WO2021171061A1 - Grupo de microorganismos compuesto por lactobacillus sp. cepa k03d08, bacillus sp. cepa k03b01 y kazachstania sp. cepa k03k02g y sus composiciones; un proceso de obtención de un derivado lácteo libre de caseína que contenga ácidos grasos de cadena corta y ácidos grasos de cadena corta hidroxilados generados por el metabolismo del grupo de microorganismos - Google Patents
Grupo de microorganismos compuesto por lactobacillus sp. cepa k03d08, bacillus sp. cepa k03b01 y kazachstania sp. cepa k03k02g y sus composiciones; un proceso de obtención de un derivado lácteo libre de caseína que contenga ácidos grasos de cadena corta y ácidos grasos de cadena corta hidroxilados generados por el metabolismo del grupo de microorganismos Download PDFInfo
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Classifications
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- A23C—DAIRY PRODUCTS, e.g. MILK, BUTTER OR CHEESE; MILK OR CHEESE SUBSTITUTES; MAKING THEREOF
- A23C9/00—Milk preparations; Milk powder or milk powder preparations
- A23C9/12—Fermented milk preparations; Treatment using microorganisms or enzymes
- A23C9/127—Fermented milk preparations; Treatment using microorganisms or enzymes using microorganisms of the genus lactobacteriaceae and other microorganisms or enzymes, e.g. kefir, koumiss
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
Definitions
- the present invention corresponds to a group of microorganisms that allow the hydrolysis of casein in different dairy products, compositions containing the microorganisms, a production method for each of the microorganisms of the invention 5 and a process for obtaining a dairy derivative free of casein and containing short chain fatty acids and hydroxylated short chain fatty acids.
- Dairy derivatives with reduced casein content are products that have increased their consumption because many of them have been reported as less than 0 allergens compared to other types of products, making them potentially useful, for example, for newborn food formulas.
- Casein hydrolyzates can be traditionally produced using proteolytic enzymes, which are responsible for hydrolyzing casein (the main protein in milk).
- proteolytic enzymes responsible for hydrolyzing casein (the main protein in milk).
- using enzymes in different production processes makes them more expensive since enzymes themselves are the 5 most expensive inputs in various production processes.
- products that have a low casein content can be produced through heat treatments or acid or alkaline hydrolysis, which can produce severe degradation in several of the amino acids present in milk, reducing its nutritional value.
- Microorganisms stand out for being life forms that have a wide metabolic diversity, which, for example, translates into the presence of extracellular hydrolytic enzymes (secreted or membrane-anchored), capable of degrading the different substrates available in their environment so that these can be metabolized as 5 monomeric units.
- extracellular hydrolytic enzymes secreted or membrane-anchored
- proteases since these have been used in different industrial applications.
- Document WO2016066758A1 describes hydrolysates and their use in the treatment and / or prevention of diarrhea, since these hydrolysates inhibit the enzyme neprilysin which is associated with this pathology.
- the method of obtaining these hydrolysates involves the incubation of the milk to be treated with protease preparations selected from the group of neutral proteases, alkaline proteases, thermolysins and mixtures thereof.
- US2011097760A1 describes a method of production of a casein hydrolyzate using an endopeptidase. This document explicitly describes what the amino acid composition of said enzyme would be.
- Document US 5486461A describes an enzymatic method for obtaining casein hydrolysates that uses three different proteolytic enzymes. It is further indicated that this method5 makes it possible to obtain a preparation that completely hydrolyzes the casein.
- Document US2009214498A1 generally describes a method of producing antimicrobial peptides by incubating a biologically pure culture of Lactobacillus acidophilus, strain DPC6026, using milk or a product derived from milk as raw material.
- casein mediated by microorganisms has been described mainly in the bacterial genus Lactobacillus, a genus known to be frequently found in dairy products.
- Lactobacillus lactis a genus known to be frequently found in dairy products.
- the species of this genus that are known for their ability to degrade casein in dairy derivatives is the bacterium Lactobacillus lactis.
- Figure 1 Microbial growth in solid culture medium.
- A Growth of the strain Bacillus sp. strain K03B01 on skim milk agar.
- B Growth of the Lactobacillus sp. strain0 K03D08 on MRS agar.
- C Growth of the strain Kazachstania sp. strain K03K02G on agar
- Figure 2 Gram staining of the selected microbial strains.
- A Bacillus sp. strain K03B01.
- B Lactobacillus sp. strain K03D08.
- C Kazachstania sp. strain K03K02G.
