JPWO2007013426A1 - 発酵乳の製造方法及び発酵乳飲食品 - Google Patents
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- A23V2400/00—Lactic or propionic acid bacteria
- A23V2400/11—Lactobacillus
- A23V2400/147—Helveticus
Abstract
血圧降下作用等の有用な機能を有する特定のペプチドを、発酵乳中に効率良く産生させることができ、しかも発酵乳飲食品に、優れた風味や血圧降下作用等の機能性を簡便に付与することができる発酵乳の製造方法及び該発酵乳を利用した、風味に優れ、機能性をも付与可能な発酵乳飲食品を提供する。本発明の製造方法は、パパイン等の特定のプロテアーゼを含むプロテアーゼ(1)により獣乳カゼインを酵素分解する工程(A)と、獣乳カゼイン等を、乳酸菌発酵する工程(B)とを組合せ、VPP、IPP、YPを生成させることを特徴とし、本発明の発酵乳飲食品は、本発明の製造方法で得られた発酵乳又はその濃縮物を含み、飲用時換算で、特定量以上のVPP、IPP及びYPを含むことを特徴とする。
Description
本発明は、血圧降下作用等の有用な機能が確認されているVal Pro Pro、Ile Pro Pro及びTyr Pro等のペプチドを発酵乳中に効率良く産生させることができ、しかも発酵乳飲食品として利用可能な、優れた風味等を簡便に付与することができる発酵乳の製造方法及び該方法により得られた発酵乳を利用した発酵乳飲食品に関する。
従来、血圧降下作用等の有用機能を示すペプチドが、食品用蛋白質の酵素分解物や発酵食品から分離、報告されている。特に、カルボキシ末端にPro残基を有するペプチドは、生体内で血圧調節を行う、いわゆるアンジオテンシン変換酵素(ACE)阻害活性を有する物が多く、生体内で血圧降下作用を発現することが示されている。血圧降下作用を示すペプチドの中でも、特に、乳蛋白質カゼインの分解ペプチドであるVal Pro Pro、Ile Pro ProあるいはTyr Proが、自然発症高血圧ラットに対して強い血圧抑制効果を示したことが非特許文献１及び２に報告されている。
上記機能性ペプチドの製造方法としては、例えば、特許文献１に、乳成分をラクトバチルス・ヘルベティカス等の乳酸菌で発酵させて製造する方法が記載されている。また、特許文献２〜４には、主要乳蛋白質カゼインを酵素分解により製造する方法が提案されている。
特許文献２〜４に示される酵素分解による方法においては、酵素の使用量や条件を適切に設定することにより、前記機能性ペプチドを効率良く生産することができる。
しかし、このような酵素分解により得られる機能性ペプチドを、該ペプチドが高濃度で含まれる風味良好な発酵乳食品等の乳加工製品に利用しようとする場合、酵素分解後に純化、濃縮、粉化等を行う必要があり、製造工程が煩雑化することが避けられない。
一方、上記乳酸菌の発酵を利用する方法においては、飲食品又はその原料とすることが可能な発酵乳を直接得ることができ、該発酵乳中に機能性ペプチドを産生させることができるので、機能性ペプチドの純化、濃縮、粉化等を必ずしも行うことなく、得られる発酵乳を乳加工製品等へ容易に利用することが可能である。
しかし、特許文献１に記載された乳酸菌による発酵を利用する方法では、発酵乳中に未分解カゼインが多く含まれ、直接得られる発酵乳中における機能性ペプチドの含有割合が低かったため、更に機能性ペプチドの生産効率を改善する方法の開発が望まれていた。
そこで、特許文献５において、血圧降下作用等を示す機能性ペプチドの生産性を改善でき、カゼイン分解をより効率良く行うことができる特定の乳酸菌、並びに該乳酸菌を用いた発酵乳が提案された。
特許文献２〜４に示される酵素分解による方法においては、酵素の使用量や条件を適切に設定することにより、前記機能性ペプチドを効率良く生産することができる。
しかし、このような酵素分解により得られる機能性ペプチドを、該ペプチドが高濃度で含まれる風味良好な発酵乳食品等の乳加工製品に利用しようとする場合、酵素分解後に純化、濃縮、粉化等を行う必要があり、製造工程が煩雑化することが避けられない。
一方、上記乳酸菌の発酵を利用する方法においては、飲食品又はその原料とすることが可能な発酵乳を直接得ることができ、該発酵乳中に機能性ペプチドを産生させることができるので、機能性ペプチドの純化、濃縮、粉化等を必ずしも行うことなく、得られる発酵乳を乳加工製品等へ容易に利用することが可能である。
しかし、特許文献１に記載された乳酸菌による発酵を利用する方法では、発酵乳中に未分解カゼインが多く含まれ、直接得られる発酵乳中における機能性ペプチドの含有割合が低かったため、更に機能性ペプチドの生産効率を改善する方法の開発が望まれていた。
そこで、特許文献５において、血圧降下作用等を示す機能性ペプチドの生産性を改善でき、カゼイン分解をより効率良く行うことができる特定の乳酸菌、並びに該乳酸菌を用いた発酵乳が提案された。
ところで、非特許文献３において、Val Pro Pro及びIle Pro Proを有効成分として血圧降下作用を得るためには、これらの合計換算値として、一日の成人への有効量を３．４ｍｇ以上とすることが報告されている。例えば、上記特許文献５に記載された乳酸菌による発酵乳を用いて、前記有効量のペプチドを含む血圧降下機能を有する最終製品を製造する場合には、該発酵乳を６０ｍｌ以上利用して最終製品を製造する必要がある。
一方、近年、発酵乳飲食品においては、更なる風味改善効果を目指した技術開発が求められている。そこで、発酵乳飲食品のレシピ開発をより容易とし、より風味の高い機能性食品素材や機能性ペプチドの有効量を高めた発酵乳飲食品を得るために、乳酸菌発酵乳内の機能性ペプチド濃度を更に高めることができる発酵乳の製造方法等が望まれている。
