CN103300147A - 采用两步法制作具有血管紧张素转化酶抑制活性发酵乳的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种采用两步法制作具有血管紧张素转化酶抑制活性发酵乳的制作方法，该方法包括如下步骤：枯草芽孢杆菌和植物乳杆菌种子液的制备和扩大培养；发酵乳制备；枯草芽孢杆菌发酵；植物乳杆菌发酵。本发明先使用枯草芽孢杆菌对脱脂乳进行发酵，其产生的蛋白酶使脱脂乳中的蛋白质降解为氨基酸或多肽，这为植物乳杆菌的生长提供有利条件，从而提高其产生具有血管紧张素转化酶抑制活性多肽的产量和活性。

Description

采用两步法制作具有血管紧张素转化酶抑制活性发酵乳的方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种制备发酵乳的方法，具体涉及一种采用两步发酵法制作具有血管紧张素转化酶抑制活性发酵乳的方法。

背景技术

血管紧张素转换酶(Angiotensin Convening Enzyme，EC 3. 4. 15. 1 , ACE)是含有 Zn²⁺辅基的二肽酶。在人体内有两个平衡的系统来调节血压，分别是升压系统：肾素-血管紧张素系统(Rennin-Angiotensin system，RAS)和降压系统：激肽释放酶-激肽系统(kallikrein-kinin system，KKS)来参与血压调节。其中ACE是这两大系统中的重要组成成分，ACE具有调节血压功能，其主要作用是催化没有活性的血管紧张素I转化为血管紧张素II，血管紧张素Ⅱ是已知最强收缩血管的活性物质之一，它作用于血管平滑肌，使全身小动脉收缩，迅速引起升压效应。而在降压系统中舒缓激肽是降压物质，其前体物质是血浆蛋白的α-球蛋白中的舒缓激肽原，能在胰蛋白酶或蛇毒作用下分解，生成舒缓激肽，从而引起降血压作用。ACE在该系统中又作为肽激酶II，切除具有降压作用的舒缓激肽C末端的Phe-Arg或Ser-Pro，使之降解成为失活片断，引起血压升高。血管紧张素转换酶抑制剂正是通过抑制血管紧张素I和血管紧张素II之间转化，而且能阻止ACE降解降压物质——舒缓激肽，进而产生降血压作用。

肾素-血管紧张素系统和激肽释放酶-激肽系统在血压调节方面是一对相互协调、相互拮抗的体系，其对血压的协调平衡作用对维持正常血压发挥非常重要作用。诱发高血压因素颇多，但是RAS、KKS两系统之间的平衡失调是诱发高血压疾病的重要因素之一。ACE在这两个系统中发挥关键作用，ACE活性增强会使升压系统和降压系统平衡失调，使得血管紧张素Ⅱ生成量增多，体系中具有降血压作用的缓激肽和前列腺素合成量则减少，这些因素的共同作用促使血压升高。抑制ACE的活性对降血压起着积极作用，因此筛选高ACE抑制活性的乳酸菌和开发具有ACE抑制活性的乳制品有着广阔的市场前景与价值。

植物乳杆菌是乳酸杆菌的一种，属于乳杆菌科乳杆菌属，是革兰氏阳性的兼性厌氧菌。它常存在于发酵蔬菜和果汁中。植物乳杆菌作为人体胃肠道的正常益生菌群，具有维持肠道内菌群平衡、提高机体免疫力、促进营养物质吸收、抑制病原菌入侵、降血压及降低胆固醇等多种生理机能。枯草芽孢杆菌是芽孢杆菌属的一种，它在生长繁殖过程中能够产生多种酶，如蛋白酶、淀粉酶、葡聚糖酶、甘露聚糖酶、植酸酶等，这些酶能有效降解食物中或者是饲料中的蛋白质、淀粉等生成氨基酸和维生素等多种对机体有益的营养因子。2008年农业部将枯草芽孢杆菌归类为益生菌的一种。单纯的乳酸菌发酵脱脂乳，其水解酶活性相对较弱，而枯草芽孢杆菌能高产蛋白水解酶，能大量水解脱脂乳中的蛋白质生成多肽或者氨基酸，为乳酸菌利用这些小分子营养物质进行生长繁殖及有效转化生成各种营养素提供物质基础。

发明内容

本发明的目的在于利用枯草芽孢杆菌水解脱脂乳中的蛋白质生成多肽或者氨基酸，再利用植物乳杆菌产生血管紧张素转化酶抑制活性的短肽。

本发明采用两步法制作具有血管紧张素转化酶抑制活性发酵乳的方法是：采用高产蛋白酶的枯草芽孢杆菌与植物乳杆菌两步法发酵脱脂乳，枯包括草芽孢杆菌和植物乳杆菌种子液的制备和扩大培养；发酵乳制备；枯草芽孢杆菌发酵；植物乳杆菌发酵，具体步骤为：

