaOH 4N. El valor pH inicial de la
solución de leche descremada al 10% y leche UHT de grasa entera,
era de 6,8 y de 6,7, respectivamente.
Se utilizó un análisis rápido de la técnica de
impedancia bacteriana (RAPID - [del inglés, Rapid Analysis of
Bacterial Impedance Tecnique] -)(Don Whitley Scientific, West
Yorkshire, UK), con objeto de realizar ensayos con la leche
descremada y leche UHT entera, durante un transcurso de tiempo de 24
horas, a una temperatura de 37ºC.
Los experimentos, se realizaron utilizando las
11 cepas listadas de la totalidad de las seis especies del grupo de
Johnson A y B, incluyendo la cepa del tipo de L. johnsonii
ATCC 33200 y L. johnsonii La 1 (NCC 533), con objeto de
determinar sus requerimientos nutricionales en la leche. Los
resultados obtenidos, condujeron a la identificación de algunos
productos químicos, capaces de producir los efectos positivos de
extracto de levadura y otras substancias de composición
químicamente indefinida en el crecimiento bacteriano, en la
leche.
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Las cepas investigadas demostraron no ser aptas
para crecer en ambas, leche descremada al 10% y leche UHT de nata
entera. Los resultados, recopilados en la tabla 1, pera L.
johnsonii, indican el hecho de que, acontecía una moderada
acidificación de este medio natural, después de un tiempo de
incubación de 24 horas, dando como resultado un incremento
logarítmico de menos de 1, de los números finales de células
viables, incluso si la incubación se realizaba bajo condiciones
anaeróbicas. Se observó el mismo comportamiento, en ambas, la leche
descremada y la leche UHT entera, también para los tipos de cepas de
L. gasseri, L. amylovorus, L. crispatus, L. acidophilus y
L. gallinarum.
La suplementación de la leche descremada con un
1% volumen/volumen de extracto de levadura (Adsa, Italia), dio como
resultado una mejora de un logaritmo de 2, en el número de células
viables. Este resultado, pudo confirmarse utilizando leche UHT de
nata entera. Después de un tiempo de 24 horas de incubación, se
obtuvo un valor pH final de 4,0, con la adición de extracto de
levadura (tabla 1).
La concentración final de extracto de levadura,
requerida para un crecimiento bacteriano óptimo, variaba dentro de
unos porcentajes comprendidos entre un 0,1 y un 1,0%
volumen/volumen. Pudo observarse el desarrollo de desviaciones o
ausencia del sabor, y cambios de color, en los productos lácteos
fermentados, suplementados con esta substancia.
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Se procedió a añadir una mezcla de 19
aminoácidos (alanina, glicina, histidina, lisina, fenilalanina,
prolina, serina, treonina, cisteína, arginina, ácido aspártico,
asparagina, ácido glutámico, isoleucina, leucina, metionina,
tirosina, triptófano y valina), a leche descremada (concentración
final 0,05 g/l, volumen/volumen, de cada aminoácido), produciendo
un efecto positivo en el desarrollo de L. johnsonii, el cual
era casi comparable a los niveles de acidificación, después de la
adición de extracto de levadura. Se midió un valor final de pH de
4,1, después de la suplementación de los aminoácidos, pero, el
recuento de células, no era todavía satisfactorio (4 x 10E + 0,8
cfu/ml).
Con objeto de determinar los aminoácidos que
tenían un rol interpretativo esencial para el crecimiento de L.
johnsonii, en la leche, se procedió a aplicar la "técnica de
omisión" (Reiter, B. & Oram J.D., J. Dairy Res, 29 (1962),
63 - 77), mediante el cultivo de la cepa ATCC 33200^{T}, en leche
descremada, añadiendo cuatro ribonucleósidos + sulfato ferroso
(control positivo), suplementado con la mezcla de 19 aminoácidos
descrita anteriormente, arriba, desprovista de un componente
particular, en cada momento dado. El análisis rápido de la técnica
de la impedancia bacteriana (RABIT), permitió la identificación de
cuatro aminoácidos (cisteína, alanina, serina e isoleucina), que
mostraron unos resultados excelentes. Se pensó que, los tres
últimos, eran estimulantes para la cepa sometida a test de ensayo,
cuando se añadían de una forma exógena, a la leche.