特許第２７８２１４２号公報
特開平６−１２８２８７号公報
特開２００１−１３６９９５号公報
WO２００５／０１２５４２号パンフレット
特許第３０２８４１１号公報
Nakamura et al. J. Dairy Sci. 78: p1253-1257(1995)
Yamamoto et al. J. Dairy Sci. 82:p1388-1393(1995)
Hata et al. Am J. Clin. Nutr., p767-771(1996)
一方、近年、発酵乳飲食品においては、更なる風味改善効果を目指した技術開発が求められている。そこで、発酵乳飲食品のレシピ開発をより容易とし、より風味の高い機能性食品素材や機能性ペプチドの有効量を高めた発酵乳飲食品を得るために、乳酸菌発酵乳内の機能性ペプチド濃度を更に高めることができる発酵乳の製造方法等が望まれている。
本発明の課題は、血圧降下作用等の有用な機能を有する特定のペプチドを、発酵乳中に効率良く産生させることができ、しかも発酵乳飲食品に、優れた風味や血圧降下作用等の機能性等を簡便に付与することができる発酵乳の製造方法及び該発酵乳を利用した、風味に優れ、機能性をも付与可能な発酵乳飲食品を提供することにある。
本発明によれば、パパイン、ブロメライン及びこれらと類似の酵素反応を示すスーパーファミリーに属するプロテアーゼの少なくとも１種を含むプロテアーゼ(1)により獣乳カゼインを酵素分解する工程(A)と、獣乳カゼイン及び／又は獣乳カゼインの前記プロテアーゼ(1)による酵素分解物を、乳酸菌発酵する工程(B)とを組合せ、Val Pro Pro(以下、VPPと略す場合がある)、Ile Pro Pro(以下、IPPと略す場合がある)及びTyr Pro(以下、YPと略す場合がある)の少なくとも１種を生成させることを特徴とする発酵乳の製造方法が提供される。
また本発明によれば、前記製造方法において、前記獣乳カゼインとして、カゼイン濃度が3〜10重量％の獣乳を用い、前記プロテアーゼ(1)の添加量を、カゼイン量に対して0.005〜0.1重量％にして得られた発酵乳又はその濃縮物を含む発酵乳飲食品であって、Val Pro Proを1.2ｍｇ／100ml以上、Ile Pro Proを1.0mg／100ml以上及びTyr Proを0.5mg／100ml以上含むことを特徴とする発酵乳飲食品が提供される。
また本発明によれば、前記製造方法において、前記獣乳カゼインとして、カゼイン濃度が3〜10重量％の獣乳を用い、前記プロテアーゼ(1)の添加量を、カゼイン量に対して0.005〜0.1重量％にして得られた発酵乳又はその濃縮物を含む発酵乳飲食品であって、Val Pro Proを1.2ｍｇ／100ml以上、Ile Pro Proを1.0mg／100ml以上及びTyr Proを0.5mg／100ml以上含むことを特徴とする発酵乳飲食品が提供される。
本発明の発酵乳の製造方法は、前記工程(A)及び工程(B)を組合せているので、血圧降下作用等の有用な機能を有する特定のペプチドを、発酵乳中に効率良く産生させることができる。しかも発酵乳飲食品に、優れた風味や血圧降下作用等の機能性等を簡便に付与することができる。特に、工程(A)及び(B)を同時に行うことにより、製造工程が簡便になると共に、特定ペプチドの産生効率も向上させることができる。
本発明の発酵乳飲食品は、本発明の製造方法により得られた、有用な機能を有する特定ペプチドを多く含む発酵乳を利用するので、風味調整が容易で、風味に優れ、機能性をも付与可能な発酵乳飲食品とすることができる。
本発明の発酵乳飲食品は、本発明の製造方法により得られた、有用な機能を有する特定ペプチドを多く含む発酵乳を利用するので、風味調整が容易で、風味に優れ、機能性をも付与可能な発酵乳飲食品とすることができる。
以下、本発明を更に詳細に説明する。
本発明の製造方法は、特定のプロテアーゼ(1)により獣乳カゼインを酵素分解する工程(A)を含む。
前記特定のプロテアーゼ(1)は、パパイン、ブロメライン及びこれらと類似の酵素反応を示すスーパーファミリーに属するプロテアーゼの少なくとも１種を含む。該プロテアーゼ(1)は、特にVPP、IPP、YP等のペプチド配列を有するβ-カゼインに対する特異性を示し、通常の乳酸菌発酵における獣乳カゼインの初期の分解加工で不足すると思われるプロテアーゼ活性を補足及び強化し、所望の機能性を有するペプチドの生成率を高くすることが可能なプロテアーゼを含む。
本発明の製造方法は、特定のプロテアーゼ(1)により獣乳カゼインを酵素分解する工程(A)を含む。
前記特定のプロテアーゼ(1)は、パパイン、ブロメライン及びこれらと類似の酵素反応を示すスーパーファミリーに属するプロテアーゼの少なくとも１種を含む。該プロテアーゼ(1)は、特にVPP、IPP、YP等のペプチド配列を有するβ-カゼインに対する特異性を示し、通常の乳酸菌発酵における獣乳カゼインの初期の分解加工で不足すると思われるプロテアーゼ活性を補足及び強化し、所望の機能性を有するペプチドの生成率を高くすることが可能なプロテアーゼを含む。
前記パパイン、ブロメライン及びこれらと類似の酵素反応を示すスーパーファミリーに属するプロテアーゼは、通常、(Xaa)m Val Pro Pro (Xbb)n、(Xaa)m Ile Pro Pro (Xbb)n又は(Xaa)m Tyr Pro (Xbb)nで示されるペプチドの少なくとも１つを(Xaa)mのカルボキシ末端で切断するプロテアーゼを含む。ここで、Xaa及びXbbは独立に任意のアミノ酸を示す。前記ペプチド配列の１つにおけるXaaは他のペプチド配列におけるXaaと同一若しくは異なっていても良く、前記ペプチド配列の１つにおけるXbbは他のペプチド配列におけるXbbと同一若しくは異なっていても良い。ｍ及びｎは整数であって、ｍが２以上の場合には、Xaaは同一若しくは異なっていても良い。またｎが２以上の場合には、Xbbは同一若しくは異なっていても良い。