步骤一，枯草芽孢杆菌和植物乳杆菌种子液的制备和扩大培养：

将保存的枯草芽孢杆菌菌株从-80℃中取出解冻后，取60 μL接种至5 mL灭菌营养肉汤培养基中，170 rpm，37℃振荡培养48 h，

将枯草芽孢杆菌培养48 h后，接种，取1.5 mL菌液接种至50 mL营养肉汤培养基中，170 rpm 37 ℃振荡培养48 h，

将保存的乳酸菌菌株从-80℃中取出解冻后，取30 μL接种至5 mL灭菌MRS肉汤培养基中，置于37℃恒温培养箱，静置培养48 h，

乳酸菌培养48 h后，接种，取1.0 mL菌液接种至50 mL灭菌MRS肉汤培养基中，37℃静置培养36 h；

步骤二，发酵乳的制备：

11g脱脂乳加入100mL蒸馏水溶解混匀，105℃高压灭菌20min，将灭菌好的脱脂乳冷却备用；

步骤三，枯草芽孢杆菌发酵：

将步骤一的枯草芽孢杆菌接种于步骤二的脱脂乳中，170 rpm，37℃振荡培养48h；

步骤四，植物乳杆菌发酵：

将步骤一的植物乳杆菌接种于步骤三的发酵脱脂乳中，170 rpm，37℃振荡培养48h。

所述的采用两步法制作具有血管紧张素转化酶抑制活性的发酵乳的方法，其特征在于，所述步骤一中枯草芽孢杆菌的接种量为3%。

所述的采用两步法制作具有血管紧张素转化酶抑制活性的发酵乳的方法，其特征在于，所述步骤一中植物乳杆菌的接种量为2%。

所述的采用两步法制作具有血管紧张素转化酶抑制活性的发酵乳的方法，其特征在于，所述步骤二中脱脂乳的浓度为11%。

所述的采用两步法制作具有血管紧张素转化酶抑制活性的发酵乳的方法，其特征在于，所述步骤三和步骤四的顺序为先加枯草芽孢杆菌，后加植物乳杆菌进行发酵。

所述的采用两步法制作具有血管紧张素转化酶抑制活性的发酵乳的方法，其特征在于，所述步骤三和步骤四为应用两种不同益生菌实施分步骤连续混合发酵。

本发明先使用枯草芽孢杆菌对脱脂乳进行发酵，其产生的蛋白酶将脱脂乳中的乳蛋白降解为氨基酸或多肽，这为植物乳杆菌生长繁殖提供有利条件，从而提高其产生具有血管紧张素转化酶抑制活性多肽的产量和活性。

具体实施方式

本发明采用高产蛋白酶的枯草芽孢杆菌与植物乳杆菌两步法发酵脱脂乳，枯包括草芽孢杆菌和植物乳杆菌种子液的制备和扩大培养；发酵乳制备；枯草芽孢杆菌发酵；植物乳杆菌发酵，具体步骤如下：

步骤一，枯草芽孢杆菌和植物乳杆菌种子液的制备和扩大培养。将保存的枯草芽孢杆菌菌株从-80℃中取出解冻后，取60 μL接种至5 mL灭菌营养肉汤培养基中，170 rpm，37℃振荡培养48 h。将枯草芽孢杆菌培养48 h后，按3%接种量，取1.5 mL菌液接种至50 mL营养肉汤培养基中，170 rpm 37 ℃振荡培养48 h。将保存的乳酸菌菌株从-80℃中取出解冻后，取30 μL接种至5 mL灭菌MRS肉汤培养基中，置于37℃恒温培养箱，静置培养48 h。乳酸菌培养48 h后，按2%接种量，取1.0 mL菌液接种至50 mL灭菌MRS肉汤培养基中，37℃静置培养36 h。

步骤二，发酵乳的制备。11g脱脂乳加入100mL蒸馏水溶解混匀，105℃高压灭菌20min。将灭菌好的脱脂乳冷却备用。

步骤三，枯草芽孢杆菌发酵。将步骤一的枯草芽孢杆菌接种于步骤二的脱脂乳中，170 rpm，37℃振荡培养48h。

步骤四，植物乳杆菌发酵。将步骤一的植物乳杆菌接种于步骤三的发酵脱脂乳中，170 rpm，37℃振荡培养48h。

实施例1

将保存的枯草芽孢杆菌菌株从-80℃中取出解冻后，取60 μL接种至5 mL灭菌营养肉汤培养基中，170 rpm，37℃振荡培养48 h。枯草芽孢杆菌种子液培养48 h后，按3%接种量，取1.5 mL菌液接种至50 mL灭菌营养肉汤培养基中，170 rpm，37℃振荡培养48 h。

将保存的乳酸菌菌株从-80℃中取出解冻后，取30 μL接种至5 mL灭菌MRS肉汤培养基中，置于37℃恒温培养箱，静置培养48 h。乳酸菌培养48 h后，按2%接种量，取1.0 mL菌液接种至50 mL灭菌MRS肉汤培养基中，37℃静置培养36 h。

配制11%脱脂乳，即将11g脱脂乳粉加入100 mL蒸馏水混匀，105℃高压灭菌20 min。将灭菌脱脂乳冷却备用。加入枯草芽孢杆菌置于恒温摇床，170 rpm，37℃振荡培养48 h。48 h后接种入植物乳杆菌，置于恒温培养箱中37℃培养。