- Casein hydrolysis of the selected strains Evaluation of casein hydrolysis on skim milk agar in Bacillus sp. strain K03B01 (A), Lactobacillus sp. strain K03D08 (B) and Kazachstania sp. strain K03K02G (C). Casein hydrolysis is visualized as a translucent halo around the inoculation well.
- Figure 4 Casein hydrolysis in casein-free dairy derivative.
- A silver salts
- B blue of Coomassie
- the present invention corresponds to a group of microorganisms that allow the hydrolysis of casein in different dairy products and the production of short chain fatty acids and hydroxylated short chain fatty acids; a process for obtaining a casein-free dairy derivative enriched in short-chain fatty acids and hydroxylated short-chain fatty acids using the aforementioned microorganisms; compositions containing the microorganisms; and finally to the production method of each of the microorganisms of the invention.
- the present invention corresponds to a group of three microorganisms that allow the degradation of casein present in dairy products and the production of short chain fatty acids and hydroxylated short chain fatty acids.
- the process comprises at least one Bacillus sp.
- Isolate at least one Lactobacillus sp. Isolate, and at least one Kazachstania sp. Isolate. 5 Strains were identified using conserved markers. In the case of the fungus strain, ITS4-ITS5 was used, while in the case of bacteria, DNAM6S sequences were used.
- the composition containing the group of microorganisms of the present invention is a wettable powder composition, a concentrated suspension, liquid or paste or gel, or other systems such as encapsulation.
- microorganisms such as microcapsules, nanoparticles formed by inorganic materials, such as silicon dioxide, silver or others, or organic materials, such as suitable gelling agents, as for example in biodegradable polymer matrices such as agar agar, carrageenans, gelatin, among others, and excipients 5 acceptable in the food industry.
- the wettable and / or liquid powder composition of the present invention comprises at least one isolated strain selected from an isolated strain of the Bacillus genus, an isolated strain of Lactobacillus and at least one isolated strain of Kazachstania in a ratio (2: 1: 1 ).
- excipients for the case of a wettable powder composition are selected from: 0 cereal starches, lactose, talc, maltodextrin, diatomaceous earth, or a microbiologically acceptable carrier.
- the isolated strains of Lactobacillus sp. K03D08 and Kazachstania sp. K03K02G are present in a ratio that can be 1: 1, 1: 2, 2: 1, 1: 3, 3: 1, 2: 3, 3: 2, 1: 4, 4: 1, 3: 4 , 4: 3, 1: 5, 5: 1, 1: 6, 6: 1, 1: 7, 7: 1, 1: 8, 8: 1, 1: 9, 9: 1, 1: 10; 10: 1, 5 5: 6, 6: 5, 6: 7, 7: 6, 7: 8, 8: 7, 8: 9, 9: 8, with an ideal ratio being 1: 1: 1
- the microorganisms come from pure cultures and grown in ideal liquid culture media for each of the strains indicated in this invention.
- the final amount of the microorganisms in the composition of the present invention is: the isolated strain of Lactobacillus sp. K03D08 present between 10 1 and 10 15 CFU / ml or CFU / g, the strain 0 isolated from Kazachstania sp. K03K02G is present between 10 1 and 10 15 CFU / ml or CFU / g, and the isolated strain of Bacillus sp. K03B01 is present between 10 1 and 10 15 CFU / ml or CFU / g.
- the present invention discloses a procedure for obtaining each of the microorganisms, and this procedure involves the following steps:
- the present invention further discloses a process for the production of a dairy derivative with a low content of casein that comprises the following steps: a) Incubate the Bacillus sp. K03B01 in milk of bovine origin between 6 and 120 hours and at a temperature between 20 ° C and 37 ° C, in a proportion between 0.1-10% w / v or 0.1-10% 5 w / w, with stirring between 5-300 rpm. b) Prepare a composition comprising the microorganisms Lactobacillus sp. K03D08 and Kazachstania sp. K03K02G in a ratio (1: 1).
- the incubation period of milk of bovine origin with Bacillus sp. K03B01 is between 12 and 96 hours. 0 In a more specific preferred embodiment the incubation temperature of Bacillus sp. K03B01 with milk of bovine origin is between 26 ° C and 37 ° C.
- Example 1 Obtaining and selecting microorganisms capable of reducing casein and lactose present in dairy products
- the strains presented in the present invention were obtained from probiotic type dairy fermentations and belonging to the Center for Micro-Bioinnovation (University of Valpara ⁇ so, Valpara ⁇ so, Chile). These fermentations were previously characterized through microbiological and metagenomic studies, identifying genes and enzymes related to the hydrolysis of casein and lactose, in addition to the production of short chain fatty acids. In this sense, it was considered that the fermented ones are natural sources of microorganisms, genes, enzymes and biomolecules of applied interest, and therefore the source or origin of the strains of the present invention.