パパインとしては、パパイア抽出物を用いることができ、ブロメラインとしては、パイナップル抽出物を用いることができる。
パパインとしては、パパイア抽出物を用いることができ、ブロメラインとしては、パイナップル抽出物を用いることができる。
前記スーパーファミリーに属するプロテアーゼとしては、例えば、アナナイン(ananain)、アナナーゼ(ananase)、エクストラナーゼ(extranase)、ピナーゼ(pinase)、パイナップル・エンザイム(pineapple enzyme)、トラウマナーゼ(traumanase)、パパイヨチン(papayotin)、スメトリン(summetrin)、べラルドン(velardon)、パパイア・ペプチダーゼ(papaya peptidase）、キモパパイン（chymopapain）、パパイア・プロティナーゼ（papaya proteinase）、PPIV、カリカイン(caricain)、プロテアーゼ・オメガ(proteinase omega)、C1ペプチダーゼ・ファミリー(peptidase family C1)に属する酵素等のパパインのように活性中心にシステインを有する植物性システインペプチダーゼ等が挙げられ、特に、パパインのサブファミリーに属するプロテアーゼが好ましく挙げられる。また、これらの酵素と活性中心の相同性が極めて高く類似の基質特異性を有すると思われるカテプシン(cathepsin)等も含まれる。
工程(A)に用いるプロテアーゼ(1)は、複数の酵素の混合物であっても良いし、分解性を高める目的で上記以外の特定のプロテアーゼを含んでいても良い。
プロテアーゼ(1)として市販品を用いることもでき、例えば、商品名パパインF(天野エンザイム社製)、商品名VERON L10(樋口商会製)、商品名ブロメライン(Great Food Co., Ltd.製又はジェネンコア協和製)、商品名パパインW-40(天野エンザイム社製)、食品用精製パパイン(ナガセケムテックス社製)を用いることができる。
プロテアーゼ(1)として市販品を用いることもでき、例えば、商品名パパインF(天野エンザイム社製)、商品名VERON L10(樋口商会製)、商品名ブロメライン(Great Food Co., Ltd.製又はジェネンコア協和製)、商品名パパインW-40(天野エンザイム社製)、食品用精製パパイン(ナガセケムテックス社製)を用いることができる。
工程(A)又は後述する工程(B)に用いる獣乳カゼインは、血圧降下作用等の機能性を有するVPP、IPP及びYPのペプチド配列を有する獣乳カゼインを含む食品素材であれば特に限定されない。例えば、牛乳を初めとする獣乳、脱脂粉乳、加工乳、獣乳カゼイン抽出物が挙げられ、これらに更に、ビタミン類、核酸、酵母エキス等の乳酸菌発酵助剤を添加した食品素材が挙げられる。
本発明の製造方法により用いる獣乳カゼインにおいて、カゼイン濃度は特に限定されないが、本発明の所望の効果をより効率的に得るために、通常3〜15重量％程度であり、好ましくは3〜10重量％である。
本発明の製造方法により用いる獣乳カゼインにおいて、カゼイン濃度は特に限定されないが、本発明の所望の効果をより効率的に得るために、通常3〜15重量％程度であり、好ましくは3〜10重量％である。
工程(A)において、プロテアーゼ(1)の使用量は、所望の効果を有するように力価を考慮して適宜決定することができるが、後述する工程(B)の乳酸菌発酵と組合せるため、獣乳カゼインをプロテアーゼだけで酵素分解するよりも通常少ない使用量で目的を達成することができる。例えば、プロテアーゼ(1)を、獣乳カゼイン量に対して0.005〜0.1重量％の割合とすることが好ましい。0.005重量％未満では、本発明の所望の効果が得られない恐れがあり、0.1重量％を超える場合には、生成するペプチド類が過剰になり、風味の点において損なわれる恐れがある。
工程(A)において、酵素分解条件は、プロテアーゼ(1)の至適温度及びpHで行うことができ、通常25〜45℃において、pHを中性程度に維持して行うことができる。酵素分解時間は、プロテアーゼ(1)の量及び力価に応じて適宜選択することができる。
工程(A)において、酵素分解条件は、プロテアーゼ(1)の至適温度及びpHで行うことができ、通常25〜45℃において、pHを中性程度に維持して行うことができる。酵素分解時間は、プロテアーゼ(1)の量及び力価に応じて適宜選択することができる。
工程(A)を後述する工程(B)に先立って行なう場合には、酵素分解後に、プロテアーゼ(1)を60〜100℃程度で失活させ、次に工程(B)に供することができる。また、工程(A)を後述する工程(B)と同時に、即ち、前記プロテアーゼ(1)と乳酸菌との両方を含む培地で、獣乳カゼインを酵素分解及び乳酸菌発酵する場合には、通常25〜45℃において乳酸菌の最適増殖条件温度に合わせ、また、乳酸菌発酵時間は、通常5〜30時間の条件で行うことが好ましい。この際、酵素添加量を増加することで発酵時間を短縮することも可能である。
本発明の製造方法は、獣乳カゼイン及び／又は獣乳カゼインの前記プロテアーゼ(1)による酵素分解物を、乳酸菌発酵する工程(B)を含む。
工程(B)に用いる獣乳カゼインとしては、上述の獣乳カゼインを用いることができ、該獣乳カゼインを用いる場合には、上述のとおり、工程(A)と工程(B)とを同時に実施する。一方、前記プロテアーゼ(1)による酵素分解物を工程(B)により乳酸菌発酵する場合には、工程(A)終了後に工程(B)を実施することができる。
工程(B)に用いる獣乳カゼインとしては、上述の獣乳カゼインを用いることができ、該獣乳カゼインを用いる場合には、上述のとおり、工程(A)と工程(B)とを同時に実施する。一方、前記プロテアーゼ(1)による酵素分解物を工程(B)により乳酸菌発酵する場合には、工程(A)終了後に工程(B)を実施することができる。