El rol interpretativo mayor, entre los
aminoácidos identificados, se atribuyó a la cisteína, confirmando el
hecho de que, esta ausencia de cisteína o cistina, en la leche,
podía afectar negativamente el desarrollo bacteriano. El rol
interpretativo de los grupos SH, parece no ser completamente
reemplazable mediante anaerobiosis. La ausencia de oxígeno
realizada mediante la incubación anaeróbica de los cultivos de L.
johnsonii, no permitieron el logro de los mismos resultados de
crecimiento, obtenidos cuando se procedió a suplementar la cisteína
a la leche de nata entera.
La medición del valor pH, reveló un valor pH de
4,3, en ausencia de cisteína, bajo condiciones anaeróbicas, frente
a un valor pH de 3,9, obtenido en presencia de este compuesto, bajo
condiciones aeróbicas. No obstante, la retirada de la cisteína,
proporcionó, como resultado, una pérdida más significativa de los
números viables de células, en un entorno medioambiental aeróbico,
que en un entorno medioambiental anaeróbico. Cuando se procedió a
cultivar L. Johnsonii bajo condiciones aeróbicas, una
solución de ácido tioglicólico (concentración final 0,5%
volumen/volumen), reveló su capacidad para sustituir a la cisteína,
dando como resultado unos altos recuentos de células, de un valor
mayor de 1,0 x 10 E + 0,9 cfu/ml.
A pesar de las acciones estimulantes debidas a
los cuatro aminoácidos anteriormente citados, arriba (cisteína,
alanina, serina e isoleucina), se observó un inesperado efecto
negativo, para la totalidad de los otros 15 aminoácidos (para un
ejemplo, véase la figura 3).
Se obtuvieron unos resultados semejantes, para
otras cepas, por ejemplo, Lb. Johnsonii ATCC 33200T.
Se obtuvieron unos resultados semejantes, para
otras cepas.
Claims (8)
1. Un medio de cultivo para el crecimiento de
lactobacilos, que comprende un base de derivado lácteo,
caracterizado por el hecho de que, se procede a añadir por
lo menos cuatro aminoácidos, ribonucléósidos, y hierro, en una
cantidad suficiente, como para fomentar el crecimiento de
Lactobacilli en su seno, en donde, el medio, comprende hierro, en
una cantidad correspondiente a un valor que se encuentra comprendido
dentro de unos márgenes que van de 10 a 200 mg/l, y en donde, no se
encuentran contenidos extracto de levadura o peptona.
2. El medio, según la reivindicación 1, en
donde, la cantidad de ribonucléosidos, es la correspondiente a un
valor comprendido dentro de unos márgenes que van desde
aproximadamente 1 hasta aproximadamente 500 mg/l, de una forma
preferible, desde aproximadamente 10 hasta aproximadamente 100
mg/l.
3. El medio, según la reivindicación 1 ó la
reivindicación 2, en donde, los ribonucleósidos, son adenosina o
guanosina.
4. El medio, según una cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, en donde, los aminoácidos añadidos
son, de una forma preferible, cisteína, serina e isoleucina, en una
cantidad correspondiente a un valor comprendido dentro de unos
márgenes que van desde aproximadamente 10 hasta aproximadamente 200
mg/l, de una forma preferible, desde aproximadamente 50 hasta
aproximadamente 100 mg/l, de leche.
5. El medio, según una cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, el cual contiene compuestos que
proporcionan una actividad reducida.
6. El medio, según una cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, en donde, el medio que proporciona
una actividad reducida, se selecciona de entre el grupo consistente
en cisteína, ácido tioglicólico, ácido ascórbico, o mezclas de
entre éstos.
7. El uso de un medio, según una cualquiera de
las reivindicaciones precedentes, para cultivar lactobacilli,
pertenecientes al grupo de Johnson A y B.
8. Uso de un medio, según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 7, para la producción de productos lácteos
fermentados.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EP99108717A EP1048215B2 (en) | 1999-04-30 | 1999-04-30 | Enhanced growth of lactic acid bacteria in milk |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| ES2226228T3 ES2226228T3 (es) | 2005-03-16 |
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