- Table 1 Culture media used and relevant phenotypes The isolated strains were characterized, microbiologically (gram staining, morphology) ( Figure 2, Table 2), molecularly (Table 3) and biochemically (Table 4). Additionally, the ability of these microbial strains to hydrolyze the casein present in milk was determined (Table 5). From this process, strains of different 5 microorganisms with phenotypes of interest such as lactose metabolism, glucose fermentation and protein hydrolysis were selected.
- Example 2 Optimization of the production process of a casein-free dairy derivative 5 enriched in short chain fatty acids and hydroxylated short chain fatty acids
- Condition 3 was selected as the production process of a casein-free dairy derivative containing short-chain fatty acids and hydroxylated short-chain fatty acids.
- Example 3 Comparative example between formulations with different compositions of microorganisms
- microorganism Bacillus sp. strain K03B01 had the highest hydrolysis capacity of 0 casein, this microorganism was selected for the process, while the microorganisms Lactobacillus sp. strain K03D08 and Kazachstania sp. strain K03K02G were selected for their ability to metabolize lactose and glucose and produce short chain fatty acids and hydroxylated short chain fatty acids.
- the characterization of the products obtained in each of the combinations of microorganisms and the different 5 production processes is detailed below.
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Abstract
La presente invención corresponde a un grupo de microorganismos, compuesto por Lactobacillus sp. cepa K03D08, Bacillus sp. cepa K03B01 y Kazachstania sp. cepa K03K02G, que permite la hidrólisis de la caseína en diferentes productos lácteos y la producción de ácidos grasos de cadena corta y ácidos grasos de cadena corta hidroxilados; un proceso de obtención de un derivado lácteo libre de caseína y enriquecido en ácidos grasos de cadena corta y ácidos grasos de cadena corta hidroxilados que utiliza los microorganismos antes nombrados; composiciones que contienen los microorganismos; y finalmente al método de producción de cada uno de los microorganismos de la invención.
Description
GRUPO DE MICROORGANISMOS COMPUESTO POR LACTOBACILLUS SR CEPA K03D08, BACILLUS SR CEPA K03B01 Y KAZACHSTANIA SR CEPA K03K02G Y SUS COMPOSICIONES; UN PROCESO DE OBTENCIÓN DE UN DERIVADO LÁCTEO LIBRE DE CASEÍNA QUE CONTENGA ÁCIDOS GRASOS DE CADENA CORTA Y ÁCIDOS GRASOS DE CADENA CORTA HIDROXILADOS GENERADOS POR EL METABOLISMO DEL GRUPO DE MICROORGANISMOS
MEMORIA DESCRIPTIVA
La presente invención corresponde a un grupo de microorganismos que permiten la hidrólisis de caseína en diferentes productos lácteos, composiciones que contienen los microorganismos, método de producción de cada uno de los microorganismos de la invención 5 y un proceso de obtención de un derivado lácteo libre de caseína y que contiene ácidos grasos de cadena corta y ácidos grasos de cadena corta hidroxilados.
ANTECEDENTES Y ARTE PREVIO
Los derivados lácteos con contenidos reducidos en caseína son productos que han aumentado su consumo debido a que muchos de ellos han sido reportados como menos 0 alergénicos en comparación a otros tipos de productos, haciéndolos potencialmente útiles por ejemplo para fórmulas alimenticias de recién nacidos. Los hidrolizados de caseína pueden ser producidos tradicionalmente usando enzimas proteolíticas, las cuales son las encargadas de hidrolizar la caseína (principal proteína de la leche). Sin embargo, el utilizar enzimas en diferentes procesos productivos los encarece ya que las enzimas en sí mismas son los 5 insumos más costosos en diversos procesos productivos. Adicionalmente los productos que poseen un bajo contenido de caseína pueden ser producidos a través de tratamientos térmicos o hidrólisis ácida o alcalina, lo que puede producir degradación severa en varios de los aminoácidos presentes en la leche, disminuyendo su valor nutritivo. Esta pérdida en su valor nutricional genera costos adicionales en el proceso de producción ya que el producto lácteo0 resultante debe ser suplementado con todos los nutrientes que se perdieron durante la etapa de hidrólisis de la caseína. Más aún, los procesos productivos actuales se realizan entre 45 °C y 60 °C, generando costos extras para poder mantener dicho rango de temperatura durante el período de tiempo de producción (entre 36 a 56 horas).