工程(B)に用いる乳酸菌としては、ストレプトコッカス属、ラクトコッカス属、ラクトバチルス属、ビフィドバクテリウム属等に属する乳酸菌が挙げられるが、ラクトバチルス属が好ましい。具体的には、例えば、ラクトバチルス・ブルガリカス(Lactobacillus bulgaricus)、ラクトバチルス・ヘルベティカス(Lactobacillus helveticus)、ラクトバチルス・カゼイ(Lactobacillus casei)、ラクトバチルス・アシドフィラス(Lactobacillus acidophilus)、ラクトバチルス・ファーメンタム(Lactobacillus fermentum)等が挙げられ、特に、ラクトバチルス・ヘルベティカス又はラクトバチルス・アシドフィラス、ラクトバチルス・ブルガリカス、ラクトバチルス・カゼイが、VPP、IPP、YPをより効率的に産生させることができる点で好適である。使用に際しては、これらは２種以上用いることもできる。
前記ラクトバチルス・ヘルベティカスの菌株としては、菌体外プロティナーゼ活性の高いものが好ましい。例えば、Twiningらの方法(Twining, S. Anal. Biochem. 143 3410 (1984))をもとにしたYamamotoらの方法(Yamamoto, N.ら J.Biochem. (1993) 114, 740)に準じて測定したU／OD590の値が400以上を示す菌株が好ましい。
例えば、ラクトバチルス・ヘルベティカス CM4株(独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター 日本国茨城県つくば市東1-1-1中央第6 寄託番号：FERM BP-6060、寄託日1997.8.15)(以下、CM4と称す)が挙げられる。このCM4は、特許手続上の微生物寄託の国際的承認に関するブタペスト条約に上記寄託番号で登録されており、この株は既に特許されている。
例えば、ラクトバチルス・ヘルベティカス CM4株(独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター 日本国茨城県つくば市東1-1-1中央第6 寄託番号：FERM BP-6060、寄託日1997.8.15)(以下、CM4と称す)が挙げられる。このCM4は、特許手続上の微生物寄託の国際的承認に関するブタペスト条約に上記寄託番号で登録されており、この株は既に特許されている。
前記乳酸菌は、あらかじめ前培養しておいた十分に活性の高いスターターとして用いることが好ましい。初発菌数は、好ましくは105〜109個／ml程度である。
得られる発酵乳の風味等をより良好にするために、前記乳酸菌に酵母を併用して工程(B)を行うこともできる。酵母の菌種は特に限定されないが、例えば、サッカロマイセス・セレビシェ等のサッカロマイセス属酵母が好ましく挙げられる。酵母の含有割合は、その目的に応じて適宜選択することができる。
また乳酸菌発酵においては、種々の乳酸菌発酵補助剤を添加することも可能である。該補助剤としては、例えば、アミノ酸、ビタミン、ミネラル、核酸、塩類、微生物エキス、デタージェント剤が挙げられる。
工程(B)において、乳酸菌発酵条件は、工程(A)と同時に行う場合も、又は工程(A)の後に行う場合も、乳酸菌の最適増殖条件温度に合わせて、通常25〜45℃において、通常5〜30時間の条件で行うことが好ましい。また、発酵を促進する目的で中和培養することが好適である。
得られる発酵乳の風味等をより良好にするために、前記乳酸菌に酵母を併用して工程(B)を行うこともできる。酵母の菌種は特に限定されないが、例えば、サッカロマイセス・セレビシェ等のサッカロマイセス属酵母が好ましく挙げられる。酵母の含有割合は、その目的に応じて適宜選択することができる。
また乳酸菌発酵においては、種々の乳酸菌発酵補助剤を添加することも可能である。該補助剤としては、例えば、アミノ酸、ビタミン、ミネラル、核酸、塩類、微生物エキス、デタージェント剤が挙げられる。
工程(B)において、乳酸菌発酵条件は、工程(A)と同時に行う場合も、又は工程(A)の後に行う場合も、乳酸菌の最適増殖条件温度に合わせて、通常25〜45℃において、通常5〜30時間の条件で行うことが好ましい。また、発酵を促進する目的で中和培養することが好適である。
本発明の製造方法では、工程(A)を行わない通常の乳酸菌発酵のみよりも、VPP、IPP、YPのいずれかを多く含む発酵乳を得ることができる。しかも、工程(B)を含むので、VPP、IPP、YP等のペプチドを含む生成物を直接に発酵乳として得ることができる。更に、工程(B)を工程(A)の後に行っても、工程(A)と工程(B)とを同時に行っても、VPP、IPP、YPの少なくとも１つが、乳酸菌発酵のみよりも多く生成されることが期待される。
本発明の発酵乳飲食品は、前記製造方法において、前記獣乳カゼインとして、カゼイン濃度が3〜10重量％の獣乳を用い、前記プロテアーゼ(1)の添加量を、カゼイン量に対して0.005〜0.1重量％にして得られた発酵乳又はその濃縮物を含む発酵乳飲食品であって、VPPを1.2mg／100ml以上、IPPを1.0mg／100ml以上及びYPを0.5mg／100ml以上含む。
尚、本発明の発酵乳飲食品において、含有される特定のペプチド量の測定は、種々のHPLC法を用いた方法により測定できるが、より多くの種類のペプチドを簡易的に評価するためのひとつの方法としてLC／MS法が用いられる。LC／MS分析法としては既に報告されているMatsuuraらによる方法(Milchwissenschaft、2004、60, 24-27)が用いられる。