第二步发酵48h后取出发酵的脱脂乳，离心，取上清备用。每个样取1 mL于灭菌的离心管中，离心取上清。用1 mol/L的NaOH调pH至8.3，然后再次离心取上清，用于ACE抑制活性的测定。每个样品重复3次。

ACE抑制率的测定如下：40 μL 10 mmol/L HHL 溶解于含0.4 mol/L NaCl 的 0.1 mol/L硼酸钠缓冲溶液（pH 8.3）。ACE也溶于上述缓冲液，配制成10 mU/mL。在1.5 mL 离心管中加40 μL HHL和20 μL 待测样品后充分震荡混匀，37℃孵育2 min 后加40 μL ACE溶液，充分震荡混匀，37℃反应30 min后85℃水浴加热10 min 使酶失活终止反应。

酶解反应中的反应产物马尿酸含量采用RP-HPLC法测定。色谱柱：ZORBAX C18（4.6×250 mm，5 μm，Agilent，USA）；流动相：体积比为20%乙腈（含0.1% TFA三氟乙酸）和80%去离子水（含0.1% TFA）；流速：1 mL/min；检测波长：228 nm；柱温：30℃；进样量：20 μL。配制5.00 mmol/L的马尿酸溶液,并依次稀释至0.10、0.20、0.30、0.40、0.50 mmol/L。以马尿酸的浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。

ACE 抑制活性由以下公式计算：

                                                                              

ACE 抑制率(%)=   ——————        ×100%

                          

式中：Cc—对照样品马尿酸浓度（加缓冲液）（对照）。

Cs—待测样品的马尿酸浓度（样品）。

Cb—HHL标准品中所含马尿酸浓度（空白）。

用高效液相色谱法测定的结果显示：两部发酵法得到的发酵乳ACE抑制率为95.8%，市售酸奶的ACE抑制率为64.3%。采用两步发酵法比用纯乳酸菌发酵得到的脱脂乳ACE抑制率高30%左右。

本发明发酵乳制作的方法是先使用枯草芽孢杆菌进行发酵后，再加入植物乳杆菌进行的两步发酵方法。      

Claims (6)

1.一种采用两步法制作具有血管紧张素转化酶抑制活性发酵乳的方法，其特征是：采用高产蛋白酶的枯草芽孢杆菌与植物乳杆菌两步法发酵脱脂乳，枯包括草芽孢杆菌和植物乳杆菌种子液的制备和扩大培养；发酵乳制备；枯草芽孢杆菌发酵；植物乳杆菌发酵，具体步骤为：

步骤一，枯草芽孢杆菌和植物乳杆菌种子液的制备和扩大培养：

将保存的枯草芽孢杆菌菌株从-80℃中取出解冻后，取60 μL接种至5 mL灭菌营养肉汤培养基中，170 rpm，37℃振荡培养48 h，

将枯草芽孢杆菌培养48 h后，接种，取1.5 mL菌液接种至50 mL营养肉汤培养基中，170 rpm 37 ℃振荡培养48 h，

将保存的乳酸菌菌株从-80℃中取出解冻后，取30 μL接种至5 mL灭菌MRS肉汤培养基中，置于37℃恒温培养箱，静置培养48 h，

乳酸菌培养48 h后，接种，取1.0 mL菌液接种至50 mL灭菌MRS肉汤培养基中，37℃静置培养36 h；

步骤二，发酵乳的制备：

11g脱脂乳加入100mL蒸馏水溶解混匀，105℃高压灭菌20min，将灭菌好的脱脂乳冷却备用；

步骤三，枯草芽孢杆菌发酵：

将步骤一的枯草芽孢杆菌接种于步骤二的脱脂乳中，170 rpm，37℃振荡培养48h；

步骤四，植物乳杆菌发酵：

将步骤一的植物乳杆菌接种于步骤三的发酵脱脂乳中，170 rpm，37℃振荡培养48h。

2.根据权利要求1所述的采用两步法制作具有血管紧张素转化酶抑制活性的发酵乳的方法，其特征在于，所述步骤一中枯草芽孢杆菌的接种量为3%。

3.根据权利要求1所述的采用两步法制作具有血管紧张素转化酶抑制活性的发酵乳的方法，其特征在于，所述步骤一中植物乳杆菌的接种量为2%。

4.根据权利要求1所述的采用两步法制作具有血管紧张素转化酶抑制活性的发酵乳的方法，其特征在于，所述步骤二中脱脂乳的浓度为11%。

5.根据权利要求1所述的采用两步法制作具有血管紧张素转化酶抑制活性的发酵乳的方法，其特征在于，所述步骤三和步骤四的顺序为先加枯草芽孢杆菌，后加植物乳杆菌进行发酵。

6.根据权利要求1所述的采用两步法制作具有血管紧张素转化酶抑制活性发酵乳的方法，其特征在于，所述步骤三和步骤四为两种不同细菌实施不同阶段的混合发酵。