Distintos intentos se han realizado en busca de encontrar soluciones que permitan disminuir 5 costos asociados a este proceso productivo, dentro de las cuales han tomado una importancia relevante la utilización de microorganismos.
Los microorganismos se destacan por ser formas de vida que poseen una amplia diversidad metabólica, que a modo de ejemplo se traduce en la presencia de enzimas hidrolíticas extracelulares (secretadas o ancladas a membrana), capaces de degradar los diferentes sustratos disponibles en su ambiente para que estos puedan ser metabolizados como 5 unidades monoméricas. Dentro de las enzimas de interés están las proteasas ya que estas han sido empleadas en diferentes aplicaciones industriales.
Específicamente en relación con la degradación de las proteínas de la leche, se han descrito publicaciones de documentos de patentes que buscan, en la mayoría de los casos, degradar la caseína mediante métodos enzimáticos por ejemplo el documento US2017037442A1 0 describe un hidrolizado de caseína a través de la hidrólisis controlada de un sustrato rico en esta proteína, utilizando una preparación proteolítica derivada de un hongo del género Aspergillus. Se describe que el hidrolizado producido posee al menos un 98% de reducción en cuanto a su antigenicidad y en relación a los tamaños de los péptidos generados se indica que estos, en general, son mayores a 5 kDa. Se indica que la materia prima rica en caseína 5 puede ser leche de vaca. El documento WO2016066758A1 describe hidrolizados y su uso en el tratamiento y/o prevención de la diarrea, ya que estos hidrolizados inhiben la enzima neprilisina la cual está asociada a esta patología. El método de obtención de estos hidrolizados involucra la incubación de la leche a tratar con preparaciones de proteasas seleccionadas del grupo de proteasas neutrales, proteasas alcalinas, termolisinas y mezclas0 de las mismas. El documento US2011097760A1 describe un método de producción de un hidrolizado de caseína que utiliza una endopeptidasa. En este documento se describe explícitamente cual sería la composición aminoacídica de dicha enzima. El documento US 5486461A describe un método enzimático de obtención de hidrolizados de caseína que emplea tres enzimas proteolíticas diferentes. Se indica adicionalmente que este método5 permite obtener una preparación que hidroliza completamente la caseína.
Sin embargo, debido a los costos asociados que implica la utilización de preparaciones enzimáticas puras, es que ha ido en aumento la divulgación de documentos que describe la degradación de la caseína mediante la utilización de microorganismos.
El documento US2009214498A1 describe en general un método de producción de péptidos0 antimicrobianos mediante la incubación de un cultivo biológicamente puro de Lactobacillus acidophilus, cepa DPC6026, utilizando como materia prima la leche o un producto derivado de la leche.
La degradación de la caseína mediada por microorganismos ha sido descrita principalmente
en el género bacteriano Lactobacillus, genero conocido por encontrarse frecuentemente en productos lácteos. Dentro de las especies de este género que son conocidas por su capacidad de degradar caseína en derivados lácteos, se encuentra la bacteria Lactobacillus lactis.
Sin embargo, el estado del arte no enseña ningún grupo microbiano tal como el que se 5 describe en la presente invención. Específicamente, ningún documento descrito en el estado del arte divulga un grupo de microorganismos asociado a este uso en particular, compuesto por Lactobacillus sp. cepa K03D08, Bacillus sp. cepa K03B01 y Kazachstania sp. cepa K03K02G, que permita obtener un derivado lácteo con un contenido de caseína inferior al 0,5% p/v. Adicionalmente, el proceso descrito en la presente solicitud funciona óptimamente 0 a temperaturas significativamente inferiores (26 °C-37 °C) en comparación al proceso actual (45 °C-60 °C), por lo tanto también se esperan ahorros significativos por este diferencial de temperatura.
Se mantiene entonces como problema de la técnica, el alto costo en cuanto a la utilización de preparaciones enzimáticas para obtener derivados lácteos con un bajo contenido en caseína, 5 y además que los microorganismos disponibles actualmente no pueden actuar eficientemente para realizar este proceso.
BREVE DESCRIPCIÓN DE FIGURAS
Figura 1 . Crecimiento microbiano en medio de cultivo sólido. A: Crecimiento de la cepa Bacillus sp. cepa K03B01 en agar leche descremada. B: Crecimiento de la cepa Lactobacillus sp. cepa0 K03D08 en agar MRS. C: Crecimiento de la cepa Kazachstania sp. cepa K03K02G en agar
Sabouraud.