尚、本発明の発酵乳飲食品において、含有される特定のペプチド量の測定は、種々のHPLC法を用いた方法により測定できるが、より多くの種類のペプチドを簡易的に評価するためのひとつの方法としてLC／MS法が用いられる。LC／MS分析法としては既に報告されているMatsuuraらによる方法(Milchwissenschaft、2004、60, 24-27)が用いられる。
本発明の発酵乳飲食品は、本発明の製造方法で得られた前記発酵乳又はその濃縮物をもちいて、例えば、ヨーグルト、乳酸菌飲料、乳製品乳酸菌飲料、その他さまざまな加工乳飲食品とすることができ、常温乳飲料、チルド乳飲料、一般食品、栄養補助食品等の形態とすることができる。
本発明の発酵乳飲食品には、その形態に応じて、栄養的バランスや風味の改善の観点から様々な補助添加物を添加することができる。例えば、炭水化物、脂質、ビタミン類、ミネラル類、栄養性添加物、甘味料、香料、色素、テクスチュア改善剤等が挙げられる。
本発明の発酵乳飲食品には、その形態に応じて、栄養的バランスや風味の改善の観点から様々な補助添加物を添加することができる。例えば、炭水化物、脂質、ビタミン類、ミネラル類、栄養性添加物、甘味料、香料、色素、テクスチュア改善剤等が挙げられる。
本発明の発酵乳飲食品は、前記VPP、IPP、YP等の血圧降下作用を示すことが知られた特定のペプチドを含有するので、特定保健用食品等の機能性飲食品や、血圧降下作用のための効能を表示した機能性飲食品とすることもできる。
本発明の発酵乳飲食品を血圧降下作用のための効能を表示した機能性飲食品とする場合には、１回の摂取量は、含有される発酵乳換算量として、通常0.1ml／kg体重〜5.0ml／kg体重、特に0.3ml／kg体重〜0.6ml／kg体重であることが好ましい。
本発明の発酵乳飲食品を血圧降下作用のための効能を表示した機能性飲食品とする場合には、１回の摂取量は、含有される発酵乳換算量として、通常0.1ml／kg体重〜5.0ml／kg体重、特に0.3ml／kg体重〜0.6ml／kg体重であることが好ましい。
以下、本発明を実施例および比較例によりさらに具体的に説明するが、本発明の範囲はこれに限定されない。
実施例１〜３及び比較例１〜６
CM4を、100℃で達温殺菌した固形分9重量％の脱脂粉乳からなる乳培地にて37℃、20時間の前培養を行い、乳酸菌スターターを調製した。次に、新たに準備した同じく9重量％の脱脂粉乳30mlに、前記スターターを3重量％となるように添加し、更に、実施例１では、商品名パパインＦ(天野エンザイム社製、Carica papaya L.由来)を、実施例２では、商品名精製パパイン(ナガセ生化学社製、Carica papaya L.由来)を、実施例３では、商品名ブロメラインＦ(天野エンザイム社製、Ananas comosus M.由来)を、比較例１では、商品名プロテアーゼＰ(天野エンザイム社製、Aspergillus oryzae由来)を、比較例２では、商品名プロテアーゼＡ(天野エンザイム社製、Aspergillus oryzae由来)を、比較例３では、商品名ニューラーゼＦ３Ｇ(天野エンザイム社製、Rhizopus niveus由来)を、比較例４では、商品名ニュートラーゼ(ノボザイム社製、Bacillus amyloliquefaciens由来)を、比較例５では、商品名スミチームＦＰ(新日本化学工業社製、Aspergillus oryzae由来)を、それぞれ別に0.5mg添加した。また、比較例６として、プロテアーゼを添加しない乳酸菌スターターのみを添加した脱脂粉乳を用意した。次に、それぞれを32℃で24時間保持し、酵素分解及び乳酸菌発酵、若しくは乳酸菌発酵のみを行なって各発酵乳を調製した。
得られた各発酵乳を、10000gで１０分間遠心分離し、培養上清1ml中のVPP及びIPPペプチド量を、LC／MS(島津製作所製、型番LCMS2010A)で分析した。結果を表１に示す。
実施例１〜３及び比較例１〜６
CM4を、100℃で達温殺菌した固形分9重量％の脱脂粉乳からなる乳培地にて37℃、20時間の前培養を行い、乳酸菌スターターを調製した。次に、新たに準備した同じく9重量％の脱脂粉乳30mlに、前記スターターを3重量％となるように添加し、更に、実施例１では、商品名パパインＦ(天野エンザイム社製、Carica papaya L.由来)を、実施例２では、商品名精製パパイン(ナガセ生化学社製、Carica papaya L.由来)を、実施例３では、商品名ブロメラインＦ(天野エンザイム社製、Ananas comosus M.由来)を、比較例１では、商品名プロテアーゼＰ(天野エンザイム社製、Aspergillus oryzae由来)を、比較例２では、商品名プロテアーゼＡ(天野エンザイム社製、Aspergillus oryzae由来)を、比較例３では、商品名ニューラーゼＦ３Ｇ(天野エンザイム社製、Rhizopus niveus由来)を、比較例４では、商品名ニュートラーゼ(ノボザイム社製、Bacillus amyloliquefaciens由来)を、比較例５では、商品名スミチームＦＰ(新日本化学工業社製、Aspergillus oryzae由来)を、それぞれ別に0.5mg添加した。また、比較例６として、プロテアーゼを添加しない乳酸菌スターターのみを添加した脱脂粉乳を用意した。次に、それぞれを32℃で24時間保持し、酵素分解及び乳酸菌発酵、若しくは乳酸菌発酵のみを行なって各発酵乳を調製した。
得られた各発酵乳を、10000gで１０分間遠心分離し、培養上清1ml中のVPP及びIPPペプチド量を、LC／MS(島津製作所製、型番LCMS2010A)で分析した。結果を表１に示す。
比較例７〜９