Figura 2. Tinción gram de las cepas microbianas seleccionadas. A: Bacillus sp. cepa K03B01 . B: Lactobacillus sp. cepa K03D08. C: Kazachstania sp. cepa K03K02G.
Figura 3. Hidrólisis de caseína de las cepas seleccionadas. Evaluación de la hidrólisis de5 caseína en agar leche descremada en Bacillus sp. cepa K03B01 (A), Lactobacillus sp. cepa K03D08 (B) y Kazachstania sp. cepa K03K02G (C). La hidrólisis de caseína se visualiza como un halo translúcido alrededor del pocilio de inoculación.
Figura 4. Hidrólisis de caseína en el derivado lácteo libre de caseína. El ectrofo resis de proteínas en gel de acrilamida de las proteínas presentes en la leche descremada (LD) y en0 las muestras del derivado lácteo de la presente invención (DL), visualizadas con tinción con sales de plata (A) y tinción con azul de Coomassie (B).
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN
La presente invención corresponde a un grupo de microorganismos que permiten la hidrólisis de la caseína en diferentes productos lácteos y la producción de ácidos grasos de cadena 5 corta y ácidos grasos de cadena corta hidroxilados; un proceso de obtención de un derivado lácteo libre de caseína y enriquecido en ácidos grasos de cadena corta y ácidos grasos de cadena corta hidroxilados que utiliza los microorganismos antes nombrados; composiciones que contienen los microorganismos; y finalmente al método de producción de cada uno de los microorganismos de la invención. 0 La presente invención corresponde a un grupo de tres microorganismos que permiten la degradación de la caseína presente en productos lácteos y la producción de ácidos grasos de cadena corta y ácidos grasos de cadena corta hidroxilados. En una realización específica, el proceso comprende al menos una cepa aislada de Bacillus sp., al menos una cepa aislada de Lactobacillus sp., y al menos una cepa aislada de Kazachstania sp. 5 Las cepas fueron identificadas utilizando marcadores conservados. En el caso de la cepa de hongo se utilizó ITS4-ITS5, mientras que en el caso de bacterias se utilizó secuencias de ADNM6S.
Todas las cepas descritas en la presente invención han sido depositadas en la Colección Chilena de Recursos Genéticos Microbianos (CChRGM) de acuerdo al Tratado de Budapest. 0 A continuación, se especifican los números de acceso para cada cepa.
En un segundo aspecto de la invención, la composición que contiene al grupo de microorganismos de la presente invención es una composición en polvo mojable, una5 suspensión concentrada, líquida o en pasta o gel, u otros sistemas como el encapsulamiento
de microorganismos, como por ejemplo microcápsulas, nanopartículas formadas por materiales inorgánicos, como dióxido de silicio, plata u otros, o materiales orgánicos, tales como agentes gelificantes adecuados, como por ejemplo en matrices de polímeros biodegradables tales como agar agar, carragenanos, gelatina, entre otros, y excipientes 5 aceptables en la industria de alimentos.
La composición en polvo mojable y/o líquida de la presente invención comprende al menos una cepa aislada seleccionada entre una cepa aislada del género Bacillus, una cepa aislada de Lactobacillus y al menos una cepa aislada de Kazachstania en una proporción (2:1 :1).
Los excipientes para el caso de una composición en polvo mojable se seleccionan entre: 0 féculas de cereales, lactosa, talco, maltodextrina, tierra de diatomeas, o un portador microbiológicamente aceptable.
En la composición de la presente invención las cepas aisladas de Lactobacillus sp. K03D08 y Kazachstania sp. K03K02G, están presentes en una proporción que puede ser de 1 :1 , 1 :2, 2:1 , 1 :3, 3:1 , 2:3, 3:2, 1 :4, 4:1 , 3:4, 4:3, 1 :5, 5:1 , 1 :6, 6:1 , 1 :7, 7:1 , 1 :8, 8:1 , 1 :9, 9:1 , 1 :10; 10:1 , 5 5:6, 6:5, 6:7, 7:6, 7:8, 8:7, 8:9, 9:8, siendo una proporción ideal la de 1 :1
Para la formulación, los microorganismos provienen de cultivos puros y crecidos en medios de cultivos líquidos ideales para cada una de las cepas indicadas en esta invención.
La cantidad final de los microorganismos en la composición de la presente invención es: la cepa aislada de Lactobacillus sp. K03D08 presente entre 101 y 1015 UFC/ml o UFC/g, la cepa0 aislada de Kazachstania sp. K03K02G está presente entre 101 y 1015 UFC/ml o UFC/g, y la cepa aislada de Bacillus sp. K03B01 está presente entre 101 y 1015 UFC/ml o UFC/g.
Además, la presente invención divulga un procedimiento de obtención de cada uno de los microorganismos, y este procedimiento involucra los siguientes pasos:
1) Cultivar la cepa de Lactobacillus sp. K03D08 por 12-96 h, con una agitación de 5-3005 rpm y 20-37 °C, en medio Man, Rogosa y Sharpe (MRS: 1% p/v peptona, 0,8% p/v extracto de carne, 0,4% p/v extracto de levadura, 2% p/v glucosa, 0,2% p/v fosfato hidrogenado dipotásico, 0,5% p/v acetato de sodio trihidratado, 0,2% p/v citrato triamonio, 0,02% p/v sulfato de magnesio heptahidratado, 0,005% p/v sulfato de manganeso tetra hidratad o, 0,1 % p/vtween 80, pH final 6,2 - 6,5). 0 2) Cultivar la cepa de Bacillus sp. K03B01 en medio leche descremada (0,25% p/v extracto de levadura, 0,1 % p/vglucosa, 0,1 % p/v leche descremada, pH final 6,0 - 7,0),
por 12-96 h, a 5-300 rpm y 20-37 °C.
3) Cultivar la cepa de Kazachstania sp. K03K02G en medio leche descremada (0,25% p/v extracto de levadura, 0,1% p/v glucosa, 0,1 % leche descremada, pH final 6,0 - 7,0), por 12-96 h, a 5-300 rpm y 20-37 °C.
5 4) Centrifugar cada cultivo de los microorganismos entre 1 .000 y 4.000 rpm por 5-30 min a 4-25 °C.
5) Descartar el sobrenadante y suspender las células microbianas en igual volumen de suero fisiológico (NaCI 0,9 % p/v).
6) Cuantificar la densidad óptica de las suspensiones obtenidas en el punto 5) a una0 longitud de onda de 595-600 nm (D.O. 600 nm).
La presente invención adicionalmente divulga un proceso de producción de un derivado lácteo con un bajo contenido de caseína que comprende las siguientes etapas: a) Incubar la cepa Bacillus sp. K03B01 en leche de origen bovino entre 6 y 120 horas y a una temperatura entre 20°C y 37°C, en una proporción entre 0,1-10 % p/v o 0,1-10 % 5 p/p, con una agitación entre 5-300 rpm. b) Preparar una composición que comprenda los microorganismos Lactobacillus sp. K03D08 y Kazachstania sp. K03K02G en una proporción (1 :1). c) Incorporar la composición obtenida en el punto b) a la solución obtenida en el punto a) e incubar por 12 y 120 horas y una temperatura 20-37 °C, con aireación mediante0 agitación de entre 0-50 rpm. d) Centrifugar la solución obtenida en el punto c), entre 4.000 a 10.000 rpm y recuperar el sobrenadante. e) Filtrar el sobrenadante con una membrana de 1-1000 pm de diámetro de poro f) Filtrar el sobrenadante con una membrana de 0,2-0,45 pm de diámetro de poro.5 g) Recuperar el filtrado h) Liofilizar el filtrado obtenido en el punto f) hasta deshidratación total a -80°C y entre 5- 15 mTorr (666,6 Pa a 1999,8 Pa).
En una realización más específica el período de incubación de la leche de origen bovino con Bacillus sp. K03B01 es entre 12 y 96 horas. 0 En una realización preferida más específica la temperatura de incubación de Bacillus sp. K03B01 con la leche de origen bovino es entre 26 °C y 37 °C.
En el contexto de la presente invención se entiende como parte del conocimiento de un
experto los métodos de preparación y cultivo de las cepas aisladas. En los ejemplos que se acompañan posteriormente en este documento, se muestran métodos representativos que buscan ilustrar la presente invención, pero no limitar su alcance.