100℃で達温殺菌した固形分8重量％の脱脂粉乳からなる乳培地30mlに、比較例７では、実施例１で用いた、商品名パパインＦ(天野エンザイム社製、Carica papaya L.由来)を、比較例８では、実施例２で用いた、商品名精製パパイン(ナガセ生化学社製、Carica papaya L.由来)を、比較例９では、実施例３で用いた、商品名ブロメラインＦ(天野エンザイム社製、Ananas comosus M.由来)をそれぞれ別に0.5mg添加した。次に、それぞれを32℃で24時間保持し、酵素分解を行なって各酵素分解物を調製した。得られた酵素分解物について、実施例１と同様にVPP及びIPPペプチド量の分析を行った。結果を表１に示す。
尚、比較例７〜９で得られた酵素分解物中における、Val Pro Pro又はIle Pro Pro配列を含むペプチドの存在を検出し、そのペプチド配列を分析したところ、実施例１及び２と同様なプロテアーゼを用いた比較例７及び８では、Val Pro Pro Phe Leu及びIle Pro Pro Leu Thrが検出され、実施例３と同様なプロテアーゼを用いた、比較例９では、Val Pro Pro Phe Leu Gln Pro Glu Val Met及びIle Pro Pro Leu Thrが検出された。
この結果より、実施例１〜３におけるプロテアーゼによる酵素分解では、Xaa Val Pro Pro (Xbb)n、Xaa Ile Pro Pro (Xbb)nで示されるペプチドのアミノ末端側のアミノ酸残基(Xaa)が切断され、実施例１〜３の乳酸菌発酵では、同ペプチドのカルボキシ末端側のアミノ酸残基((Xbb)n)が切断され、効率的にVal Pro Pro及びIle Pro Proが発酵乳中に産生されたものと推測できる。
100℃で達温殺菌した固形分8重量％の脱脂粉乳からなる乳培地30mlに、比較例７では、実施例１で用いた、商品名パパインＦ(天野エンザイム社製、Carica papaya L.由来)を、比較例８では、実施例２で用いた、商品名精製パパイン(ナガセ生化学社製、Carica papaya L.由来)を、比較例９では、実施例３で用いた、商品名ブロメラインＦ(天野エンザイム社製、Ananas comosus M.由来)をそれぞれ別に0.5mg添加した。次に、それぞれを32℃で24時間保持し、酵素分解を行なって各酵素分解物を調製した。得られた酵素分解物について、実施例１と同様にVPP及びIPPペプチド量の分析を行った。結果を表１に示す。
尚、比較例７〜９で得られた酵素分解物中における、Val Pro Pro又はIle Pro Pro配列を含むペプチドの存在を検出し、そのペプチド配列を分析したところ、実施例１及び２と同様なプロテアーゼを用いた比較例７及び８では、Val Pro Pro Phe Leu及びIle Pro Pro Leu Thrが検出され、実施例３と同様なプロテアーゼを用いた、比較例９では、Val Pro Pro Phe Leu Gln Pro Glu Val Met及びIle Pro Pro Leu Thrが検出された。
この結果より、実施例１〜３におけるプロテアーゼによる酵素分解では、Xaa Val Pro Pro (Xbb)n、Xaa Ile Pro Pro (Xbb)nで示されるペプチドのアミノ末端側のアミノ酸残基(Xaa)が切断され、実施例１〜３の乳酸菌発酵では、同ペプチドのカルボキシ末端側のアミノ酸残基((Xbb)n)が切断され、効率的にVal Pro Pro及びIle Pro Proが発酵乳中に産生されたものと推測できる。
表１より、CM４の乳酸菌のみによる比較例６の発酵乳では、VPP及びIPPの高生産性が確認された。これに対し、パパイン又はブロメラインを含む特定のプロテアーゼと組合せた実施例１〜３の発酵乳は、比較例１の1.7〜1.9倍のVPP及びIPPの産生が確認できた。
一方、本発明に用いる特定のプロテアーゼを含まない、プロテアーゼと組合せた比較例１〜５の発酵乳は、CM４株の乳酸菌のみによる比較例６の発酵乳よりも、極端にVPP及びIPPの産生量が少なかった。特に、獣乳カゼインからVPP及びIPPの生産活性があることが知られているAspergillus由来のプロテアーゼを用いた比較例１、２及び５の発酵乳においても、VPP及びIPPの産生量が極端に少なかった。更に、実施例１〜３で用いたプロテアーゼのみを用いた比較例７〜９の酵素分解物では、VPP及びIPPの産生が認められなかった。
従って、特定のプロテアーゼによる酵素分解と乳酸菌発酵とを組合せることにより、これらの併用による相乗効果が確認できた。
一方、本発明に用いる特定のプロテアーゼを含まない、プロテアーゼと組合せた比較例１〜５の発酵乳は、CM４株の乳酸菌のみによる比較例６の発酵乳よりも、極端にVPP及びIPPの産生量が少なかった。特に、獣乳カゼインからVPP及びIPPの生産活性があることが知られているAspergillus由来のプロテアーゼを用いた比較例１、２及び５の発酵乳においても、VPP及びIPPの産生量が極端に少なかった。更に、実施例１〜３で用いたプロテアーゼのみを用いた比較例７〜９の酵素分解物では、VPP及びIPPの産生が認められなかった。
従って、特定のプロテアーゼによる酵素分解と乳酸菌発酵とを組合せることにより、これらの併用による相乗効果が確認できた。
実施例４
プロテアーゼのブロメライン量を0.1mg、0.25mg及び1.0mgに代えた以外は、実施例３と同様に発酵乳を調製し、実施例３と同様にVPP及びIPPペプチド量の分析を行った。結果を図１に示す。尚、図１には、プロテアーゼのブロメライン量0.5mgの実施例３の結果と、プロテアーゼを添加しなかった比較例６の結果も示す。図１の各左側の棒がVPP含有量、各右側の棒がIPP含有量を示す。
ここで、発酵乳30mlに対して、ブロメラインを0.1、0.25、0.5及び1mg添加したということは、発酵乳中のカゼイン量に対して、プロテアーゼをそれぞれ0.008重量％、0.021重量％、0.042重量％及び0.084重量％添加したことになる。
図１より、ブロメライン未添加の時に比べて、添加時に両ペプチドの生産性が向上することが確認できる。特に、プロテアーゼ添加量が0.25〜1.0mgの範囲において、未添加の約1.5倍程度のVPP及びIPPペプチド生産性の増加が確認できた。