EJEMPLOS
5 Ejemplo 1 : Obtención y selección de microorganismos capaces de reducir caseína y lactosa presente en productos lácteos
Las cepas presentadas en la presente invención fueron obtenidas a partir de fermentados lácteos del tipo probióticos y pertenecientes al Centro de Micro-Bioinnovación (Universidad de Valparaíso, Valparaíso, Chile). Estos fermentados fueron caracterizados previamente a través 0 de estudios microbiológicos y metagenómicos, identificándose genes y enzimas relacionados a la hidrólisis de caseína y lactosa, además de la producción de ácidos grasos de cadena corta. En este sentido se consideró que los fermentados son fuentes naturales de microorganismos, genes, enzimas y biomoléculas de interés aplicado, y por tanto la fuente u origen de las cepas de la presente invención. 5 Con el objetivo de aislar los microorganismos presentes en estos fermentados lácteos, se realizaron diluciones seriadas en suero fisiológico y se sembraron en agar leche descremada suplementado con extracto de levadura y casaminoácidos. A partir de estos cultivos microbianos se realizó el aislamiento y selección de las colonias crecidas a una temperatura de 30 °C. Con las colonias se procedió a generar un banco de microorganismos. Para0 determinar las propiedades y actividades de interés, cada una de las cepas aisladas se crecieron en los siguientes medios de cultivo selectivos (Tabla 1).
Tabla 1 . Medios de cultivos utilizados y fenotipos relevantes
Las cepas aisladas fueron caracterizadas, microbiológicamente (tinción gram, morfología) (Figura 2, Tabla 2), molecularmente (Tabla 3) y bioquímicamente (Tabla 4). Adicionalmente, se determinó la capacidad de estas cepas microbianas de hidrolizar la caseína presente en la leche (Tabla 5). A partir de este proceso, se seleccionaron cepas de diferentes 5 microorganismos con fenotipos de interés tales como el metabolismo de lactosa, la fermentación de glucosa y la hidrólisis de proteínas.
Tabla 2. Caracterización de las cepas seleccionadas y fenotipos relevantes
0 Tabla 3. Caracterización molecular de las cepas seleccionadas, mediante la amplificación y secuenciación del ADNr 16S para las cepas K03B01 y K03D08 mientras que para la cepa K03K02G se utilizó la región ITS4-ITS5.
Tabla 4. Actividad enzimática de las cepas seleccionadas
5
Tabla 5. Hidrólisis de caseína en las cepas seleccionadas
* Cuantificación de caseína en el cultivo de leche descremada inoculados e incubadas con las cepas
seleccionadas.
Ejemplo 2: Optimización del proceso de producción de un derivado lácteo libre de caseína 5 enriquecido en ácidos grasos de cadena corta y ácidos grasos de cadena corta hidroxilados
Durante el presente desarrollo se evaluaron tres procesos productivos para la obtención de un derivado lácteo, libre de caseína, bajo en lactosa y enriquecido en ácidos grasos de cadena corta y ácidos grasos de cadena corta hidroxilados. En estas condiciones se evaluaron, los microorganismos a utilizar en el proceso y las condiciones fisicoquímicas del mismo. 0
Tabla 6. Condiciones de producción evaluadas para el derivado lácteo
N.D.: No detectado
A partir de las condiciones evaluadas se seleccionó la Condición 3 como proceso productivo de un derivado lácteo libre de caseína que contiene ácidos grasos de cadena corta y ácidos 5 grasos de cadena corta hidroxilados.
Ejemplo 3: Ejemplo comparativo entre formulaciones con diferentes composiciones de microorganismos
Debido a que el análisis de las cepas de manera individual permitió establecer que el microorganismo Bacillus sp. cepa K03B01 presentaba la mayor capacidad de hidrólisis de 0 caseína, este microorganismo fue seleccionado para el proceso, mientras que los microorganismos Lactobacillus sp. cepa K03D08 y Kazachstania sp. cepa K03K02G fueron seleccionados por su capacidad de metabolizar lactosa y glucosa y producir ácidos grasos de cadena corta y ácidos grasos de cadena corta hidroxilados. La caracterización de los productos obtenidos en cada una de las combinaciones de microorganismos y los diferentes 5 procesos productivos se detalla a continuación.
Tabla 7. Caracterización del derivado lácteo generado a través de los diferentes procesos productivos
ND: No detectado 0
Tabla 8. Caracterización de la el derevidado lácteo obtenido en la presente invención y de la leche descremada utilizada como sustrato para el proceso productivo
N.D.: No detectado
Claims
1 . Un grupo de microorganismos, CARACTERIZADO porque consiste de: a) una cepa de Bacillus sp. K03B01 , depositada en la Colección Chilena de Recursos
5 Genéticos Microbianos (CChRGM) con numero de acceso 2934; b) una cepa de Lactobacillus sp. K03D08, depositada en la Colección Chilena de Recursos Genéticos Microbianos (CChRGM) con numero de acceso RGM2950; y c) una cepa de Kazachstania sp. K03K02G, depositada en la Colección Chilena de Recursos Genéticos Microbianos (CChRGM) con numero de acceso 2935. 0
2. Composiciones útiles para producir un derivado lácteo con un contenido de caseína inferior al 0,5 % p/v y que contenga ácidos grasos de cadena corta y ácidos grasos de cadena corta hidroxilados, CARACTERIZADAS porque las composiciones son las siguientes: 5 a) una primera composición que comprende la cepa de Bacillus sp. K03B01 de acuerdo a la reivindicación 1 punto a), y excipientes aceptables en la industria de alimentos; b) una segunda composición que comprende la cepa de Lactobacillus sp. K03D08 de acuerdo a la reivindicación 1 punto b), y que además comprende la cepa de0 Kazachstania sp. K03K02G de acuerdo a la reivindicación 1 punto c), y excipientes aceptables en la industria de alimentos.