プロテアーゼのブロメライン量を0.1mg、0.25mg及び1.0mgに代えた以外は、実施例３と同様に発酵乳を調製し、実施例３と同様にVPP及びIPPペプチド量の分析を行った。結果を図１に示す。尚、図１には、プロテアーゼのブロメライン量0.5mgの実施例３の結果と、プロテアーゼを添加しなかった比較例６の結果も示す。図１の各左側の棒がVPP含有量、各右側の棒がIPP含有量を示す。
ここで、発酵乳30mlに対して、ブロメラインを0.1、0.25、0.5及び1mg添加したということは、発酵乳中のカゼイン量に対して、プロテアーゼをそれぞれ0.008重量％、0.021重量％、0.042重量％及び0.084重量％添加したことになる。
図１より、ブロメライン未添加の時に比べて、添加時に両ペプチドの生産性が向上することが確認できる。特に、プロテアーゼ添加量が0.25〜1.0mgの範囲において、未添加の約1.5倍程度のVPP及びIPPペプチド生産性の増加が確認できた。
実施例５及び比較例１０
CM4を、95℃で達温殺菌した固形分9重量％の脱脂粉乳からなる乳培地にて37℃、24時間の前培養を行い、乳酸菌スターターを調製した。次に、新たに準備した同じく固形分9重量％の脱脂粉乳からなる乳培地１リットルに、前記スターターを3重量％となるように添加し、更に、実施例５では商品名ブロメラインＦ(天野エンザイム社製、Ananas comosus M.由来)を10mg添加した。また、比較例１０として、プロテアーゼを添加しない乳酸菌スターターのみを添加した脱脂粉乳も用意した。次に、それぞれを32℃で20時間保持し、酵素分解及び乳酸菌発酵、若しくは乳酸菌発酵のみを行なって各発酵乳を調製した。
得られた各発酵乳に、安定剤及び香料を添加して、最終的に発酵乳含有割合が約60重量％及び30重量％を含む発酵乳飲料120gをそれぞれ調製した。得られた各発酵乳飲料中のVPP、IPP及びYP量を実施例１に準じて分析した。また、各発酵乳の酸度も測定した。結果を表２に示す。
CM4を、95℃で達温殺菌した固形分9重量％の脱脂粉乳からなる乳培地にて37℃、24時間の前培養を行い、乳酸菌スターターを調製した。次に、新たに準備した同じく固形分9重量％の脱脂粉乳からなる乳培地１リットルに、前記スターターを3重量％となるように添加し、更に、実施例５では商品名ブロメラインＦ(天野エンザイム社製、Ananas comosus M.由来)を10mg添加した。また、比較例１０として、プロテアーゼを添加しない乳酸菌スターターのみを添加した脱脂粉乳も用意した。次に、それぞれを32℃で20時間保持し、酵素分解及び乳酸菌発酵、若しくは乳酸菌発酵のみを行なって各発酵乳を調製した。
得られた各発酵乳に、安定剤及び香料を添加して、最終的に発酵乳含有割合が約60重量％及び30重量％を含む発酵乳飲料120gをそれぞれ調製した。得られた各発酵乳飲料中のVPP、IPP及びYP量を実施例１に準じて分析した。また、各発酵乳の酸度も測定した。結果を表２に示す。
表２より、CM４のみで乳酸菌発酵した比較例１０の発酵乳約60重量％配合による発酵乳飲料では、血圧降下作用を有するペプチドであるVPP及びIPPの合計量が31μg／mlであることから120g中には3.7mgの２種のトリペプチドを含んでいた。
一方、ブロメラインを添加して発酵した実施例５の発酵乳約60重量％配合による発酵乳飲料では、同様に計算した場合、120g中に8.4mgのトリペプチドを含んでいた。
また、比較例１０の発酵乳約30重量％配合による発酵乳飲料では、同様に計算した場合、120g中に1.9mgのトリペプチドが含まれていたのに対し、実施例５の発酵乳約30重量％配合による発酵乳飲料では、同様に計算した場合、120g中に4.3mgのトリペプチドが含まれていた。また、動物試験において血圧降下作用が確認されているYPの産生も確認された。
一方、ブロメラインを添加して発酵した実施例５の発酵乳約60重量％配合による発酵乳飲料では、同様に計算した場合、120g中に8.4mgのトリペプチドを含んでいた。
また、比較例１０の発酵乳約30重量％配合による発酵乳飲料では、同様に計算した場合、120g中に1.9mgのトリペプチドが含まれていたのに対し、実施例５の発酵乳約30重量％配合による発酵乳飲料では、同様に計算した場合、120g中に4.3mgのトリペプチドが含まれていた。また、動物試験において血圧降下作用が確認されているYPの産生も確認された。
ところで、VPP及びIPPの両ペプチドでのヒトに対する血圧降下作用を得るための１回投与の有効最小量は、VPP換算値＝VPP＋1.7×IPPとして3.4mg以上であることが知られているので、例えば、比較例１０の発酵乳約60重量％配合による発酵乳飲料を、血圧降下作用を表示した機能性食品とする場合には、120g製品とする必要がある。一方、実施例５の発酵乳約60重量％配合による発酵乳飲料では、60g程度であっても充分に前記有効最少量をクリアーでき、また、実施例５の発酵乳約30重量％配合による発酵乳飲料では、発酵乳含有量を比較例１０の約60重量％製品の半分にしても、120g製品で前記有効最少量をクリアーできる。また、実施例５及び比較例１０において調製した発酵乳自体の風味評価を行ったところ、プロテアーゼ添加と未添加で風味の大きな差異はなかった。
以上の結果より、本発明の製造方法により得られる発酵乳を用いた発酵乳飲料では、従来のCM4による発酵乳よりも少ない量の使用で血圧降下作用を表示した機能性食品を製造することができるので、最終製品製造における風味設計の配合上の制限幅が大きく拡大することで、風味上の品質の高い製品を製造することが可能になった。