3. Método de producción de las composiciones de microorganismos de acuerdo con la reivindicación 2, CARACTERIZADO porque comprende las siguientes etapas: 5 a) cultivar la cepa de Bacillus sp. K03B01 entre 12 y 96 h, con una agitación entre 5 y 300 rpm y a una temperatura entre 20 °C y 37 °C, en un medio de cultivo que contiene leche descremada; b) cultivar la cepa de Lactobacillus sp. K03D08, entre 12 y 96 h, con una agitación entre 5 y 300 rpm y a una temperatura entre 20 °C y 37 °C, en un medio de0 cultivo microbiológico adecuado; c) cultivar la cepa de Kazachstania sp. K03K02G, entre 12 y 96 h, con una agitación entre 5 y 300 rpm y a una temperatura entre 20 °C y 37 °C, en un medio de cultivo microbiológico adecuado; d) centrifugar cada cultivo de los microorganismos entre 1 .000 y 4.000 rpm por 5-5 30 min entre 4 °C y 25 °C.
e) descartar el sobrenadante y suspender las células microbianas en igual volumen de suero fisiológico (NaCI 0,9 % p/v); f) cuantificar la densidad óptica de las suspensiones de células microbianas a una longitud de onda de 600 nm;
5 g) preparar una primera composición que comprende la cepa de Bacillus sp. K03B01 ; y h) preparar una segunda composición que comprende la cepa de Lactobacillus sp. K03D08 y que comprende la cepa de Kazachstania sp. K03K02G en una proporción 1 :1 , respectivamente. 0
4. Método de producción de acuerdo con la reivindicación 3, CARACTERIZADO porque el medio de cultivo del punto a) tiene la siguiente composición:
0,25% p/v extracto de levadura;
0,1% p/v glucosa; 5 0,1% p/v leche descremada; y - pH final 6,0 - 7,0
5. Método de producción de acuerdo con la reivindicación 3, CARACTERIZADO porque el medio de cultivo de los puntos b) y c) comprende: 1 % p/v peptona, 0,8% p/v extracto0 de carne, 0,4% p/v extracto de levadura, 2% p/v glucosa, 0,2% p/v fosfato hidrogenado dipotásico, 0,5% p/v acetato de sodio trihidratado, 0,2% p/v citrato triamonio, 0,02% p/v sulfato de magnesio hepta hidratad o, 0,005% p/v sulfato de manganeso tetrahidratado, 0,1% p/vtween 80, pH final 6,2 - 6,5. 5 6. Método de producción de un derivado lácteo con un bajo contenido de caseína y que contenga ácidos grasos de cadena corta y ácidos grasos de cadena corta hidroxilados, CARACTERIZADO porque comprende las siguientes etapas: i. incubar la cepa de Bacillus sp. K03B01 en leche de origen bovino entre 6 y 120 horas y a una temperatura entre 20 °C y 37 °C, en una proporción entre 0,1-100 % p/v o 0,1-10 % p/p, con una agitación entre 5-300 rpm; ii. preparar una composición que comprenda los microorganismos Lactobacillus sp. K03D08 y Kazachstania sp. K03K02G en una proporción (1 :1); iii. incorporar la composición obtenida en el punto ii) a la solución obtenida en el punto i) e incubar por entre 12 y 120 horas y una temperatura entre 20 °C y 375 °C, con aireación mediante agitación de entre 0-50 rpm;
iv. centrifugar la solución obtenida en el punto iii), entre 4.000 a 10.000 rpm y recuperar el sobrenadante; v. filtrar el sobrenadante con una membrana de 0,2-0,45 pm de diámetro de poro; vi. recuperar el filtrado; y vii. liofilizar el filtrado obtenido en el punto vi) hasta deshidratación total a -80 °C y entre 5-15 mTorr (666,6 Pa a 1999,8 Pa).
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