以上の結果より、本発明の製造方法により得られる発酵乳を用いた発酵乳飲料では、従来のCM4による発酵乳よりも少ない量の使用で血圧降下作用を表示した機能性食品を製造することができるので、最終製品製造における風味設計の配合上の制限幅が大きく拡大することで、風味上の品質の高い製品を製造することが可能になった。
参考例１
前述の実施例１及び２、比較例7及び８で検出されたペプチド、Val Pro Pro Phe Leu及びIle Pro Pro Leu Thrからラクトバチルス・ヘルベティカスとは異なる乳酸菌種がVal Pro Pro及びIle Pro Proを生成しうるか否かを確認する目的で、乳酸菌培地に両ペンタペプチドを添加して培養したときのVal Pro ProとIle Pro Proの生成量を検討した。菌株はLactobacillus bulgaricus JCM1002株(独立行政法人 理化学研究所 バイオリソースセンター 微生物材料開発室 日本国埼玉県和光市広沢2-1)、Lactobacillus acidophilus JCM 1132株(同上)、Lactobacillus casei ssp. casei JCM1136株(同上)をそれぞれ用いた。
化学合成したIle Pro Pro Leu ThrとVal Pro Pro Phe Leuをそれぞれ10μg／mlとなるように乳酸菌用培地であるMRS培地に加えて、4日間37℃で菌と共に培養した後の上清画分のVal Pro ProとIle Pro Proの濃度をLC／MSにて測定した。結果を表３に示す。
前述の実施例１及び２、比較例7及び８で検出されたペプチド、Val Pro Pro Phe Leu及びIle Pro Pro Leu Thrからラクトバチルス・ヘルベティカスとは異なる乳酸菌種がVal Pro Pro及びIle Pro Proを生成しうるか否かを確認する目的で、乳酸菌培地に両ペンタペプチドを添加して培養したときのVal Pro ProとIle Pro Proの生成量を検討した。菌株はLactobacillus bulgaricus JCM1002株(独立行政法人 理化学研究所 バイオリソースセンター 微生物材料開発室 日本国埼玉県和光市広沢2-1)、Lactobacillus acidophilus JCM 1132株(同上)、Lactobacillus casei ssp. casei JCM1136株(同上)をそれぞれ用いた。
化学合成したIle Pro Pro Leu ThrとVal Pro Pro Phe Leuをそれぞれ10μg／mlとなるように乳酸菌用培地であるMRS培地に加えて、4日間37℃で菌と共に培養した後の上清画分のVal Pro ProとIle Pro Proの濃度をLC／MSにて測定した。結果を表３に示す。
参考例１の結果を鑑みると、全ての菌株において、Val Pro ProとIle Pro Proが生成していたため、Val Pro Pro Phe Leu及びIle Pro Pro Leu Thrをカゼインより生成するプロテアーゼと組み合わせた上記乳酸菌の発酵乳は、Val Pro Pro及びIle Pro Proを含んでいることが期待でき、使用する乳酸菌はラクトバチルス・ヘルベティカスに限らないことが判る。
Claims (9)
- パパイン、ブロメライン及びこれらと類似の酵素反応を示すスーパーファミリーに属するプロテアーゼの少なくとも１種を含むプロテアーゼ(1)により獣乳カゼインを酵素分解する工程(A)と、獣乳カゼイン及び／又は獣乳カゼインの前記プロテアーゼ(1)による酵素分解物を、乳酸菌発酵する工程(B)とを組合せ、Val Pro Pro、Ile Pro Pro及びTyr Proの少なくとも１種を生成させることを特徴とする発酵乳の製造方法。
- 前記プロテアーゼ(1)と乳酸菌との両方を含む培地で、獣乳カゼインを酵素分解及び乳酸菌発酵し、前記工程(A)及び(B)を行なう請求項１の製造方法。
- 前記プロテアーゼ(1)が、(Xaa)m Val Pro Pro (Xbb)n、(Xaa)m Ile Pro Pro (Xbb)n又は(Xaa)m Tyr Pro (Xbb)n(ここで、Xaa及びXbbは独立に任意のアミノ酸を示す。前記ペプチド配列の１つにおけるXaaは他のペプチド配列におけるXaaと同一若しくは異なっていても良く、前記ペプチド配列の１つにおけるXbbは他のペプチド配列におけるXbbと同一若しくは異なっていても良い。ｍ及びｎは整数であって、ｍが２以上の場合には、Xaaは同一若しくは異なっていても良い。またｎが２以上の場合には、Xbbは同一若しくは異なっていても良い)で示されるペプチドの少なくとも１つを(Xaa)mのカルボキシ末端を切断するプロテアーゼを含む請求項１の製造方法。
- 前記プロテアーゼ(1)が、パパインのサブファミリーに属するプロテアーゼを含む請求項１の製造方法。
- 前記プロテアーゼ(1)が、パイナップル抽出物及び／又はパパイア抽出物に含まれるプロテアーゼを含む請求項１の製造方法。
- 前記乳酸菌が、ラクトバチルス・ヘルベティカス、ラクトバチルス・アシドフィラス、ラクトバチルス・ブルガリクス、ラクトバチルス・カゼイの少なくとも１種である請求項１の製造方法。
- 前記工程(A)及び工程(B)における酵素分解及び乳酸菌発酵を、温度25〜45℃で実施する請求項１の製造方法。
- 前記獣乳カゼインとして、カゼイン濃度が3〜10重量％の獣乳を用い、前記プロテアーゼ(1)の添加量を、カゼイン量に対して0.005〜0.1重量％にする請求項１の製造方法。
- 請求項８記載の製造方法により得られた発酵乳又はその濃縮物を含む発酵乳飲食品であって、Val Pro Proを1.2mg／100ml以上、Ile Pro Proを1.0mg／100ml以上及びTyr Proを0.5mg／100ml以上含む発酵乳飲食品。
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